从人外周血中分离和纯化 B 细胞

要对B细胞进行免疫磁负分离，请将人外周血收集在含有抗凝剂的管中以防止血液凝固。加入红细胞、红细胞、裂解缓冲液以裂解红细胞而不影响其他血细胞。

心以从密度较低的裂解红细胞中沉淀出完整、致密的血细胞，这些红细胞保留在上清液中。弃去上清液。将沉淀重悬于新鲜培养基中。

细胞转移到培养板中。孵育以使巨噬细胞和单核细胞粘附在板上，而非贴壁细胞（包括B细胞）保持悬浮状态。

将悬浮细胞收集到新鲜试管中。离心以沉淀细胞并将它们重悬于缓冲液中。

加入含有对 B 细胞以外的血细胞具有特异性的生物素化抗体的鸡尾酒溶液。抗体与非 B 细胞表面的抗原结合，使 B 细胞未标记。

离心机。弃去含有未结合抗体的上清液。

加入链霉亲和素偶联磁珠溶液。在孵育过程中，微珠上的链霉亲和素与与非 B 细胞结合的生物素化抗体紧密结合，形成复合物。

管置于磁场中，将磁珠结合的非 B 细胞粘附到管壁上，使 B 细胞处于悬浮状态。将含有纯 B 细胞的上清液转移到试管中。

B 细胞离心并重悬于培养基中，以进行进一步的下游分析。

肘正中静脉取10毫升血样放入含有补充钙EDTA的15毫升管中后，立即将管倒置数次以防止凝块形成。然后，向细胞中加入 35 毫升高压灭菌的红细胞裂解缓冲液，在室温下孵育 5 分钟。

当可以通过管观察到光线时，离心血液并确认存在白色颗粒。用 10 毫升高压灭菌器去除残留裂解缓冲液至 PBS，并将沉淀重悬于 10 毫升 RPMI 1640 培养基中。

细胞接种在 10 厘米的培养皿中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 30 分钟。然后，轻轻旋转培养皿几次，并将漂浮细胞转移到塑料 15 毫升锥形管中。

通过离心洗涤两次后，将沉淀以每毫升浓度5至10 x 10⁶细胞重悬于200微升冷PBS缓冲液中，并每1 x 10⁶细胞加入5微升对血细胞具有特异性的生物素化抗人抗体混合物。

在冰上孵育 30 分钟后，在 10 倍多体积的无菌 PBS 中洗涤细胞，并将沉淀重悬于每 1 x 10⁶ 个细胞的 5 微升链霉亲和素偶联微珠中，在冰上孵育 30 分钟。在孵育结束时，向细胞中加入 2 毫升 PBS 缓冲液，并将试管放在室温下磁性支架上 8 分钟。

当微珠附着在管壁上时，小心地将上清液转移到新的锥形管中，并向细胞中再加入2毫升PBS缓冲液。第二次上清液收集后，通过离心收集混合的细胞，并将细胞以每毫升浓度为1 x 10⁷个细胞转移到新鲜PBS缓冲液中的5毫升聚苯乙烯管中。