在非透明支架上成像细胞活力——以一种新型编织钛植入物为例

本实验的总体目标是利用荧光成像技术，对不透明的编织钛核植入物的微观结构及细胞黏附情况进行可视化观察。该方法推动了非透明支架在组织工程分析中的应用。该技术的一个优势在于，可在明确的培养气液界面条件下，追踪细胞在支架上的存活率及增殖情况。

该方法的可视化演示至关重要，因为荧光染色以及后续的观察具有挑战性。单个支架的特性（例如孔径大小）可能影响操作时间，或者支架自身的荧光可能影响所用荧光染料的选择。将最多五个厚度为六至七毫米的支架放入50毫升离心管中，每次用清水洗涤20分钟，共洗涤三次。

在室温下轻轻振荡进行此操作。接着，在相同条件下，用 30 毫升 1% Triton X-100 溶液洗涤支架。然后，再用清水洗涤两次。

依次将支架在试剂级99%丙酮、99%异丙醇和99%乙醇中进行超声处理。每种溶剂中超声处理各重复两次，每次5分钟。随后将支架在水中再超声处理三次，累计共15分钟。

最后将支架置于无绒布纸上，在室温下过夜空气干燥。次日，在121摄氏度和15 PSI条件下对支架进行15分钟高压灭菌。为确认清洁效果，采用间接荧光法进行验证。

取2000微升新配制的硫-罗丹明B染色液加入12孔板的一个孔中，用镊子将支架转移至该孔内。然后使用配备RFP LED滤光片组的荧光显微镜拍摄支架的负像，并在高倍镜下检查是否存在杂质。在生物安全柜内，将洁净的支架转移至24孔板的孔中。

向每个孔中加入 500 微升 37 摄氏度的培养基，使支架浸泡 15 分钟。同时，每 1 毫升培养基中准备 500,000 个 Ad-GFP 感染的 SEP1 细胞。15 分钟后，彻底吸除支架中的培养基，并加入 100 微升细胞悬液接种细胞。

然后，在37摄氏度下孵育30分钟。短暂孵育后，再加入500微升培养基，并将支架继续孵育24小时。第二天，更换培养基以去除未贴壁的细胞。

然后，使用配备GFP LED立方滤光片的荧光显微镜评估细胞在支架上的黏附和铺展情况。进行活-死染色时，首先将SEP1细胞以先前方法接种于支架上。培养24至48小时后，在室温下用DPBS洗涤支架5分钟，并完全吸除培养基。

现在，使用含有Calcein AM、Hoechst 33342和碘化乙啶均聚物的培养基对细胞进行染色。这三种荧光染料均对光敏感，因此后续操作中必须将细胞避光保存。将细胞与荧光染料共同孵育30分钟，以确保荧光染料在支架内均匀分布。

特定的支架特性将影响此孵育时间。孵育结束后，使用每孔1 mL的DPBS洗涤细胞三次，每次洗涤在室温下进行五分钟。

洗涤后立即使用荧光显微镜记录支架材料。为随时间测量细胞活力，采用刃天青还原法进行检测。首先，完全吸除位于24孔板中的SEP1细胞的培养基，并用每孔500微升的DPBS洗涤细胞。

然后，加入所需体积的无菌刃天青工作液覆盖细胞，并设置一个仅含刃天青的孔作为对照。随后，将细胞在37摄氏度孵育约30分钟。孵育结束后，从每个孔中转移100微升培养后的上清液至96微孔板中，按照文中所述实验方案检测其荧光强度。

为进一步培养，从孔中移除刃天青，并用一毫升 DPBS 洗涤三次。每次洗涤在室温下进行五分钟。第三次洗涤后，向每孔细胞中加入 500 微升培养基，并继续孵育以进行后续的时间过程测量。

通过间接荧光染色法，记录了预清洁杂质的情况，以优化清洁方案。支架上物质负荷的显著减少表明了所述清洁方案的有效性。用于关节成形术治疗的连续植入物取决于细胞与材料界面处发生的事件。

在细胞与支架黏附24小时后，SEP1细胞已成功贴附。随后应用荧光染料，以在一段时间内检测支架上细胞的死亡与增殖情况。活-死染色结果显示，活细胞呈现绿色荧光，死细胞核呈红色荧光，细胞核整体呈蓝色染色。

此外，使用刃天青还原法检测支架上的细胞活力。在两周内，收集了与支架共培养或未共培养支架的细胞数据。在进行该操作时，需注意根据所使用的支架材料以及可用的显微镜设备，调整所用的荧光染料。

在完成该操作步骤后，可进一步应用其他方法，例如免疫荧光染色，以可视化蛋白质的存在或信号级联的激活情况。该技术的应用意义延伸至关节成形术的治疗领域，因为细胞在体内与周围组织的表面相互作用将决定其功能和耐久性。