酶联免疫斑点法（ELISPOT）:TH - 1细胞对微生物抗原的免疫应答的定量
2010年11月23日
可以通过使用的酶联免疫检测鉴定的微生物指标在特发性疾病的适应性免疫。
该程序的总体目标是检测 T 细胞对目标抗原的反应。这是通过首先使用捕获抗体进行编码来实现的。该程序的第二步是添加感兴趣的细胞和抗原，然后孵育过夜。
该程序的第三步是添加检测抗体。该程序的最后一步是使用底物试剂显影板并分析斑点。最终，通过分析斑点形成单位，可以获得选择目标细胞因子的结果。
大家好，我叫 Dr.Ki Richter，是范德堡大学传染病系 Dr.Wonder Drake 实验室的研究讲师。今天，我们将演示 Ellie Spot 技术，也称为酶联免疫斑点测定。Isfahan Chambers 博士和 Tiffany Cone 今天将为您演示这项技术。
为了保持细胞培养标准，在通风橱中的无菌条件下进行作，打开 ally spot 板并用 PBS 洗涤 3 次。在 PBS 中制备捕获抗体的包被溶液。为方便起见，涡旋混合均匀。
将抗体溶液转移至多通道储液槽、移液器中，并将 100 μL 包被溶液分装到每个储液槽中。用 perfil 密封板，放入冰箱过夜。这些抗体包被板可保存数周。
根据经验法则，如果孔中仍有液体，则可以使用板。为了制备用于该测定的细胞，用三烯蓝对新鲜分离的外周血单核细胞进行活力染色并计数：在我们的 10 种培养基中以每毫升 200 万个细胞的密度接种 PBMC，并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳孵育过夜。为了跟踪实验，请在 Ali 点板盖上标记样品识别号、孔条件和日期。
使用倾倒和印迹法，用无菌 PBS 洗涤板 6 次。倾倒时小心不要溅到板，因为这可能会导致板的孔变成紫色。向每个孔中加入我们的 20 种培养基，并在 37 摄氏度下孵育板 1 小时。
在培养板孵育时，对静置过夜的细胞进行计数。通过离心收获 PBMC。倒出上清液，并以每毫升 100 万个细胞的浓度在我们的 10 种培养基中重悬沉淀。
盟友斑点板孵育 1 小时后，使用倾倒和印迹法去除 R 20 培养基。倾倒时小心不要溅到盘子。向每个细胞中加入 100 微升细胞悬液。
按照实验设计，将肽和抗原添加到相应的测试孔中。始终包括无肽细胞的阴性对照以及添加植物血凝素的阳性对照孔。将板在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳孵育过夜。
使用倾倒和印迹法，用 150 微升 one XPBS 洗涤板 6 次。向板的每个孔中加入 100 μL PBS，并将板放入冰箱或室温下放置 15 分钟。同时，在 PBS 中制备生物素抗体溶液。
从冰箱中取出 ALI 斑板，将 PBS 轻弹到废纸篓中丢弃。将等分试样的生物素抗体溶液倒入每个孔中时，小心不要溅到板中，并将板在组织培养罩中室温孵育 1 小时。最后一次洗涤时，使用 dump and blot 方法用 PBS 洗涤板六次。
现在将 PBS 留在盘子上。在 PBS 中制备链霉亲和素抗体溶液，确保涡旋溶液以混合。好丢弃孔中的最后一次 PBS 洗涤液，并绘制 ALI 点板。
向每个孔中加入链霉亲和素抗体溶液，并将板在组织培养罩中于室温下孵育 1 小时。为了去除过量的 trevain 抗体，使用倾倒和印迹法用 PBS 洗涤板六次，最后一次洗涤，将 PBS 引导到板上。鉴于 B-C-I-P-M-B-T 碱性磷酸酶底物溶液的光敏性。
按照碱性磷酸酶底物试剂盒说明中的制造商所述，制备茎溶液时在黑暗中工作，丢弃孔中剩余的 PBS 并吸干 ly 点板。向每个孔中加入底物溶液并打开灯。显色 5 到 10 分钟后，让试剂留在板上，直到斑点开始变成紫色并变得非常暗。
此过程最多需要 20 分钟。用自来水清洗 Ali 斑板 3 次，然后风干。每个板都包含阳性对照、阴性对照和目标肽，至少一式两份进行。
阳性对照孔为深紫色，反映细胞汇合层，几乎没有任何白色背景。阴性对照孔没有紫色背景，也没有预期的斑点。此处的测试样品孔说明了细胞对微生物肽的反应。
紫色斑点代表在进行 LA 斑点技术时表达目标细胞因子的单个反应细胞。请注意不要用移液器吸头刺穿膜或让板变干，因为这会导致高背景。
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概述
本文讨论了使用酶联免疫斑点分析法来识别特发性疾病中适应性免疫的微生物靶点。该程序旨在检测特定抗原的T细胞反应。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 微生物学
- 适应性免疫
背景
- 适应性免疫在对抗微生物感染中起着至关重要的作用。
- 了解T细胞反应有助于识别疾病机制。
- 酶联免疫斑点分析法对于分析免疫反应是有效的。
- 特发性疾病通常缺乏明确的微生物关联，使这项研究变得重要。
研究目的
- 检测对特定抗原的T细胞反应。
- 识别与特发性疾病相关的微生物靶点。
- 加深对适应性免疫机制的理解。
使用的方法
- 用捕获抗体包被板。
- 加入感兴趣的细胞和抗原，过夜孵化。
- 引入检测抗体。
- 用底物试剂显色板，并分析斑点形成单位。
主要结果
- 成功检测到对目标抗原的T细胞反应。
- 通过分析斑点形成单位，识别出特定细胞因子。
- 对适应性免疫的微生物靶点有了新的认识。
结论
- 酶联免疫斑点分析法是研究T细胞反应的有价值工具。
- 研究结果有助于理解特发性疾病中的免疫反应。
- 进一步的研究可能阐明这些疾病中特定微生物的作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
ELISPOT enables quantitative assessment of antigen-specific T-cell responses, supporting target validation in infectious disease and autoimmune research. Its ability to distinguish Th1/Th2 profiles and detect responses in diverse sample types enhances mechanistic de-risking in early discovery. The assay provides predictive confidence for prioritizing microbial antigens in vaccine and therapeutic development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies cytokine-secreting T cells to validate microbial antigens as therapeutic targets.
- Operational Value: Enables functional interrogation of T-cell specificity and polarization in human samples.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing and biological de-risking of antigen candidates before lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, antigen-specific readouts via spot-forming units for assay standardization.
- Operational Value: Compatible with PBMC, BAL, CSF, and ascites, enabling flexible sample integration.
- Reproducibility: Duplicate well design and controlled incubation conditions support assay reliability across runs.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Tracks antigen-specific responses over time to correlate with disease states or treatment effects.
- Biomarker Alignment: Distinguishes Th1 vs Th2 cytokine profiles to inform immune mechanism of action.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables longitudinal monitoring of immune responses in preclinical and clinical models.
Pipeline & Workflow Integration
ELISPOT fits within the discovery continuum from target validation through preclinical immune monitoring, particularly for antigen-specific T-cell profiling.
- Discovery Biology: Supports interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying antigen-driven T-cell activation.
- Screening: Generates quantitative, reproducible outputs for evaluating antigen libraries or peptide pools.
- Analytics: Spot-forming unit analysis enables direct comparison of immune responses across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects early immune profiling to preclinical validation via longitudinal antigen-specific tracking.
- Enterprise Reuse: Platform-adaptable for multiple antigens, cytokines, and sample types across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into antigen-specific T-cell function and cytokine polarization.
- Operational Value: Standardized workflow with defined controls and incubation parameters ensures reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by de-risking target antigen immunogenicity early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antigens based on validated T-cell response magnitude and quality.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell handling, cytokine detection, and plate-based assay execution.
- Dependent on access to ELISA readers or imaging systems for spot quantification and antibody reagents.
- Necessitates standardization across teams for cell preparation, antigen dosing, and environmental controls.
- Adaptable to various sample types including PBMCs and biological fluids with appropriate processing.
- Limited by spot overlap at high cell densities and background from improper washing or plate drying.
