非透明的支架成像细胞活性 - 使用新型针织钛种植体为例

本实验的总体目标是使用荧光成像技术可视化非透明针织钛核植入物的微观结构和细胞粘附。该方法推进了使用不透明支架的组织工程分析。该技术的一个优点是，可以使用确定的培养 ped-air 来追踪细胞活力以及支架上的增殖。

这种方法的视觉演示至关重要，因为荧光染色和随后的可视化具有挑战性。单个支架特性（如孔径）可能会影响时间，和/或支架的荧光可能会影响您使用的荧光基团的选择。将最多 5 个 6 或 7 毫米厚的支架放入 50 毫升的试管中，然后用水清洗 3 次，每次清洗 20 分钟。

在室温下轻轻搅拌。接下来，在相同条件下用 30 毫升 1% Triton X-100 溶液清洗支架。然后，再进行两次水洗。

现在，在试剂级 99% 丙酮、99% 异丙醇和 99% 乙醇中依次对支架进行超声处理。执行每个超声处理步骤两次，每次超声处理 5 分钟。然后，在水中再对支架进行 3 次超声处理，总共 15 分钟。

最后将支架放在无绒纸巾上，并在室温下风干过夜。第二天，在 121 摄氏度和 15 PSI 的压力下将支架高压灭菌 15 分钟。要确认清洁有效，请使用间接荧光。

在 12 孔板的一个孔中加入 2000 微升新鲜制备的硫-罗丹明 B 染色溶液，并使用镊子将支架转移到该孔中。然后，使用配备 RFP LED 立方体滤光片组的荧光显微镜捕获支架的负图像，并在高放大倍率下寻找杂质。使用生物安全柜 1，将干净的支架转移到 24 孔板的孔中。

向每个孔中加入 500 微升 37 摄氏度的培养基，让支架浸泡 15 分钟。同时，每 1 毫升培养基制备 500， 000 个 Ad-GFP 感染的 SEP1 细胞。15 分钟后，从支架中完全吸出培养基，并用 100 μL 细胞悬液固定。

然后，将它们在 30 摄氏度下孵育 37 分钟。短暂孵育后，再加入 500 微升培养基，并将支架孵育 24 小时。第二天，更换培养基以去除非贴壁细胞。

然后，使用配备 GFP LED 立方体滤光片组的荧光显微镜评估细胞在支架上的粘附和扩散。对于活死染色，首先像以前一样将 SEP1 细胞接种在支架上。24 至 48 小时后，完全吸出培养基，并在室温下用 DPBS 洗涤支架 5 分钟。

现在，使用含有钙黄绿素 AM、Hoechst 33342 和 Ethidium 同型二聚体的培养基对细胞进行染色。这三种荧光团都是对光敏感的，因此将细胞保持在黑暗中至关重要。将细胞与荧光基团一起孵育 30 分钟，以在整个支架中均匀分布。

特定的支架特性将影响此孵育时间。孵育后，用 DPBS 洗涤细胞 3 次，每孔 1 毫升。在室温下执行每次洗涤 5 分钟。

洗涤后，立即使用荧光显微镜记录支架。要测量细胞活力随时间的变化，请使用刃天青转化率测量。首先，从位于 24 孔板中的 SEP1 细胞中完全吸出培养基，并用每孔 500 μL DPBS 洗涤细胞。

然后，用所需体积的无菌刃天青工作溶液覆盖细胞，并包括一个仅含有刃天青的孔。然后，将细胞在 37 摄氏度下孵育约 30 分钟。孵育后，将 100 微升条件上清液从每个孔转移到 96 微孔板中，以按照文本方案中的说明测量其荧光。

为了进一步培养，从孔中取出刃天青，并用 1 毫升 DPBS 洗涤 3 次。在室温下每次洗涤 5 分钟。第三次洗涤后，向每个细胞孔中加入 500 μL 培养基，并继续孵育以进行进一步的时程测量。

使用间接荧光染色，记录预清洁杂质以优化清洁方案。脚手架上物质负荷的显着减少表明了所描述的清洁方案的效率。用于关节置换术治疗的连续植入物由细胞材料界面处发生的事件决定。

与支架贴壁 24 小时后，SEP1 细胞已附着。然后应用荧光基团检查支架上一段时间内的细胞死亡和增殖。活死细胞染色显示蓝色细胞核染色，死细胞中带有红色荧光，活细胞中带有绿色荧光。

此外，使用刃天青转化测定法定量支架上的细胞活力。在两周内，收集了使用或不使用支架培养的细胞的数据。在尝试此过程时，请务必记住根据您可用的支架和显微镜调整您正在使用的荧光团。

按照此程序，可以应用其他方法，如免疫荧光染色，以可视化蛋白质的存在或信号级联反应的激活。该技术的含义延伸到关节置换术的治疗，因为细胞表面与体内周围组织的相互作用将决定其功能和耐用性。