从人外周血中分离和纯化B细胞

为了进行B细胞的免疫磁珠阴性分离，需使用含有抗凝剂的试管采集人外周血，以防止血液凝固。加入红细胞（RBC）裂解缓冲液，裂解红细胞，同时不影响其他血细胞。

离心以沉淀完整且密度较高的血细胞，而密度较低的裂解红细胞则保留在上清液中。弃去上清液。用新鲜培养基重悬沉淀物。

将细胞转移至培养板中。孵育以使巨噬细胞和单核细胞贴壁，而包括B细胞在内的非贴壁细胞则保持悬浮状态。

将悬浮的细胞收集到一个新的离心管中。离心以形成细胞沉淀，并将细胞重悬于缓冲液中。

加入含有针对非B细胞血细胞的生物素化抗体的混合溶液。这些抗体将结合到非B细胞表面的抗原上，从而使B细胞保持未标记状态。

离心。弃去含有未结合抗体的上清液。

加入链霉亲和素偶联的磁珠溶液。在孵育过程中，微珠上的链霉亲和素与结合在非B细胞上的生物素化抗体紧密结合，形成复合物。

将试管置于磁场中，使结合有非B细胞的磁珠吸附于管壁，B细胞则保留在悬液中。将含有纯化B细胞的上清液转移至另一试管中。

离心并用培养基重悬B细胞，用于后续分析。

从肘正中静脉采集10毫升血液样本至含有钾盐EDTA的15毫升离心管后，立即轻轻颠倒混匀数次，以防止凝血。随后，向细胞中加入35毫升经高压灭菌的红细胞裂解缓冲液，在室温下孵育5分钟。

当可通过管子观察到光线时，离心血液并确认存在白色沉淀。用10毫升经高压灭菌的PBS去除残留的裂解缓冲液，并将沉淀重悬于10毫升RPMI 1640培养基中。

将细胞接种于10厘米培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。随后，轻轻摇晃培养皿数次，将悬浮细胞转移至15毫升塑料离心管中。

离心洗涤两次后，将沉淀重悬于200微升冷PBS缓冲液中，浓度为每毫升5至10 × 10⁶个细胞，并按每1 × 10⁶个细胞加入5微升生物素标记的抗人血细胞特异性抗体混合物。

冰上孵育30分钟后，用10倍体积的无菌PBS洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于每1 × 10⁶ 个细胞5微升的链霉亲和素偶联微珠中，于冰上继续孵育30分钟。孵育结束后，向细胞中加入2毫升PBS缓冲液，将离心管置于磁力架上，室温放置8分钟。

当微珠附着到离心管管壁后，小心将上清液转移至新的锥形管中，并向细胞中再加入 2 毫升 PBS 缓冲液。在完成第二次上清液收集后，通过离心收集合并的细胞，并将细胞重悬于新鲜 PBS 缓冲液中，转移至 5 毫升聚苯乙烯管，细胞浓度为 1 × 10⁷ 个细胞/毫升。