Name: 非透明的支架成像细胞活性 - 使用新型针织钛种植体为例 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学习使用荧光成像技术对非透明针织钛种植体进行细胞粘附与活性可视化分析。该方法解决了不透明支架成像难题，为组织工程研究提供了可靠的细胞-材料相互作用评估方案。

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本项目部分由德国联邦经济与能源部中小企业中央创新计划（ZIM）资助——项目编号 KF3010902AJ4。出版费用由德国图宾根BG创伤医院承担。

注意：实验使用了永生化的人类间充质基质前体细胞（SCP-1 细胞）。SCP-1 细胞由 Matthias Schieker 教授提供12。
1. SCP-1 细胞的扩增
<ol>
	<li>在使用 SCP-1 细胞前，佩戴手套并用 70% 乙醇（v/v）彻底清洁工作区域（指定的生物安全柜 I）。</li>
	<li>在已清洁的生物安全柜中，按照 表 1 所示配制适量的细胞培养基。为保持基础培养基的无菌状态，需通过孔径为 0.22 µm 的无菌滤器添加补充成分。
	<ol>
		<li>为防止污染，应在使用前至少 24 小时配制培养基。为检测其无菌性，取 1 ml 培养基置于细胞培养板中（不接种细胞），在标准细胞培养孵育箱（37 °C、5% CO2、20% O2 和 90% 湿度）中孵育。24 小时后，使用至少 200 倍的放大倍数在显微镜下检查培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 SCP-1 细胞置于标准细胞培养孵育箱中，在支持性条件下（37 °C、5% CO2、20% O2 和 90% 湿度）进行培养。</li>
	<li>为维持和扩增细胞，将 SCP-1 细胞培养至融合度达到 80–90%。在此期间，每 2–3 天更换一次培养基。当细胞融合度达到 80–90% 时，按通常 1:2 的比例传代 SCP-1 细胞以进行扩增，或将细胞接种至实验所需的培养容器中（按实验要求进行）。</li>
	<li>为传代 SCP-1 细胞，将培养基在 37 °C 下预热，并使用 37 °C 水浴解冻胰蛋白酶/EDTA 溶液。</li>
	<li>将 80–90% 融合度的细胞中的培养基完全吸除，并弃入废液容器中。</li>
	<li>用 DPBS（不含镁和钙的杜氏磷酸盐缓冲液，pH 7.2）至少清洗细胞两次。
	<ol>
		<li>向细胞中加入适量体积的 DPBS（T75 培养瓶加 5 ml，T175 培养瓶加 12 ml）。</li>
		<li>小心吸除 DPBS 并弃入废液容器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向细胞中加入适量体积的 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液（T75 培养瓶加 1 ml，T175 培养瓶加 2 ml），并在标准细胞培养孵育箱（37 °C、5% CO2、20% O2 和 90% 湿度）中孵育 5–10 分钟。</li>
	<li>轻敲培养容器使细胞脱落，并在显微镜下观察悬浮细胞，确认所有细胞均已从培养器皿表面脱离（完成胰蛋白酶消化）。</li>
	<li>加入 10 ml 培养基以终止胰蛋白酶反应。通过反复吹打，轻轻混匀胰蛋白酶、细胞与培养基。</li>
	<li>将细胞悬液转移至离心管中，在室温下以 600 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 10 ml 培养基中。</li>
	<li>按照方案 2 所述的台盼蓝排斥法进行细胞计数。</li>
	<li>根据实验设计接种细胞。</li>
</ol>
2. SCP-1 细胞计数
<ol>
	<li>使用血细胞计数板，通过台盼蓝排斥法对重悬细胞进行活细胞计数。</li>
	<li>在细胞计数前，用自来水清洁血细胞计数板，并用无绒纸巾将计数板各部件擦干。将盖玻片润湿后，倒置压在计数区域两侧的两个玻璃导轨上，组装计数板。确保在玻璃导轨上可见牛顿环（图1）。</li>
	<li>取10 µl重悬细胞，与10 µl 0.1%台盼蓝溶液混合，得到2倍稀释因子。</li>
	<li>将10 µl混合样品加入已预先清洁并组装好的血细胞计数板腔室中。</li>
	<li>在4×4方格区域内计数活细胞（无色/透明细胞）和死细胞（蓝色细胞核）的数量（见图1B）。</li>
	<li>根据以下公式计算细胞总数： 
	<img alt="细胞浓度计算公式，方程，静态计算，教学，实验室方法。" src="/files/ftp_upload/54537/54537eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"></li>
</ol>
3. SCP-1 细胞的 GFP 转染
注意：为了观察 SCP-1 细胞在特定培养周期内在编织钛支架上的生长及向内侵入情况，我们用绿色荧光蛋白（GFP）对细胞进行标记。通过感染编码 GFP 的腺病毒颗粒实现 GFP 的过表达。使用复制缺陷型（-E1/-E3）编码绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒颗粒感染 SCP-1 细胞。病毒颗粒由 Steven Dooley 教授13提供，通过收集转染重组腺病毒（Ad5-GFP）的 HEK293T 细胞的培养上清获得（生物安全二级实验室）。经过三次反复冻融（-80 °C 冻结，37 °C 水浴融化）循环，确保无存活的 HEK293T 细胞残留以产生新的病毒颗粒。使用此腺病毒原液可高效感染 SCP-1 细胞，且不会产生新的病毒颗粒。因此，感染后的细胞可在生物安全一级实验室中操作。
<ol>
	<li>以 50,000 个细胞/ml 的接种密度，将靶细胞（SCP-1 细胞）重悬于培养基中。每孔加入 2 ml，接种至 6 孔组织培养板中。</li>
	<li>在标准细胞培养箱中 37 °C 条件下孵育；含 5% CO2、20% O2 和 90% 湿度，直至 SCP-1 细胞融合度达到 70–80%。 
	注意：细胞融合度取决于细胞的接种密度。在上述条件下，SCP-1 细胞通常在 1.5–2 天内达到 70–80% 的融合度。</li>
	<li>当细胞融合度达到 70–80% 时，不吸取原有培养基，直接向每 1 ml 培养基中加入 100 µl 腺病毒原液。
	<ol>
		<li>根据每批腺病毒原液中病毒颗粒的数量，单独确定其使用浓度范围。若感染效率过低，可使用多种市售试剂盒对病毒颗粒进行纯化和浓缩。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在标准细胞培养箱中 37 °C（5% CO2、20% O2 和 90% 湿度）条件下孵育 1 小时。</li>
	<li>移除含有病毒原液的培养基，并收集以待处理。每孔加入 2 ml 新鲜培养基，补充至 6 孔培养板中。
	<ol>
		<li>处理前务必对含有病毒颗粒的培养基进行高压灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染后 24 小时，使用配备 GFP LED 滤光片组的荧光显微镜观察细胞内 GFP 表达情况（即感染效率）。
	<ol>
		<li>观察细胞形态（图 2）。从培养皿上脱落的细胞可能导致假阳性结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 编织钛支架的清洗
<ol>
	<li>将最多5个支架放入一个50 ml的反应管中。</li>
	<li>用30 ml去离子蒸馏水在室温下清洗支架（厚度6-7 mm），共清洗三次，每次20分钟，采用旋转条件（8 × g）。</li>
	<li>将去离子蒸馏水替换为30 ml 1% (w/v) Triton-X-100溶液（溶于去离子蒸馏水），然后在室温下清洗支架一次，持续20分钟，采用旋转条件（8 × g）。</li>
	<li>弃去Triton-X-100溶液，随后用30 ml去离子蒸馏水清洗两次，每次5分钟，保持室温及旋转条件（8 × g）。</li>
	<li>更换去离子蒸馏水，随后在超声波浴中依次用试剂级99%丙酮、99%异丙醇和99%乙醇（各30 ml）各冲洗两次，每次5分钟（超声条件约为50 Hz，50 W，220–240 V）。</li>
	<li>继续用30 ml去离子蒸馏水清洗三次，每次5分钟，保持超声波浴处理条件不变。</li>
	<li>将支架置于无绒布纸上，于室温下过夜自然晾干。</li>
	<li>将支架在121 °C、15 psi条件下高压灭菌15分钟。</li>
	<li>通过间接荧光法验证清洗程序，具体操作见方案5。</li>
</ol>
5. 通过间接荧光成像支架结构
注意：本方案描述了使用荧光染料硫代罗丹明B通过间接荧光成像支架结构的方法，该染料在激发/发射波长为565/586 nm时可产生明亮的红色荧光。然而，可根据所用显微镜的设置或支架可能存在的自发荧光，更换其他更合适的荧光染料。
<ol>
	<li>将磺基罗丹明B染色液（0.04%）用1%乙酸配制，避光、室温保存。</li>
	<li>取一个24孔组织培养板，将清洗后的支架浸入其中 500 µl 使用镊子将磺酰罗丹明B染色液放入孔中。</li>
	<li>使用荧光显微镜拍摄支架的负染图像。
	<ol>
		<li>使用激发波长为531/40 nm、发射波长为593/40 nm的RFP LED立方体/滤光片组拍摄图像。或者，可借助荧光光谱查看器选择合适的激发和发射波长。20磺基罗丹明B的激发峰位于578 nm，发射峰位于593 nm。</li>
		<li>为了观察支架结构，在较低放大倍数下拍摄图像。 例如， 4X 或 10X（图3）。利用这些图片，确定特征， 例如， 借助 ImageJ 分析孔径大小和形状。</li>
		<li>为检测支架杂质，需在更高放大倍数下拍摄图像。 例如， 20X 或 40X，需注意这将限制分析深度。确保无污物颗粒/物质可见（参见代表性结果； 图3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 体外 生物相容性检测
<ol>
	<li>预热培养基于 37 °C 在水浴中。</li>
	<li>取一个24孔组织培养板，用镊子将清洗并灭菌后的支架无菌地放入每个测试孔中。操作需在预先清洁的生物安全柜I中进行。</li>
	<li>将支架浸入培养基中孵育约15分钟（500 µl 每24孔组织培养板的孔）以去除支架内部的空气。</li>
	<li>同时，将500,000个Ad-GFP感染的SCP1细胞重悬于1 ml培养基中。</li>
	<li>支架浸泡15 min后，彻底吸除支架上的培养基。</li>
	<li>将细胞接种到支架上时，分装 100 µl 将细胞悬液小心地滴加到支架表面（支架置于24孔板中）。接种细胞时，保持细胞悬液的最小体积，以确保培养基不会从支架中溢出。</li>
	<li>将细胞在30 min内孵育于 37 °C 在标准细胞培养箱（5% CO₂）中2，20% O₂2 和90%湿度）。</li>
	<li>添加 500 µl 补充更多培养基，并在标准细胞培养孵箱中孵育24小时（37 °C，5% CO2，20% O₂2 和90%湿度）。</li>
	<li>使用荧光显微镜评估细胞在支架表面的黏附模式和细胞铺展情况。
	<ol>
		<li>使用激发波长为470/22 nm、发射波长为510/42 nm的GFP LED滤光片组拍摄图像。或者，可借助荧光光谱查看工具选择合适的激发和发射波长。GFP的激发峰位于488 nm，发射峰位于507 nm。</li>
		<li>为了观察细胞黏附模式，需在较低放大倍数下拍摄图像， 例如， 4X 或 10X（图4为了观察细胞铺展，需要更高的放大倍数（至少100倍），这会限制焦深。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为进一步评估细胞在支架表面的铺展情况，使用4%甲醛固定细胞，并对细胞结构进行常规荧光染色。 例如， 肌动蛋白纤维（Phalloidin）。然而，应根据各自支架的特性调整孵育时间以及抗体的荧光标记条件， 例如， 扩散时间或自发荧光14.</li>
	<li>第二天，更换培养基以去除非贴壁细胞。</li>
	<li>根据方案7中所述的刃天青还原法测量，计算支架上黏附细胞的百分比。</li>
</ol>
<img alt="细胞培养实验流程图；含 SCP-1 细胞的支架、GFP 转染、刃天青检测。" src="/files/ftp_upload/54537/54537fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5：体外 检测时间线。 （A）细胞铺板的实验设置。（B）实验流程示意图，强调从第 0 天开始实验方案并验证细胞功能至第 7 天的重要性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54537/54537fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
7. 刃天青转化测定
注意：刃天青还原检测法用于测量线粒体活性，从而间接反映细胞增殖情况。刃天青被还原为试卤灵后产生荧光信号，该信号强度与活细胞数量相关的线粒体活性成正比（图7A）。
<ol>
	<li>完全吸除SCP-1细胞的培养基，并将其弃入废液容器中。</li>
	<li>用DPBS清洗SCP-1细胞一次，以去除脱落的细胞。向含有支架上SCP-1细胞的24孔细胞培养板的每孔中加入500 µl DPBS。</li>
	<li>用适量无菌的刃天青工作液（含0.25%刃天青的培养基）覆盖细胞，在标准细胞培养箱（5% CO2、20% O2 和90%湿度）中37 °C孵育30分钟。
	<ol>
		<li>请注意：孵育时间取决于细胞类型和细胞密度，可在10分钟至6小时之间变化。SCP-1细胞的优化孵育时间为30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>作为背景对照，至少设置一个不含细胞但含有刃天青工作液的孔，在标准细胞培养箱（5% CO2、20% O2 和90%湿度）中37 °C孵育相同时间。</li>
	<li>将24孔细胞培养板中每孔的100 µl条件培养基转移至96孔微孔板中。</li>
	<li>用1 ml DPBS在室温下洗涤剩余细胞三次，每次5分钟，以去除残留的刃天青工作液。第三次洗涤后，向含有SCP-1细胞的支架中加入培养基（每孔24孔细胞培养板加500 µl），并在标准细胞培养箱（5% CO2、20% O2 和90%湿度）中37 °C继续孵育，用于后续时间点的测量。
	<ol>
		<li>请确保在此步骤中设置重复孔（2–4个），以尽量减少移液误差。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>同时，将96孔微孔板放入酶标仪中，测定生成的试卤灵的荧光强度。
	<ol>
		<li>为降低背景信号，选择激发波长545 nm、发射波长585 nm进行荧光检测。</li>
		<li>也可借助荧光光谱查看器选择合适的激发和发射波长。试卤灵的最大激发波长为572 nm，最大发射波长为585 nm。所测信号强度为25次独立读数的平均值（每孔25次闪光）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用底部光学系统测定条件培养基中生成的试卤灵的荧光强度。
	<ol>
		<li>请注意，增益值取决于刃天青转化的平均量，可在10至4,000之间变化。通过加样试卤灵标准曲线，针对所使用的特定酶标仪调整增益值，使荧光信号低于最大可检测信号强度的80%（本例中为20,000）。SCP-1细胞的优化增益值为800。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从测试样品的信号中减去背景信号（不含细胞的刃天青工作液）。</li>
	<li>根据实验设计/目的，进行后续步骤：</li>
	<li>利用标准曲线计算支架上细胞的存活率。每种使用的细胞系应单独绘制各自的标准曲线。</li>
	<li>通过估算培养期间刃天青转化的相对增加量来分析细胞生长/增殖情况。计算时以第1天的刃天青转化量为基准。此类分析需新鲜配制刃天青工作液，且不同时间点的测量孵育时间必须保持一致。</li>
	<li>至少重复三次完整的刃天青转化测定实验流程，以获得一致的结果。</li>
</ol>
8. 活死染色
<ol>
	<li>将SCP1细胞以每支架50,000个细胞的接种密度接种于支架上，并在标准细胞培养条件下培养（参见方案1和2）。</li>
	<li>24–48 小时后，完全吸除 SCP-1 细胞中的培养基，并弃入废液容器中。</li>
	<li>用 DPBS 清洗 SCP-1 细胞一次，以去除脱落的细胞。添加 500 µl 每孔加入 DPBS，置于 24 孔组织培养板中，室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>使用荧光染料对 SCP-1 进行染色（三种染料同时染色）：
	<ol>
		<li>从现在开始，将支架置于避光环境中，以防止荧光染料受到日光照射而发生漂白！</li>
		<li>设定孵育时间为30分钟，以确保细胞在支架内均匀分布。若转移至其他支架，需根据各支架的特性（如孔径大小、支架深度）优化孵育时间。 等等。).</li>
		<li>为了检测支架上的活细胞，使用终浓度为 2 µM （在培养基中）</li>
		<li>为了检测支架上的所有细胞，使用终浓度为 0.002 µg/µl （在培养基中）</li>
		<li>为了检测死细胞，将支架与终浓度为 4 µM （在培养基中）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育结束后，在室温下用 DPBS 洗涤细胞 3 次，每次 1 ml/孔，每次洗涤 5 分钟。</li>
	<li>立即使用荧光显微镜拍照。
	<ol>
		<li>使用GFP LED滤光片组（激发波长470/22 nm，发射波长510/42 nm）拍摄钙黄绿素（活细胞）的荧光图像。也可借助荧光光谱查看器选择合适的激发和发射波长。钙黄绿素的最大激发波长为488 nm，最大发射波长为507 nm。注意：请勿对转染了GFP的细胞使用钙黄绿素或其他绿色荧光染料进行荧光染色。</li>
		<li>使用DAPI LED滤光片组（激发波长357/44 nm，发射波长447/60 nm）拍摄Hoechst 33342的荧光图像。或者，可借助荧光光谱查看工具选择合适的激发和发射波长。Hoechst 33342的最大激发波长为347 nm，最大发射波长为483 nm。</li>
		<li>使用RFP LED滤光片组（激发波长531/40 nm，发射波长593/40 nm）拍摄溴化乙锭同二聚体的荧光图像。或者，可借助荧光光谱查看器选择合适的激发和发射波长。溴化乙锭同二聚体的最大激发波长为530 nm，最大发射波长为618 nm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争利益。本工作的任何部分均未被或正在被考虑在其他地方发表，也未在其他地方发表过。

支架表面在其与周围组织的相互作用中起着重要作用 体内 从而确定植入物的功能耐久性。因此，通过以下方法研究支架的生物相容性： 体外 使用细胞（SCP1细胞系）在支架上接种后进行的检测。
对于薄且光学透明的支架具有良好效果的显微技术，却不适用于研究不透明支架的生物相容性。这主要是因为不透明支架会显著阻碍光线穿透并造成严重畸变15。为部分克服这些问题，本文建立了一种利用多种荧光染料对编织钛金属支架上的/内的细胞进行评估的方法。
为了实现钛丝的编织及后续折叠，材料会接触强腐蚀性和有毒物质（润滑剂、媒染剂、电抛光液），如果这些物质的残留物残留在支架内部或表面，可能会改变支架的生物相容性。借助所开发的间接荧光检测方案（方案5），我们能够可视化支架结构。此外，使用ImageJ分析了支架的特性，例如，材料厚度、单个孔径大小与形状，以及连接密度。更高倍数的落射荧光显微图像可用来观察支架内部及表面的杂质。图3b因此证实了所开发的清洗方案的...

慢性背痛是一种多因素疾病。自20世纪50年代以来，人们对退行性椎间盘疾病微创治疗方案的兴趣日益增长。迄今为止，脊柱多节段融合术仍是应用最广泛的治疗方法。然而，该方法常导致受累节段活动能力受限1,2，因此，椎间关节成形术的研究引起了广泛关注。全椎间盘置换和髓核置换技术的显著进展，已成为治疗慢性背痛的良好替代方案1。尽管取得了巨大进步，但这些方法尚未经过充分的临床评估。在纤维环保持完整的情况下，较柔韧的髓核假体被视为全椎间盘置换的一种有前景的替代选择3,4。然而，目前市场上现有的髓核假体常伴随多种并发症，如椎体形态改变、假体移位、椎间盘垂直高度丢失以及必要的机械刚性不足等问题5。为了克服现有技术的缺陷，一种由编织钛丝制成的新型髓核假体已成功研发6。由于其独特的编织结构，这种新型支架表现出优异的生物力学特性，例如，减震性能、孔径大小、承载能力和可靠性7。为评估该新型髓核假体的生物相容性，研究发现现有的（光学）分析技术因假体不透明的特性而受到严重限制。
为了测试生物相容性，细胞与金属之间的相互作用起着重要作用8-10。细胞与支架之间的相互作用对于稳定支架以及实现植入物在宿主系统内的良好整合至关重要。然而，不断加深的组织长入可能改变支架的力学性能。为了研究支架表面是否能够支持细胞的黏附、增殖和分化，或金属是否影响细胞活力，解决在非透明和不透光支架上成像细胞这一常见且广为人知的技术难题显得尤为重要。为克服这一局限，已探索了多种基于荧光的成像技术。目前市面上有大量荧光染料可供选择，可用于标记活细胞、细胞器，甚至特定的细胞状态11。本实验所用的荧光染料通过在线光谱查看工具进行筛选，以确保其与所使用的荧光显微镜最佳匹配。
分析贴壁细胞在不透明编织钛支架上/内的行为所采用的策略包括以下步骤：1）对骨软骨祖细胞进行荧光标记（绿色荧光蛋白/GFP），以实现对支架上细胞的追踪；2）检测细胞的活力（线粒体活性）；3）观察支架内部的细胞-细胞及细胞-材料相互作用。该方法的优势在于可轻松推广应用于其他贴壁细胞及其他不透明或不透光支架。此外，可在数天内连续监测细胞活力和长入模式，因此适用于支架材料或细胞数量有限的情况。
本研究展示了利用当前方案成功测定成骨软骨祖细胞在不透明编织钛支架上/内的细胞活力并可视化其长入模式。此外，所建立的方案还可用于确定支架中的杂质并验证清洗程序。

<table><tbody><tr><td>6/24/48 孔板，T25/T75 培养瓶</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>*</td><td></td></tr><tr><td>* 24 孔板</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>CELLSTAR 662 160</td><td></td></tr><tr><td>* 48 孔板</td><td>康宁公司 美国</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>* 6 孔板</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>* T25</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>690 175</td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>658 175</td><td></td></tr><tr><td>乙酸，purum &amp;ge; 99.0%</td><td>卡尔·罗特</td><td>3738.4</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>卡尔·罗特</td><td>5025.1</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan-2&amp;nbsp;</td><td>卡尔·蔡司，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>安全 2020</td><td></td></tr><tr><td>钙黄绿素乙酰氧基甲酯（calcein AM）</td><td>Sigma</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>Binder，德国图特林根</td><td>9040-0078</td><td></td></tr><tr><td>滤器单元（0.22 &amp;micro;m)</td><td>默克密理博，IRL</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>离心机 5810 R 和 5417 R</td><td>赛默飞世尔科技，纽约</td><td>Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>卡尔·罗斯</td><td>4720.2</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;不含 Ca 的 PBS &amp;和 Mg</td><td>Sigma</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 99%</td><td>&amp;nbsp;SAV 液体产品有限公司</td><td>475956</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶同二聚体</td><td>Sigma</td><td>46043</td><td></td></tr><tr><td>EVOS 荧光成像系统</td><td>Life technologies</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>美国宾夕法尼亚州豪斯尔科学公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533-100MG</td><td></td></tr><tr><td>编织钛核植入物</td><td>雄鹿 &amp;amp; KG，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含谷氨酰胺但不含核苷的 MEM α 改良培养基</td><td>Sigma</td><td>E15-832</td><td></td></tr><tr><td>Omega微孔板读板机</td><td>BMG Labtech，德国</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>刃天青钠盐</td><td>Sigma</td><td>199303-1G</td><td></td></tr><tr><td>磺酰罗丹明B钠盐</td><td>Sigma</td><td>S1402-1G</td><td></td></tr><tr><td>试管旋转仪</td><td>Labinco B.V.，荷兰</td><td>Model LD-76</td><td></td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷</td><td>卡尔·罗特</td><td>AE15.1</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>卡尔·罗斯</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 台盼蓝</td><td>卡尔·罗斯</td><td>CN76.1</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Sigma</td><td>L11-004</td><td></td></tr></tbody></table>

在非透明支架上成像细胞活力——以一种新型编织钛植入物为例

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

椎间盘退变和椎间盘突出是导致下腰痛的主要原因之一。细胞外基质的耗竭最终导致髓核（NP）突出，从而引起椎间盘结构破坏。目前可用的外科治疗方法虽可缓解疼痛，但无法恢复脊柱的力学功能。为了保留脊柱的力学特性，全椎间盘或髓核置换因此受到广泛关注。然而，这一关节成形术时代仍处于不成熟阶段，因为现有产品均未经过临床评估。
本研究旨在测试一种由编织钛丝制成的新型髓核植入物的生物相容性。尽管该材料在机械性能方面具有诸多优势，但由于所制备的植入物不透明，因而限制了其在常规光学分析中的应用。本文介绍了一种策略，用于描述 体外 支架上骨软骨祖细胞的可视化、追踪及活力检测。该方案可用于评估清洗方案的效率，同时研究此类及其他不透明支架的生物相容性。此外，该方案还可用于观察细胞在支架表面或内部的黏附模式，以及细胞的活力和增殖速率。 体外 生物相容性测试实验为分析细胞与不透明支架材料之间的相互作用提供了一种有效的工具。

初步结果显示，所述新型椎体植入物不仅具有良好的减震性能，而且与SCP-1细胞具有良好的生物相容性。在植入物的生产过程中，其会接触强腐蚀性和有毒物质（润滑剂、媒染剂、电抛光液）。借助间接荧光染色技术，我们能够可视化残留的杂质，从而优化清洗方案，显著降低支架上的物质残留量。图3展示了所建立清洗方案的效率。
用于关节成形术治疗的植入物的成功与否，取决于细胞-材料界面发生的事件。图4展示了按照第6节实验方案所述，在接种24小时后细胞在支架上的附着情况。我们观察到SCP-1细胞具有显著的转染效率，能够成像间充质基质前体细胞在支架上的生长模式（参见图2）。直接可视化观察证实了支架的生物相容性，同时也描绘了细胞在支架表面的附着模式（图4）。可进一步通过荧光染色来检测细胞与支架表面的相互作用及其在表面的铺展情况。
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本文介绍一种基于荧光染料的成像技术，用于检测不透明钛支架上的细胞活力，同时可初步观察支架中的杂质。该方案解决了在不透明支架上成像细胞-细胞或细胞-金属相互作用时存在的技术局限。

椎间盘退变和椎间盘突出是导致下腰痛的主要原因之一。细胞外基质的耗竭，最终导致……

本实验的总体目标是利用荧光成像技术，观察不透明编织钛核植入物的微观结构及其表面的细胞黏附情况。该方法推动了非透明支架在组织工程分析中的应用。该技术的一个优势在于，可在明确的培养气液界面条件下，追踪细胞在支架上的存活率及增殖情况。该方法的可视化演示至关重要，因为荧光染色以及后续的观察具有挑战性。单个支架的特性（例如孔径大小）可能影响操作时间，或者支架自身的荧光可能影响所用荧光染料的选择。将最多五个厚度为六至七毫米的支架放入50毫升离心管中，每次用清水洗涤20分钟，共洗涤三次。在室温下轻轻振荡进行此操作。接下来，在相同条件下，用 30 毫升 1% Triton X-100 溶液洗涤支架。然后，再用清水洗涤两次。依次将支架在试剂级99%丙酮、99%异丙醇和99%乙醇中进行超声处理。每种溶剂中超声处理各重复两次，每次5分钟。然后将支架在水中再超声处理三次，累计共15分钟。最后将支架置于无绒布纸上，在室温下晾置过夜使其自然干燥。次日，在121摄氏度、15 PSI条件下对支架进行15分钟高压灭菌。为验证清洁效果，采用间接荧光法进行检测。取2000微升新配制的硫-罗丹明B染色液加入12孔板的一个孔中，用镊子将支架转移至该孔内。然后使用配备RFP LED滤光片组的荧光显微镜拍摄支架的负像，并在高倍镜下检查是否存在杂质。在生物安全柜内，将洁净的支架转移至24孔板的孔中。向每个孔中加入 500 微升 37 摄氏度的培养基，使支架浸泡 15 分钟。同时，每 1 毫升培养基中准备 500,000 个 Ad-GFP 感染的 SEP1 细胞。15 分钟后，完全吸除支架中的培养基，并加入 100 微升细胞悬液接种细胞。然后，在37摄氏度下孵育30分钟。短暂孵育后，再加入500微升培养基，并将支架继续孵育24小时。次日更换培养基以去除未贴壁的细胞。然后，使用配备 GFP LED 立方滤光片的荧光显微镜评估细胞在支架上的黏附和铺展情况。进行活死染色时，首先将 SEP1 细胞以与之前相同的方式接种于支架上。培养 24 至 48 小时后，在室温下用 DPBS 洗涤支架 5 分钟，并完全吸除培养基。现在，使用含有Calcein AM、Hoechst 33342和碘化乙啶同型二聚体（Ethidium homodimer）的培养基对细胞进行染色。这三种荧光染料均对光敏感，因此后续操作中必须将细胞避光保存。将细胞与荧光染料共同孵育30分钟，以确保染料在支架内均匀分布。特定支架特性将影响该孵育时间。孵育结束后，使用1毫升每孔的DPBS洗涤细胞三次，每次洗涤在室温下进行五分钟。洗涤后立即使用荧光显微镜记录支架材料。为随时间测量细胞活力，采用刃天青还原法进行检测。首先，完全吸除位于24孔板中的SEP1细胞的培养基，并用每孔500 µL的DPBS洗涤细胞。然后，加入所需体积的无菌刃天青工作液覆盖细胞，并设置一个仅含刃天青的对照孔。随后，将细胞在37摄氏度孵育约30分钟。孵育结束后，从每个孔中转移100微升培养后的上清液至96微孔板中，按照文中实验方案所述方法检测其荧光强度。为进一步培养，从孔中移除刃天青，并用一毫升 DPBS 洗涤三次。每次洗涤在室温下进行五分钟。第三次洗涤后，向每孔细胞中加入 500 微升培养基，继续孵育以进行后续的时间过程测量。通过间接荧光染色法，记录了预清洁杂质的情况，以优化清洁方案。支架上物质负荷的显著减少表明了所述清洁方案的有效性。用于关节成形术治疗的连续植入物取决于细胞与材料界面处发生的事件。在与支架共培养24小时后，SEP1细胞已成功贴附。随后应用荧光染料，以在一段时间内检测支架上细胞的死亡与增殖情况。活-死染色结果显示，活细胞呈现绿色荧光，死细胞核呈红色荧光，所有细胞核均被染成蓝色。此外，使用刃天青转化实验对支架上的细胞活力进行了定量分析。在两周内，收集了在有或无支架条件下培养的细胞数据。在进行该操作时，重要的是要记住根据所使用的支架和可用的显微镜调整相应的荧光染料。在完成此操作后，可应用其他方法，例如免疫荧光染色，以可视化蛋白质的存在或信号级联的激活。该技术的应用意义延伸至关节成形术的治疗领域，因为细胞在体内与周围组织的表面相互作用将决定其功能和耐久性。

imaging-cell-viability-on-non-transparent-scaffolds-using-example

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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