Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

细菌生物膜对人类健康很重要，可以保护其细菌居民免受环境侵害和抗菌剂。该程序的目标是开发一个模型系统来评估小分子抑制剂对生物膜形成的影响。这些方法可以帮助建立生物膜领域选择专门针对生物膜形成的小分子抑制剂所必需的工具集。

这些方法的主要优点是它们从一个一致、稳健的实验框架开始，并对生物膜特异性抑制剂的作用机制提供定量和定性的见解。虽然这些方法可以深入了解枯草芽孢杆菌生物膜，但它们也可以应用于其他形成生物膜的细菌，例如铜绿假单胞菌或植物病原体柠檬黄单胞菌。扫描电子显微镜对于分析小分子对生物膜形成的影响至关重要，因为它可以观察细胞外基质，并提供单细胞分辨率。

首先，首先选择合适的单个菌落，并将其转移到 3 mL 的 LB 肉汤中。将这种发酵剂放入 37 摄氏度的振荡培养箱中 4 小时。孵育后，取 1.5 mL 发酵剂培养物，离心 4 分钟。

小心去除上清液，然后将沉淀重新悬浮在 1.5 mL MSgg 培养基中。为了培养表膜，通过向每个孔中加入 3 毫升 MSgg 来制备 12 孔细胞培养板。向其中一些孔中，在浓度范围内加入带有小分子抑制剂的 MSgg，将不同浓度的位置分布在培养皿周围，以避免边缘效应。

测量 600 纳米重悬发酵剂培养物的光密度。培养物应介于 0.6 和 1 之间。这对于系统的稳健性至关重要。

用 3 微升重新悬浮的发酵剂培养物接种培养板的每个孔。然后，在静态条件下将板在 23 摄氏度下孵育 3 天。然后，从培养箱中取出板，观察表膜。

为了生长生物膜，使用模板并将四滴 1.5 微升未洗涤的发酵剂培养物对称点样到 8.5 厘米干燥的 1.5% 琼脂 MSgg 板上。在移动板之前，让液滴吸收到介质中。将板在 30 摄氏度下孵育三天。

使用光线均匀曝光的双筒望远镜，检查生物膜菌落是否已发育并形成三维皱纹结构。首先，取一把干净的剃须刀片，在模板的帮助下将生物膜菌落切成两等份。用干净的抹刀小心地提起一半的菌落，然后将其转移到含有 500 微升 PBS 的 1.5 毫升微量离心管中。

取菌落的后半部分，将其转移到含有 500 微升 50% 乙醇的微量离心管中。这些将用于评估对消毒剂的耐药性。然后，同样地取 D-赖氨酸处理的菌落的前半部分，并将其置于 PBS 中。

然后，取这个菌落的后半部分，并将其转移到乙醇中。在室温下孵育所有包含生物膜半部分的试管 10 分钟。然后，以 18， 000 倍 g 离心 5 分钟。

使用移液管小心去除上清液。加入 300 μL PBS，然后用 microtip 超声仪以低设置对细胞进行超声处理。再添加 700 微升 PBS，使最终体积为 1 毫升。

接下来，在 PBS 中进行 10 至负 7 的连续稀释。取 100 微升其中一种稀释液，接种 1.5% 琼脂 LB 平板。对每个样品的另外两个稀释液重复此步骤。

使用玻璃珠涂抹 innoculum，然后在 30 摄氏度下孵育板过夜。检查平板并计算菌落形成单位或 CFU。计算每毫升 CFU 值后，计算 PBS 与乙醇处理中的存活百分比。

要开始样品固定，首先为所需数量的生物膜菌落准备足够的新鲜固定液。小心地向每个培养皿中加入 5 毫升固定剂，避免直接移液到菌落上。菌落将开始从琼脂中分离并漂浮。

用封口膜小心密封板，并在室温下在旋转振荡器上孵育 2 小时。将板转移到 4 摄氏度的温度下储存过夜。用连接到真空的巴斯德移液管轻轻去除固定液。

加入 10 毫升 100 纳摩尔二甲胂酸钠、5 毫摩尔氯化钙缓冲液洗涤生物膜，并孵育 5 分钟。用巴斯德移液管小心地将生物膜菌落的中心从琼脂板上分离。要风干菌落，将纤维素滤纸切成四分之一，然后将一部分浸入 100% 乙醇中。

小心地将一个漂浮的生物膜菌落转移到纸上。将纸放入衬有干滤纸的培养皿中。然后，盖上培养皿，将其放在化学罩中晾干过夜。

为了保持生物膜菌落的形态，重要的是用纤维素纸完全覆盖漂浮的生物膜。一旦上纸，生物膜就无法重新调整。用碳带涂覆电子显微镜存根，然后用镊子小心地将生物膜菌落转移到存根上。

将每个菌落连接到存根后，通过添加碳带细桥，将存根存放在干燥器中 24 小时或直到需要为止。这一步需要一只稳定而精确的手，因为在这个阶段，生物膜非常脆弱，很容易破裂。挑战在于在没有裂缝的情况下安装生物膜的大部分。

检查当天，将菌落放入金钯溅射镀膜机中。以 60 度角包被样品 2 分钟。重复此步骤两次，将样品旋转 120 度。

最后，从顶部开始包被样品一次，每次 3 分钟。样品现在可以在 SEM 上成像了。这些图像显示了在生物膜诱导 MSgg 培养基中生长的枯草芽孢杆菌的薄膜形成。

随着小分子抑制剂 D-赖氨酸的加入，表膜发育减少。随着抑制剂浓度的增加，表膜形成显示出相关的减少。该图显示了暴露于乙醇对生物膜菌落内细胞存活的影响，这些细胞已用 D-赖氨酸抑制剂处理或未处理。

与未处理的组分相比，用 D-赖氨酸处理并暴露于 50% 乙醇 10 分钟的菌落存活率显著降低。自上而下的双目图像显示，在 D-赖氨酸存在下生长的菌落总体上更小，并且形成的皱纹比未处理的菌落少。临界点干燥生物膜菌落的扫描电子显微镜图像进一步揭示了改变的生物膜发展。

细胞外聚合物基质 （EPS） 在未处理的样品中看起来更像蜘蛛网，处理过的样品显示出较少的组织。最后，对单个细菌细胞的分辨率进行检查表明，处理过的细胞在外观上拉长，EPS 覆盖较少，并且不像未处理的细胞那样与邻居紧密相连。在尝试此程序时，重要的是要记住，设置一致的框架来研究生物膜抑制剂对于可重复的结果至关重要。

一旦掌握，如果作得当，可以在不到一周的时间内完成生物膜抑制的小分子筛选。在此程序之后，可以执行其他方法，例如研究单个生物膜细胞中的基因表达，以便更深入地了解小分子抑制剂的靶标。观看此视频后，您应该对如何分析特定生物膜抑制剂对生物膜形成和抗生素耐药性的整体影响有很好的了解。