的分离，分化和人类的定量分泌抗体的B细胞从血液:酶联免疫斑点作为体液免疫的功能读出

这种 ELISpot 方法的总体目标是允许从血液中定量分泌人抗体的 B 细胞。这种方法可以帮助回答生物医学领域关于 B 细胞免疫学和疫苗研究的关键问题。该技术的主要优点是它允许在单细胞水平检测和测量分泌抗体的 B 细胞。

演示该程序的是我实验室的研究生 Tsung-Chih Tseng。从肘正中静脉获取 10 ml 血样放入含有补钾 EDTA 的 15 ml 试管中后，立即将试管倒置数次以防止凝块形成。然后向细胞中加入 35 ml 高压灭菌的红细胞裂解缓冲液，在室温下孵育 5 分钟。

当可以通过试管观察到光线时，离心血液并确认存在白色颗粒。用 10 ml 高压灭菌的 PBS 去除残留的裂解缓冲液，并将沉淀重悬于 10 ml RPMI 1640 培养基中。将细胞接种在 10 cm 培养皿中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 30 分钟。

然后轻轻旋转培养皿几次，将漂浮的细胞转移到 15 ml 塑料锥形管中。离心洗涤两次后，在 200 微升冷 PBS 缓冲液中以每毫升浓度 6 个细胞的十分之五至 10 倍重悬沉淀，并每增加 5 微升对血细胞具有特异性的生物素化抗人抗体混合物第六个细胞的十分之一。在冰上孵育 30 分钟后，用 10 倍过量体积的无菌 PBS 洗涤细胞，然后将沉淀重悬于 5 微升链霉亲和素偶联微珠中，每 6 个细胞的十分之一倍，在冰上孵育 30 分钟。

孵育结束时，向细胞中加入 2 ml PBS 缓冲液，并将试管置于磁力架上，在室温下放置 8 分钟。当微珠附着在管壁上时，小心地将上清液转移到新的锥形管中，并向细胞中再加入 2 ml PBS 缓冲液。第二次上清液收集后，通过离心收集合并的细胞，并以每 ml 浓度 7 个细胞的十分之一将细胞转移到 5 ml 聚苯乙烯管和新鲜 PBS 缓冲液中。

进行非特异性封闭后，将 6 个细胞的每 1 倍十分之一的每种选择抗体加入试管中，轻轻混合，在冰上孵育 30 分钟。在孵育的最后 5 分钟内，向细胞中加入 5 微升 7-AAD。然后向细胞中加入 2 毫升新鲜 PBS 并在离心前涡旋。

沉淀重悬于新鲜分选缓冲液中，浓度为每毫升 7 个细胞的十分之一至 5 倍，并通过 40 微米细胞过滤器将细胞过滤到新的 5 毫升聚苯乙烯管中。然后通过流式细胞术将细胞分选到三个 15 ml 管中，其中含有 5 ml 新鲜 RPI 培养基，以收集初始 B 细胞、记忆 B 细胞和浆母细胞浆细胞。收获所有细胞后，在新鲜 RPMI 培养基中，以每毫升浓度第五细胞的 1 到 10 倍将亚群接种到 12 孔细胞培养板的各个孔中。

接下来，在细胞培养箱中，每孔用 5 微克 CPG ODN 2006 激活 B 细胞，每 1 倍/毫升/毫升的第六个细胞的十分之一，持续 5 天。活化结束时，向 ELISpot 板的每个孔中加入 30 微升 35% 乙醇和蒸馏水，持续 30 秒。然后用 150 微升高压灭菌的双蒸水替换每个孔中的乙醇，并在室温下孵育板 5 分钟以去除残留的乙醇。

进行 PBS 洗涤，然后向每个孔中加入 50 μL 抗人 IG 的多克隆 FAB2 片段。如刚才所示，用 PBS 洗涤板两次。用 200 μL 含 BSA 的新鲜 PBS 在室温下封闭每个孔中的非特异性结合 2 小时。

在另一个 PBS 洗涤系列之后，将孔在 100 微升新鲜 RPMI 1640 培养基中于 37 摄氏度孵育。然后用适当数量的活化 B 细胞替换每个 ELISpot 孔中的培养基。用新鲜的 RPMI 培养基将每个孔的最终体积调至 150 μL，然后将 ELISpot 板放回细胞培养箱中 8 至 14 小时。

在孵育期结束时，丢弃培养基，用 200 微升 PBS 加 tween20 洗涤孔，洗涤 5 次，每次 3 分钟。最后一次洗涤后，将适当的检测抗体添加到相应的孔中，并在黑暗中孵育板 2 小时。在另一个 PBS 洗涤系列之后，向每个孔中加入 50 μL BCIPMBT 底物，在室温下放置 5 至 15 分钟。

当出现紫色斑点时，用每孔 100 微升双蒸水终止反应，然后用流动的自来水冲洗板。然后风干避光的 ELISpot 膜。在该供体 PBMC 样本中，经过红细胞裂解和贴壁细胞耗竭后，约 10% 的淋巴细胞是 CD19 阳性 B 细胞。

在 B 细胞区室中，大约 50% 的细胞是 CD27 阴性幼稚 B 细胞，50% 是表达 CD27 的记忆 B 细胞。如刚才所示，对纯化的人 B 细胞和 CD19+CD27+进行 CPG 处理 5 天通常会导致产生 50 至 200 个 IgM 和 10 至 50 个 IgG 抗体分泌细胞，从 1 乘以 10 到 4 个活化的 B 细胞。一旦掌握，如果执行得当，这种 ELISpot 技术可以在三个小时内完成。

在开始此过程之前，重要的是要记住使用适当的捕获试剂对位置进行编码，以检测抗体分泌细胞。开发后，这项技术为疫苗学领域的研究人员在大规模试验和纵向随访中探索疫苗功效铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何从血液中纯化人类 B 细胞有很好的了解。

分离幼稚 B 细胞和记忆 B 细胞进行分化，并进行 ELISpot 论文以鉴定抗体分泌细胞。不要忘记，处理人体血液可能很危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套。