酶联免疫斑点法（ELISPOT）:TH - 1细胞对微生物抗原的免疫应答的定量

该程序的总体目标是检测 T 细胞对目标抗原的反应。这是通过首先使用捕获抗体进行编码来实现的。该程序的第二步是添加感兴趣的细胞和抗原，然后孵育过夜。

该程序的第三步是添加检测抗体。该程序的最后一步是使用底物试剂显影板并分析斑点。最终，通过分析斑点形成单位，可以获得选择目标细胞因子的结果。

大家好，我叫 Dr.Ki Richter，是范德堡大学传染病系 Dr.Wonder Drake 实验室的研究讲师。今天，我们将演示 Ellie Spot 技术，也称为酶联免疫斑点测定。Isfahan Chambers 博士和 Tiffany Cone 今天将为您演示这项技术。

为了保持细胞培养标准，在通风橱中的无菌条件下进行作，打开 ally spot 板并用 PBS 洗涤 3 次。在 PBS 中制备捕获抗体的包被溶液。为方便起见，涡旋混合均匀。

将抗体溶液转移至多通道储液槽、移液器中，并将 100 μL 包被溶液分装到每个储液槽中。用 perfil 密封板，放入冰箱过夜。这些抗体包被板可保存数周。

根据经验法则，如果孔中仍有液体，则可以使用板。为了制备用于该测定的细胞，用三烯蓝对新鲜分离的外周血单核细胞进行活力染色并计数：在我们的 10 种培养基中以每毫升 200 万个细胞的密度接种 PBMC，并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳孵育过夜。为了跟踪实验，请在 Ali 点板盖上标记样品识别号、孔条件和日期。

使用倾倒和印迹法，用无菌 PBS 洗涤板 6 次。倾倒时小心不要溅到板，因为这可能会导致板的孔变成紫色。向每个孔中加入我们的 20 种培养基，并在 37 摄氏度下孵育板 1 小时。

培养板孵育时，对静置过夜的细胞进行计数。通过离心收获 PBMC。倒出上清液，并以每毫升 100 万个细胞的浓度在我们的 10 种培养基中重悬沉淀。

友斑点板孵育 1 小时后，使用倾倒和印迹法去除 R 20 培养基。倾倒时小心不要溅到盘子。向每个细胞中加入 100 微升细胞悬液。

按照实验设计，将肽和抗原添加到相应的测试孔中。始终包括无肽细胞的阴性对照以及添加植物血凝素的阳性对照孔。将板在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳孵育过夜。

使用倾倒和印迹法，用 150 微升 one XPBS 洗涤板 6 次。向板的每个孔中加入 100 μL PBS，并将板放入冰箱或室温下放置 15 分钟。同时，在 PBS 中制备生物素抗体溶液。

从冰箱中取出 ALI 斑板，将 PBS 轻弹到废纸篓中丢弃。将等分试样的生物素抗体溶液倒入每个孔中时，小心不要溅到板中，并将板在组织培养罩中室温孵育 1 小时。最后一次洗涤时，使用 dump and blot 方法用 PBS 洗涤板六次。

现在将 PBS 留在盘子上。在 PBS 中制备链霉亲和素抗体溶液，确保涡旋溶液以混合。好丢弃孔中的最后一次 PBS 洗涤液，并绘制 ALI 点板。

向每个孔中加入链霉亲和素抗体溶液，并将板在组织培养罩中于室温下孵育 1 小时。为了去除过量的 trevain 抗体，使用倾倒和印迹法用 PBS 洗涤板六次，最后一次洗涤，将 PBS 引导到板上。鉴于 B-C-I-P-M-B-T 碱性磷酸酶底物溶液的光敏性。

按照碱性磷酸酶底物试剂盒说明中的制造商所述，制备茎溶液时在黑暗中工作，丢弃孔中剩余的 PBS 并吸干 ly 点板。向每个孔中加入底物溶液并打开灯。显色 5 到 10 分钟后，让试剂留在板上，直到斑点开始变成紫色并变得非常暗。

此过程最多需要 20 分钟。用自来水清洗 Ali 斑板 3 次，然后风干。每个板都包含阳性对照、阴性对照和目标肽，至少一式两份进行。

阳性对照孔为深紫色，反映细胞汇合层，几乎没有任何白色背景。阴性对照孔没有紫色背景，也没有预期的斑点。此处的测试样品孔说明了细胞对微生物肽的反应。

紫色斑点代表在进行 LA 斑点技术时表达目标细胞因子的单个反应细胞。请注意不要用移液器吸头刺穿膜或让板变干，因为这会导致高背景。