Name: 的分离，分化和人类的定量分泌抗体的B细胞从血液:酶联免疫斑点作为体液免疫的功能读出 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 了解使用ELISpot技术从人外周血中分离、分化并定量检测抗体分泌B细胞的完整实验流程。该方法可在单细胞水平精确测量IgM和IgG抗体分泌细胞，为疫苗研发及体液免疫研究提供关键功能读数。

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本研究得到了中国台湾行政院科技部研究经费（NSC99-2320-B-002-011）的支持。谨此感谢台湾大学医学院第一核心实验室流式细胞术分析与分选核心提供的优质服务。

必须在知情同意的前提下从健康供者获取人外周血，且血液样本的使用须符合各机构审查委员会批准的指导原则。本研究中使用人血样本进行流式细胞术结果（图1）和ELISpot实验（图3）演示的方案，已获得中国台湾大学医院机构审查委员会的批准（方案编号：201307019RINB）。
1. 人外周血B细胞的分离与纯化
<ol>
	<li>使用含K2EDTA（1.5至2.0 mg/mL血液）的15 mL离心管，从肘前窝的肘正中静脉抽取约10 mL血液，并立即反复倒置离心管数次，以防止凝血。</li>
	<li>向装有新鲜血液样本的离心管中加入35 mL经高压灭菌（121 °C，15分钟）的红细胞（RBC）裂解缓冲液（150 mM NH4Cl、10 mM KHCO3和1 mM EDTA；pH 7.4）（体积比≥3:1），并在室温（RT）孵育不超过5分钟。 
	注意：当可见光线透过管壁时，表明红细胞裂解已完成。</li>
	<li>在室温下以600 × g离心5分钟。确保沉淀呈白色。</li>
	<li>用10 mL高压灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS，137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4和1.47 mM KH2PO4；pH 7.4）重悬沉淀，然后按步骤1.3进行离心。</li>
	<li>弃去上清液，用10 mL RPMI 1640培养基（添加物：10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B和2 mM L-谷氨酰胺）重悬沉淀，随后将细胞接种至10 cm培养皿中（每皿10 mL血液）。将培养皿置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育30分钟。</li>
	<li>轻轻摇晃培养皿数次，将培养基（悬浮细胞）转移至15 mL塑料锥形离心管中。弃去培养皿上贴壁的细胞（主要为巨噬细胞）。</li>
	<li>在室温下以600 × g离心5分钟。弃去上清液。</li>
	<li>用1 mL RPMI 1640培养基重悬沉淀，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞数量。 
	注意：通过台盼蓝排斥法检测，分离得到的白细胞活力通常高于90%。</li>
	<li>按步骤1.7进行离心，然后用约200 µL冷PBS缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA）重悬细胞，细胞浓度为5 - 10 × 106 个/mL。</li>
	<li>每106个细胞加入5 µL针对人血细胞的生物素化抗体混合物（用于B细胞的阴性筛选），冰上孵育30分钟21。 
	注意：抗人抗体混合物应至少包含针对CD2（或CD3）、CD14和CD16的特异性抗体。</li>
	<li>向细胞中加入10倍体积的无菌PBS，以600 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向沉淀中加入等量的链霉亲和素偶联磁珠（每106个细胞加5 µL），充分混匀。</li>
	<li>在15 mL塑料锥形离心管中冰上孵育30分钟。</li>
	<li>向离心管中加入2 mL PBS缓冲液。</li>
	<li>将离心管放入磁力架中，室温孵育8分钟。棕色磁珠将逐渐附着在靠近磁铁一侧的管壁上22。</li>
	<li>保持离心管置于磁力架中，小心地将上清液转移至新的无菌15 mL离心管中22。</li>
	<li>重复步骤1.14至1.16，并合并两次所得的上清液（其中含有未接触的B细胞）。弃去磁珠。</li>
	<li>在室温下以600 × g离心5分钟。弃去上清液。</li>
	<li>用RPMI 1640培养基重悬沉淀，用于后续实验。 
	&#8203;注意：通常可从10 mL外周血中分离得到1 - 5 × 105个B细胞，纯度高于95%23。</li>
</ol>
2. 从分离的B细胞中纯化与分离记忆B细胞和初始B细胞
<ol>
	<li>使用步骤1中纯化的细胞，通过血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞数量。</li>
	<li>离心后（600 × g，室温，5 分钟），用 100 µL 冷 PBS 缓冲液重悬细胞。</li>
	<li>每10加入1 - 2 µg生物素标记的CD27单克隆抗体6 细胞并在冰上孵育30分钟。</li>
	<li>向离心管中加入10 mL PBS缓冲液，600 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于50 µL PBS缓冲液中。</li>
	<li>加入等量的链霉亲和素磁珠（1 - 2 µg/106 细胞）转移至15 mL塑料锥形管中的细胞内。</li>
	<li>轻轻混匀，冰上孵育30分钟。</li>
	<li>向试管中加入 2 - 3 mL PBS 缓冲液。</li>
	<li>将试管放入磁力架中，室温孵育8分钟，使棕色微珠吸附在靠近磁铁的一侧。</li>
	<li>将试管置于磁力架上，小心地将上清液转移至新的无菌试管中。该上清液含有富集的 CD27- 初始B细胞</li>
	<li>向含有微珠的离心管中加入5 mL溶液，轻轻重悬微珠（即， CD27富集组分+ 记忆B细胞24-25.</li>
	<li>在室温下以 600 × g 离心 5 分钟。用 RPMI 1640 培养基重悬沉淀，用于后续实验。 
	&#8203;注意：通常可将约 30 - 60% 的 B 细胞纯化为 CD27+ 健康供体外周血单个核细胞中的记忆细胞7, 25-26.</li>
</ol>
3. 初始B细胞、记忆B细胞和浆母细胞/浆细胞的分选收集
<ol>
	<li>使用步骤1中纯化的细胞，通过血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞数量。</li>
	<li>将细胞重悬于冰冷的PBS缓冲液中，浓度为每毫升107个细胞，置于5 mL聚苯乙烯管中。</li>
	<li>每106个细胞加入1–2 µg人IgG，冰上孵育10分钟，以进行Fc受体封闭。</li>
	<li>每106个细胞分别加入抗-CD19-APC（克隆号：HIB19）、抗-CD27-eFluor450（克隆号：O323）和抗-CD38-PE（克隆号：HIT2）各1 µg；充分混匀后冰上孵育30分钟4, 27。</li>
	<li>在步骤3.4的最后5分钟内，每管加入5 µL商用7-氨基放线菌素D（7-AAD）。</li>
	<li>向管中加入2 mL PBS，涡旋混匀后以600 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于分选缓冲液（含2% BSA和2 mM EDTA的无菌PBS）中，浓度为每毫升1–5 × 107个细胞，置于15 mL管中。</li>
	<li>通过尼龙网细胞滤器（孔径40 µm）过滤细胞，以去除细胞团块。</li>
	<li>使用配备三种激光器（紫色405 nm、蓝色488 nm和红色640 nm）的流式细胞分选仪对细胞进行分选。 
	注：仅使用蓝色激光器即可满足三色流式细胞术检测需求27–28。</li>
	<li>将细胞分选至三个15 mL管中（每管含5 mL RPMI培养基），同时收集初始B细胞（CD19+CD27−）、记忆B细胞（CD19+CD27+）和浆母细胞/浆细胞（PBs/PCs，CD19+CD27+/hiCD38+）3–4, 28。 
	&#8203;注：分选后的初始B细胞和记忆B细胞可按照步骤4所述进行培养。</li>
</ol>
4. 体外 分离人CD19细胞的分化+ B细胞，CD19+CD27+ 记忆B细胞和CD19+CD27- 初始B细胞
<ol>
	<li>使用步骤 1.19、2.10、2.11 和 3.10 中纯化的细胞，用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞数量。</li>
	<li>用 RPMI 1640 培养基将细胞重悬至浓度为 1 - 10 x 105 个/mL，并分装至 12 孔板的各孔中。</li>
	<li>每 106 个细胞/mL 加入 5 µg CpG（ODN 2006）18, 29。</li>
	<li>将细胞置于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中培养 5 天。</li>
	<li>从每个孔中收集细胞，分别放入 15 mL 离心管中，每管加入 5 mL PBS，于室温下以 600 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，然后用 RPMI 1640 培养基将细胞重悬至浓度为 1 - 10 x 105 个/mL。</li>
</ol>
5. ELISpot 实验
<ol>
	<li>向 ELISpot 板的每个孔中加入 30 µL 35% 乙醇（溶于蒸馏水），作用 30 秒。 
	注意：移液时，务必始终避免接触孔内的膜。</li>
	<li>将 ELISpot 板倒置以去除乙醇。</li>
	<li>向每个孔中加入 150 µL 经高压灭菌的 ddH2O，在室温下孵育 5 分钟以冲洗残留乙醇；随后用无菌 PBS 在室温下洗涤 3 分钟。 
	注意：步骤 5.1 至 5.3 可能是可选步骤，具体取决于板的制造厂家。</li>
	<li>向 ELISpot 板的每个孔中加入 50 µL 浓度为 5 µg/mL 的抗人 Ig（IgG + IgM + IgA）多克隆 F(ab')2 片段（溶于 PBS），在 4 °C 下孵育过夜（推荐）或在 37 °C 下孵育 2 小时11。 
	注意：使用 Parafilm 密封板边缘，直至使用。</li>
	<li>将板倒置以去除未结合的抗体，向每个孔中加入 200 µL PBS，并在室温下孵育两次，每次 3 分钟。</li>
	<li>向每个孔中加入含 5% BSA（或 RPMI 1640 培养基）的 PBS 200 µL 进行封闭，在室温下孵育 2 小时。</li>
	<li>将板倒置以去除封闭液，按照步骤 5.5 的方法，用 200 µL PBS 每孔洗涤两次。</li>
	<li>向每个孔中加入 100 µL RPMI 1640 培养基，并在 37 °C 下孵育。</li>
	<li>准备接种细胞时，将板倒置以去除 RPMI 1640 培养基。</li>
	<li>将细胞悬液（来自步骤 1.19、2.10、2.11、3.10 和 4.6）分别取 100 µL（5 × 104）、50 µL（2.5 × 104）和 25 µL（1.25 × 104）接种至 ELISpot 板的孔中，再用 RPMI 1640 培养基补足至每孔总体积为 150 µL。 
	注意：建议至少进行一至两次两倍系列稀释以接种细胞。</li>
	<li>将板置于 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中孵育 8–14 小时18。孵育期间避免移动板。</li>
	<li>将板倒置以去除细胞和 RPMI 1640 培养基。</li>
	<li>每孔加入 200 µL PBS-T（含 0.05% Tween 20 的 PBS），在室温下共孵育 5 次，每次 3 分钟。每次洗涤之间将板倒置以去除洗涤液。</li>
	<li>在指定孔中加入山羊抗人 IgG-碱性磷酸酶（AP）Fcγ 特异性抗体（用于 IgG 检测，1:5,000 稀释于 PBS-T）或山羊抗人 IgM-AP Fcµ 片段特异性抗体（用于 IgM 检测，1:5,000 稀释于 PBS-T），在室温下避光孵育 2 小时。</li>
	<li>按照步骤 5.5 的方法，每孔用 200 µL PBS 洗涤两次。</li>
	<li>每孔加入 50 µL 溴氯吲哚磷酸-硝基蓝四氮唑（BCIP/NBT）底物溶液。通常在 5–15 分钟内出现紫色斑点。</li>
	<li>每孔加入 100 µL ddH2O 以防止斑点过度显色。</li>
	<li>所有斑点完全显色后，用流动的自来水冲洗板。</li>
	<li>移除板的下层排水垫，并在避光条件下自然晾干。</li>
	<li>使用配备图像采集/分析单元的自动酶标仪（例如，自动扫描仪）或解剖显微镜手动计数斑点。 
	注意：板可在避光条件下室温保存，后续再进行分析。</li>
</ol>

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作者声明不存在竞争性财务利益。

人外周血B细胞的分离与纯化
通常情况下，红细胞可被裂解缓冲液有效裂解并清除（步骤1.2）。PBMC与红细胞裂解缓冲液的孵育时间不应超过5分钟，因为氯化铵可能影响细胞活力。 alternatively，可通过以下方案同时去除红细胞和血小板。
将新鲜全血与酸-柠檬酸盐-葡萄糖（ACD）缓冲液（39 mM 柠檬酸、75 mM 柠檬酸钠和 135 mM 葡萄糖；pH 7.4）按 9:1 的体积比（血液:缓冲液）混合。在室温下以 250 × g 离心 10 分钟。注意观察分层现象，以判断分离效果。吸除并弃去上层液体，该层含有血小板和富血小板血浆（呈黄色）。小心移取中间薄层界面处的物质，即外周血单个核细胞（i.e.，白膜层）。避免吸取底层的红细胞（深红色）。向 PBMCs 中加入裂解缓冲液以去除残留的红细胞，随后进行步骤 1.2 至 1.19。
分离B细胞可采用两种方法：阳性选择和阴性选择21负选择法（步骤1.1至1.19）用于获取未受干扰且功能完整...

B细胞在体液免疫的发育过程中发挥核心作用。它们最初在骨髓中发育，并以初始B细胞的形式进入血液循环，进而迁移至脾脏、淋巴结和扁桃体等淋巴组织，进行进一步发育。当遇到抗原（Ag）后，部分初始B细胞迁移至淋巴滤泡，在生发中心分化为记忆B细胞以及浆母细胞（PBs）/浆细胞（PCs）。大多数PBs/PCs进入血液循环，而少数最终定居于骨髓，并进一步终末分化为长寿浆细胞。1循环中的B细胞具有异质性，在稳态下，外周血中浆母细胞/浆细胞（PBs/PCs）较为罕见2由于存在谱系特异性表面标志物，流式细胞术已成为外周血中B细胞亚群鉴定与表征的常用方法。流式细胞术的进一步应用是结合细胞分选功能，可实现对特定B细胞亚群的高纯度分离与富集。根据不同发育阶段特异性表面受体的表达情况，人类外周血B细胞通常被分为三个主要亚群：初始B细胞（CD19+CD27-CD38-)，记忆B细胞（CD19+CD27+CD38-)，以及浆母细胞/浆细胞（CD19+CD27+CD38+)3-4 (图1）。初始B细胞天生未接触过抗原（Ags）。然而，它们可分化为IgM+CD27+ 记忆B细胞。尽管初始B细胞在表达B细胞抗原受体（BCR）相关分子方面具有同质性（例如， CD19、CD20 和 CD22）它们在免疫球蛋白库中具有异质性5CD27 的大部分+ 记忆B细胞可分化为CD27+/hiCD38+ PBs/PCs6此外，记忆B细胞和浆母细胞/浆细胞呈多克隆性，并表现出发育和功能上的异质性4-7循环中的浆母细胞/浆细胞通常寿命较短，且不表达CD138；但定居于骨髓中的浆母细胞/浆细胞将终末分化并转变为长寿命细胞。终末分化的浆细胞表达CD138，并在其表面下调CD27分子8由于浆母细胞（PBs）和浆细胞（PCs）均具有分泌抗体（Abs）的能力，因此在许多情况下，它们被统称为抗体分泌细胞（ASCs）。相比之下，初始B细胞和记忆B细胞均无法产生可检测水平的抗体。9-10然而，当处于适当的培养条件下时，无论是初始B细胞还是记忆B细胞，均可在3至10天内分化为抗体分泌细胞（ASCs）。6, 11-15事实上，源自 体外 分化细胞与直接从外周血分离的细胞在CD27和CD38表面表达上相似6此外，ASCs 发生了分化 体外 表达较低水平的表面CD20，与循环中的PBs/PCs相似6尽管培养获得的ASCs寿命均较短，但它们能够分泌抗体，表明这些细胞具有功能活性，并可参与体液免疫应答。
ELISA 和 ELISpot 目前仍是获取体液免疫反应功能信息最常用的方法。ELISA 是一种基于 96 孔板的检测方法，常用于测定血清中抗原特异性抗体及其他分析物的滴度例如， 细胞因子）。该方法操作简便且可扩展。酶联免疫吸附试验（ELISA）利用固相酶联免疫技术，用于检测液体样本中抗体或血清等物质的存在。16血清ELISA的检测结果已被广泛用于表征机体的免疫反应。获取ELISA检测结果所需的关键工具是分光光度酶标仪。该仪器可测定通常由辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体与其特异性底物反应后生成的终产物的光密度（O.D.）17关于体液免疫反应的报告，通过ELISA测定的血清抗体水平反映的是体内抗体分泌细胞（ASCs）的整体而非个体功能。此外，ELISA无法反映记忆B细胞的参与情况，因为这类细胞不分泌抗体。
与ELISA类似，ELISpot是一种广泛用于检测和监测外周血样本中免疫反应的方法17-18ELISpot 是一种与夹心 ELISA 相关的技术。该技术将细胞置于带有聚偏二氟乙烯（PVDF）膜的 96 孔微孔板孔中进行短期培养。ELISpot 检测类似于在微孔板上进行蛋白质印迹，并在每个孔的 PVDF 膜上显色形成斑点。该实验需要使用自动 ELISpot 读板系统或体视显微镜进行人工计数。ELISpot 在检测免疫应答中的主要优势在于其对抗体分泌细胞（ASCs）和分泌细胞因子细胞的定量具有极高的灵敏度。它分别反映了体液免疫和细胞免疫中细胞的功能活性。在评估体液免疫功能时，ELISA 测定的血清抗体水平与 ELISpot 计数的 ASC 数量通常存在相关性，但这两种检测方法所得数据在功能意义上存在一定差异19-20ELISpot 方法的主要优势在于其高灵敏度。ELISA 报告的血清抗体滴度水平以光密度（O.D.）读数半定量表示，代表相对抗体水平；或者，当包含已知量的相应同种型抗体作为参考时，可更定量地以浓度读数表示。相比之下，ELISpot 的结果则表示为特定细胞群体中抗体分泌细胞（ASCs）的绝对数量。例如， 未分离的外周血单个核细胞（PBMCs）及从PBMCs中纯化的B细胞。ELISpot能够检测单个抗体分泌细胞（ASC），而ELISA则需要ASC分泌的抗体达到特定检测方法所要求的优化浓度后才能进行测量。因此，在定量检测的灵敏度方面，ELISpot明显优于ELISA。此外，ELISpot也适用于定量分析 体外 由活化的记忆B细胞分化而来的抗体分泌细胞（ASCs）。记忆B细胞本身不分泌抗体（Abs），但在被激活后可分化为ASCs；因此，它们对ELISA检测到的血清抗体无贡献。因此，ELISpot是检测循环记忆B细胞在体外培养激活后免疫应答的首选方法，可用于监测长期体液免疫的维持情况。

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer K2E</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td>10 mL 离心管</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>无内毒素</td></tr><tr><td>0.5% 台盼蓝溶液</td><td>Biological Industries</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>IMag 人 B 淋巴细胞富集试剂盒</td><td>BD Biosciences</td><td>558007</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记 CD27 单克隆抗体</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>克隆号 O323</td></tr><tr><td>链霉亲和素磁性微珠</td><td>BD Biosciences</td><td>9000810</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>BD Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>蓝色尼龙网细胞筛，40 &amp;mu;m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD19-APC</td><td>Biolegend</td><td>302212</td><td>克隆号 HIB19</td></tr><tr><td>抗人 CD27-eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0279-42</td><td>克隆号 O323</td></tr><tr><td>抗人 CD38-PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>303516</td><td>克隆号 HIT2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗人 CD38-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560677</td><td>克隆号 HIT2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗人 CD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>304006</td><td>克隆号 HI30</td></tr><tr><td>抗人 CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td>克隆号 HI30</td></tr><tr><td>抗小鼠/大鼠/人 CD27-PerCP Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>124213</td><td>克隆号 LG.3A10</td></tr><tr><td>抗人 CD27-PerCP Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>65429</td><td>克隆号 L128</td></tr><tr><td>抗人 CD19-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-064</td><td>克隆号 LT19</td></tr><tr><td>抗人 CD19-FITC</td><td>GeneTex</td><td>GTX75599</td><td>克隆号 LT19</td></tr><tr><td>抗人 CD20-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555622</td><td>克隆号 2H7</td></tr><tr><td>生物素标记抗人 CD27 抗体</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>克隆号 O323</td></tr><tr><td>生物素标记抗人 CD27 抗体</td><td>eBioscience</td><td>13-0279-80</td><td>克隆号 O323</td></tr><tr><td>7-氨基放线菌素 D（7-AAD）</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>CpG（ODN 2006）&amp;nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-2006</td><td>B 型 CpG</td></tr><tr><td>重组人 IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-10</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-21</td><td>PeproTech</td><td>200-21</td><td></td></tr><tr><td>重组人 sCD40L</td><td>PeproTech</td><td>310-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. aureus &lt;/em&gt;Cowan（SAC）的蛋白 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82526</td><td></td></tr><tr><td>商陆有丝分裂原（PWM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9379</td><td></td></tr><tr><td>MultiScreen 滤膜板，0.45 &amp;micro;m 孔径</td><td>Merck Millipore</td><td>MSIPS4510</td><td>无菌、透明 96 孔滤膜板，含疏水性 PVDF 膜</td></tr><tr><td>BCIP/NBT 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT 单试剂，碱性磷酸酶底物</td><td>Merck Millipore</td><td>ES006</td><td></td></tr><tr><td>人 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>人 IgG Fc 片段</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人 Ig（IgG + IgM + IgA）的 F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 片段</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-127</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人 IgG-碱性磷酸酶，特异性识别 Fc&amp;gamma; 片段</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-008</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人 IgM-碱性磷酸酶，特异性识别 Fc&amp;micro; 片段</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-043</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人 IgG-辣根过氧化物酶，特异性识别 Fc&amp;gamma; 片段</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-008</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人 IgM-辣根过氧化物酶，特异性识别 Fc&amp;micro; 片段</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-095</td><td></td></tr><tr><td>BD ELISPOT AEC 底物试剂盒</td><td>BD Biosciences</td><td>551951</td><td></td></tr><tr><td>C.T.L. ImmunoSpot 分析仪</td><td>C.T.L.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从血液中分离、分化和定量人抗体分泌型b细胞：elispot作为体液免疫的功能性检测方法

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

体液免疫的特征是产生功能性抗体分泌细胞（ASCs），这些细胞合成并分泌针对特定抗原（Ag）（如病原体）的抗体（Abs），用于宿主防御。为了定量评估个体体液免疫应答的功能状态，通常将血清抗体和循环中的ASCs作为功能性读数进行检测。在人类中，外周血是最方便且易于获取的样本，可用于测定由宿主B细胞引发的体液免疫应答。不同的B细胞亚群，包括ASCs，可通过使用谱系特异性抗体偶联微珠进行分选，或通过流式细胞术进行细胞分选，直接从外周血中分离获得。此外，纯化的初始B细胞和记忆B细胞可在体外培养中被激活并分化为ASCs。ASCs在抗体分泌中的功能活性可通过ELISpot进行定量，该方法结合了酶联免疫吸附测定（ELISA）和蛋白质印迹技术，能够在单细胞水平上对单个ASCs进行计数。在实际应用中，由于ELISpot能够方便地处理大量血液样本，其在评估疫苗效力方面的应用日益广泛。从人外周血中分离B细胞的方法，以及B细胞向ASCs分化的方案 体外，本文将描述采用ELISpot法对总IgM和IgG抗体分泌细胞（ASCs）进行定量的方法。

PBMCs 经去除了红细胞和贴壁细胞（步骤 1.2 至 1.7）。取一份等分试样（2 x 106)的细胞进行流式细胞术分析，以显示外周血中初始B细胞、记忆B细胞以及浆母细胞/浆细胞的群体分布情况图1）。在此供体的PBMC中，约有10%的淋巴细胞为CD19+ B细胞。在B细胞区室中，CD19阳性细胞的比例+CD27- 初始B细胞的比例约为50%。另一方面，约50%的CD19+ B 细胞为 CD27+ 记忆B细胞7, 25-26值得注意的是，CD27+ 记忆B细胞可通过加入IgD进一步分离4循环浆母细胞的表型可通过低表达或不表达CD20（CD19）表面标志物来更准确地界定。+CD27+/hiCD38+CD20lo/-)2,30-3...

人外周血常用于体液免疫应答的评估。本文描述了从人外周血中分离B细胞、在体外培养中将人B细胞分化为抗体（Ab）分泌细胞（ASCs），以及通过ELISpot实验定量总IgM和IgG抗体分泌细胞的方法。

从血液中分离、分化和定量人抗体分泌型B细胞：ELISpot作为体液免疫的功能性检测方法

体液免疫的特征是产生功能性抗体分泌细胞（ASCs），这些细胞可合成并分泌针对抗原（Ag）（如病原体）的特异性抗体，并且是……

本ELISpot方法的总体目标是实现对血液中人源抗体分泌型B细胞的定量分析。该方法有助于解答生物医学领域中关于B细胞免疫学及疫苗研究的关键问题。该技术的主要优势在于，能够在单细胞水平上检测并测量抗体分泌型B细胞。演示该实验步骤的是我实验室的研究生 Tsung-Chih Tseng。从肘正中静脉采集 10 ml 血液样本至含有钾盐添加的 EDTA 的 15 ml 离心管后，立即轻轻颠倒混匀数次，以防止凝血形成。随后向细胞中加入 35 ml 经高压灭菌的红细胞裂解缓冲液，在室温下孵育 5 分钟。当可见光线透过试管时，离心血液并确认存在白色沉淀。用10 ml灭菌PBS去除残留的裂解缓冲液，并将沉淀重悬于10 ml RPMI 1640培养基中。将细胞接种至10 cm培养皿，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。然后轻轻晃动培养皿数次，将悬浮细胞转移至一个15 ml塑料离心管中。经两次离心洗涤后，用200 μl冷PBS缓冲液重悬细胞沉淀，使其浓度为每毫升5至10 × 10⁶个细胞，并按每1 × 10⁶个细胞加入5 μl生物素标记的特异性识别血细胞的抗人抗体混合物。冰上孵育30分钟后，用10倍体积的无菌PBS洗涤细胞，再将细胞沉淀重悬于每1 × 10⁶个细胞加入5 μl链霉亲和素偶联磁珠中，冰上继续孵育30分钟。孵育结束后，向细胞中加入 2 ml PBS 缓冲液，将离心管置于磁力架上，室温静置 8 分钟。待磁珠吸附至管壁后，小心将上清液转移至新的锥形管中，并向细胞沉淀中再加入 2 ml PBS 缓冲液。完成第二次上清收集后，通过离心收集合并的细胞，将细胞重悬于 5 ml 聚苯乙烯管中，加入新鲜 PBS 缓冲液，调节细胞浓度至每毫升 7 个细胞的十分之一。完成非特异性封闭后，将每种筛选抗体各一微克加入至十分之六的细胞中，轻轻混匀，冰上孵育30分钟。孵育的最后5分钟内，向细胞中加入5微升7-AAD。然后向细胞中加入2毫升新鲜PBS，涡旋混匀后离心。将沉淀重悬于新鲜分选缓冲液中，浓度为每毫升7×10⁵个细胞的1至5倍，并通过40 µm细胞滤网过滤至新的5 mL聚苯乙烯管中。随后通过流式细胞术将细胞分选至三个含有5 mL新鲜RPMI培养基的15 mL离心管中，以分别收集初始B细胞、记忆B细胞和浆母细胞/浆细胞。当所有细胞分选完成后，将各细胞亚群以每毫升1×10⁵个细胞的浓度接种至12孔细胞培养板的独立孔中，每孔加入新鲜RPMI培养基。接下来，在细胞培养孵育箱中，使用每孔每毫升含1×10⁶个细胞、每1×10⁶个细胞加入5微克CPG ODN 2006的方法激活B细胞，持续5天。激活结束后，向ELISpot板的每孔中加入30微升35%乙醇与蒸馏水混合液，作用30秒。随后将每孔中的乙醇替换为150微升经高压灭菌的双蒸水，室温孵育5分钟，以去除残留的乙醇。用 PBS 洗涤一次，随后向每孔中加入 50 µL 抗人 IgG 的多克隆 FAB2 片段。用 PBS 将板洗涤两次，方法同前。每孔加入 200 µL 含 BSA 的新鲜 PBS，在室温下封闭非特异性结合位点，孵育 2 小时。再次用 PBS 洗涤后，将各孔加入 100 µL 新鲜 RPMI 1640 培养基，在 37°C 下孵育。然后将 ELISpot 各孔中的培养基更换为适量活化的 B 细胞，再用新鲜 RPMI 培养基补足各孔终体积至 150 µL，随后将 ELISpot 板放回细胞培养孵育箱中孵育 8 至 14 小时。孵育结束后，弃去培养基，用 200 µL 含 Tween20 的 PBS 洗涤各孔，每次 3 分钟，共洗涤 5 次。最后一次洗涤后，向相应的孔中加入适当的检测用一抗，避光孵育 2 小时。再经过一轮 PBS 洗涤后，每孔加入 50 µL BCIP/NBT 底物，在室温下反应 5 至 15 分钟。当出现紫色斑点时，每孔加入100 µL双蒸水终止反应，并用流动的自来水冲洗板子。然后将ELISpot膜在避光条件下自然晾干。在此份供体PBMC样本中，经红细胞裂解和贴壁细胞去除后，约有10%的淋巴细胞为CD19阳性B细胞。在B细胞区室中，约50%的细胞为CD27阴性的初始B细胞，另外50%为表达CD27的记忆B细胞。如前所述，将纯化的人B细胞和CD19+CD27+细胞用CPG处理五天，通常可由1×10⁴个活化的B细胞产生50至200个分泌IgM的细胞以及10至50个分泌IgG的抗体分泌细胞。一旦掌握，若操作得当，该ELISpot技术可在三小时内完成。在开始此操作之前，重要的是要记住使用适当的捕获试剂对检测分泌抗体的细胞位点进行编码。该技术建立后，为疫苗学领域的研究人员开展大规模试验和长期随访以探索疫苗有效性铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从人血液中纯化B细胞。分离初始B细胞和记忆B细胞以进行分化，并进行ELISpot实验以定量抗体分泌细胞。请注意，操作人血可能存在生物危害，因此在进行该实验时务必采取防护措施，例如佩戴手套。

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免疫学与感染

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了解使用ELISpot技术从人外周血中分离、分化并定量检测抗体分泌B细胞的完整实验流程。该方法可在单细胞水平精确测量IgM和IgG抗体分泌细胞，为疫苗研发及体液免疫研究提供关键功能读数。

从血液中分离、分化和定量人抗体分泌型B细胞：ELISpot作为体液免疫的功能性检测方法

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