Name: 方法学研究乙。枯草生物膜作为模型的表征小分子抑制剂生物膜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 了解利用枯草芽孢杆菌生物膜模型评估小分子抑制剂的方法。本研究建立了可重复的实验框架，通过扫描电镜分析生物膜形成机制，为开发抗生物膜治疗策略提供定量与定性依据。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

电子显微镜成像工作在魏茨曼科学研究所的电子显微镜单元完成，部分由Irving和Cherna Moskowitz纳米与生物纳米成像中心支持。本研究还得到了以色列科学基金会（ISF）I-CORE资助项目152/1、Dan Kane先生与夫人、Lois Rosen女士、Yeda-Sela研究基金、Larson慈善基金会、Ruth和Herman Albert新科学家学者计划、Ilse Katz材料科学与磁共振研究所资助项目、卫生部替代研究方法资助项目，以及法国-以色列合作Maimonide-以色列研究计划的支持。IKG是Rowland和Sylvia职业发展讲席的获得者。

1. 评估小分子抑制剂对浮膜和生物膜菌落形成的影响
<ol>
	<li>制备不含氯化钙和六水合三氯化铁的2倍浓度定义生物膜诱导MSgg培养基溶液25。过滤除菌后，加入氯化钙。该培养基可直接使用，或避光保存于4 °C。</li>
	<li>在实验当天制备1倍浓度MSgg稀释液。
	<ol>
		<li>将2倍浓度MSgg培养基用无菌蒸馏水（用于菌膜）或无菌3%热（80 °C）琼脂（用于生物膜）稀释至1倍浓度，并加入六水合三氯化铁，使其终浓度为50 μM（用于菌膜）或250 µM（用于生物膜）。加入所需浓度的抗生素或小分子抑制剂，并充分混匀。例如，为在30 ml培养体系中获得0.5 mM终浓度的D-亮氨酸以形成菌膜或生物膜，需加入196.6 µl浓度为76.3 mM（10 mg/ml）的D-亮氨酸储备液。 
		注：1倍浓度MSgg培养基的最终组分见表1。与原始配方25相比，该培养基含有50 µg/ml苏氨酸，且在固体MSgg培养基上培养生物膜菌落时，铁浓度提高2.5倍，以优化皱褶菌落形态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>琼脂凝固后，在接种前将固体MSgg平板置于生物安全柜中干燥30–45分钟。</li>
	<li>为筛选干扰菌膜形成机制的特异性抑制剂（图1），需排除所用浓度对浮游生长和静置生长的影响。
	<ol>
		<li>通过每小时测定600 nm处光密度直至进入稳定生长期，绘制简单的生长曲线，以确定浮游生长情况（液体培养中光密度随时间的增加）。</li>
		<li>为确认所测得的培养物浊度反映活菌数量，从振荡培养物中在多个时间点取样，测定浮游生长阶段细胞的菌落形成单位（CFU）数量。</li>
		<li>为评估小分子抑制剂对静置菌膜生长的影响，在23 °C孵育3天后，从24孔细胞培养板的孔中收集细胞（接种条件同1.7–1.9节所述），并测定CFU。此对照应使用缺乏编码胞外基质组分操纵子的菌膜缺陷型菌株（i.e., B. subtilis ΔepsH, ΔtasA）。 
		注：该菌株可在静置条件下生长，但与能形成菌膜的野生型菌株不同，其无法上浮至液-气界面——该界面因氧气含量较高而更利于生长26。因此，这种胞外基质和菌膜缺陷型菌株是评估静置条件下生长的推荐参照菌株。 
		注：以下所述非经典D-氨基酸D-亮氨酸的具体实例中，已排除其在干扰菌膜形成浓度下对浮游和静置生长的影响12,17。测定浮游和静置生长的方法已有详细描述17。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="生物膜靶点评估；抑制作用、细胞毒性评估流程图；抑制剂分析。" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 用于确定稳健实验体系以评估生物膜形成特异性抑制作用的概念性概述。 用于筛选小分子抑制剂的选择标准，这些抑制剂应能特异性干扰生物膜的形成，而对浮游生长无显著影响。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>划线接种 B. subtilis 从一个 -80 °C 储存液（10 的 LB 培养物）9 以无菌枪头或接种棒将细胞涂布于含1.5%琼脂的LB平板，每毫升含20%甘油的冻存菌液中分离单菌落。</li>
	<li>过夜培养于 30 °C.</li>
	<li>关键步骤： 对于非经典D-氨基酸（如D-亮氨酸）介导的强效菌膜抑制作用，需挑取LB-1.5%琼脂平板上的单菌落，接种于3 ml LB液体培养基中培养 37 °C 在摇床培养箱中（摇速200 rpm）培养4小时。接种前，将LB肉汤替换为诱导生物膜形成的MSgg培养基：取1.5 ml起始培养物，以6,000 × g离心4分钟，小心移除上清液，将沉淀重悬于1.5 ml MSgg培养基中。其余培养物可弃去。 
	重要提示：为确保系统的稳定性，需在600 nm处测定光密度（OD600洗涤后的起始培养物的光密度值（OD）应在0.6至1.0之间。</li>
	<li>在启动培养物生长期间，准备一个12孔细胞培养多孔板，每孔含有3 ml MSgg培养基，不含或含一系列浓度的小分子抑制剂例如，0.3、0.5、1 mM D-亮氨酸17）。为排除边缘效应，应将不同浓度的位置分布在多孔板的不同区域。或者，使用含有1.5 ml MSgg培养基的24孔细胞培养多孔板。</li>
	<li>将细胞接种于12孔细胞培养多孔板的各孔中 3 µl 洗涤后的起始培养物（1:1,000 稀释） 
	注意：较低的稀释比例， 即，1:500 的比例可以使用，这会缩短菌膜的形成时间。</li>
	<li>在静置条件下培养菌膜 23 °C 在静态条件下静置三天。在此期间不要移动菌膜，以免影响菌膜最终的表面形态。</li>
	<li>使用双目镜并保持光照均匀的条件下拍摄图像。或者，使用高分辨率相机拍摄薄层样品。为避免因光照角度不一致和阴影造成的伪影，应将相机固定在三脚架上，从正上方拍摄，并采用柔和且大面积的光源 45° 从两侧 
	注意：一种研究的替代方法 B. subtilis 多细胞性的检测方法是在固体生物膜诱导型MSgg培养基上进行的生物膜菌落实验。与浮膜类似，该实验可用于研究时空动态过程。在确定小分子抑制剂的有效作用范围后，可进一步研究其对生物膜菌落形成的影响。</li>
	<li>为了培养生物膜菌落，对称地接种 1.5 µl 使用模板将未洗涤的预培养物（步骤1.7）滴加到干燥的MSgg 1.5%琼脂平板上——每个直径8.5 cm的培养皿滴加4滴。滴加后待液体完全吸附后再移动平板。 
	注意：该模板有助于在细胞生长区域内实现生物膜菌落的均匀分布。制备模板时，按实际尺寸绘制出整个生长区域，将其划分为若干均等的扇形区域，并标记中心点。对于直径为8.5 cm的圆形培养皿，此方法对应约14 cm²的面积2 一个生物膜菌落。</li>
	<li>将培养板置于培养箱中孵育 30 °C 三天。在此期间，生物膜菌落发育并形成三维皱褶结构。</li>
	<li>按照步骤1.11进行拍照。</li>
</ol>
2. 乙醇抗性检测
<ol>
	<li>按照步骤 1.1-1.7 和 1.12-1.14 所述方法培养生物膜。</li>
	<li>在 30 °C 下培养 68 小时后，借助剃刀刀片和模板将生物膜菌落切成两个相等的部分。</li>
</ol>
<img alt="生物膜生长实验装置、琼脂上的细菌菌落、离心、超声处理、稀释过程。" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 评估生物膜菌落细胞对灭菌剂抗性的一个实验设计示例。 （A）用于在培养皿上均匀分布并切割生物膜菌落的模板。（B）在30 °C条件下于固体、成分明确的生物膜诱导型MSgg培养基上培养68小时的未处理野生型生物膜的俯视图。放大图显示了如何将一个生物膜菌落均等地切成两半。（C）将两个相等的生物膜半体分别进行相同处理（对照组用PBS），或分别用PBS或灭菌剂处理，并按所述方法进行后续操作。比例尺：1 cm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>用小刮勺小心地将生物膜菌落的每一半从琼脂平板上取下，并转移至含有 500 µl 磷酸盐缓冲液（PBS）。如有必要，用刮刀将残留的细胞从培养板上刮下，并一同转移至微量离心管中。 
	注意：生物膜菌落的后半部分处理方式不同，具体取决于其是作为对照组还是用于检测对灭菌剂的抗性。</li>
	<li>作为对照，将生物膜菌落的另一半置于培养环境中孵育 500 µl PBS，如步骤2.3所述。为评估对灭菌剂的抗性，将生物膜菌落的另一半转移至 500 µl 50% (v/v) 乙醇 
	注意：可使用其他灭菌剂，如次氯酸钠。对于所使用的各种灭菌剂，均需通过预实验确定其有效浓度及孵育时间。</li>
	<li>将生物膜菌落于室温下在实验台放置孵育10分钟。</li>
	<li>将生物膜菌落以18,000 x g离心5分钟，并 仔细地 用移液器吸除上清液。加入 300 µl PBS。</li>
	<li>使用超声波破碎仪的微探头对细胞进行温和超声处理（振幅10%，脉冲5秒）。 
	注意：超声能量必须足以分散生物膜聚集体，但过强的超声可能导致细胞裂解。使用光学显微镜预先确认所用超声能量不会引起细胞裂解，且所有聚集体均已完全分散。</li>
	<li>添加 700 µl 加入PBS至终体积为1 ml。进行系列稀释（至10）-7) 在 PBS 中分散 100 µl 在LB-1.5%琼脂平板上使用无菌玻璃珠进行3个稀释度的涂布。 
	注意：应通过预实验确定最佳稀释度，因为这取决于目标生物膜菌落中的细胞数量以及细胞对灭菌剂处理的存活率。</li>
	<li>37 °C，过夜孵育培养板 30 °C，计数CFU并确定CFU/ml。根据每个半生物膜菌落的最终CFU/ml，计算存活率百分比。 
	注意：若按所述方法进行操作与分析，对照组生物膜菌落的两半之间，以及未经处理与经乙醇处理的未用药生物膜菌落两半之间的活细胞计数差异应低于10%，分别验证菌落的对称性或抗性。 alternatively，结果也可用总CFU表示。对照组与未处理生物膜菌落的细胞计数应保持在同一数量级。相比之下，经小分子处理的生物膜菌落中乙醇处理半侧的细胞计数预期至少下降两个数量级，方可认为其对杀菌剂的敏感性增加。</li>
</ol>
3. 扫描电子显微镜用生物膜菌落样品制备
<ol>
	<li>按照步骤 1.1–1.7 和 1.12–1.14 所述方法培养生物膜菌落。</li>
	<li>在 100 mM 二甲胂酸钠、5 mM 氯化钙缓冲液（pH 7.3）中配制新鲜的 2%（v/v）戊二醛和 3%（v/v）多聚甲醛固定液。每 8.5 cm 直径的培养皿准备 5 ml 固定液。 
	注意：戊二醛和多聚甲醛具有危害性。应在通风橱内佩戴安全防护设备操作。废弃溶液及被污染的材料应作为危险废物处理。</li>
	<li>小心地将固定液加入生物膜菌落中，避免直接滴加在生物膜表面。 
	注意：由于生物膜菌落具有疏水性，菌落会缓慢从琼脂表面脱离并开始漂浮。</li>
	<li>用 Parafilm 封口膜小心密封培养皿。在室温下置于旋转摇床上固定 2 小时，随后将培养皿转移至 4 °C 过夜。</li>
	<li>次日，使用连接真空泵的巴斯德玻璃吸管小心移除液体。</li>
	<li>小心加入 10 ml 100 mM 二甲胂酸钠、5 mM 氯化钙缓冲液以洗涤生物膜，孵育 5 分钟。用巴斯德玻璃吸管从培养皿角落轻轻吸去液体，避免损伤生物膜，再通过轻柔吹打加入新鲜洗涤液。重复此步骤一次。</li>
	<li>对生物膜菌落进行脱水处理，按以下步骤操作：ddH2O 中处理 2 次，每次 5 分钟；30% 乙醇中处理 2 次，每次 20 分钟；50% 乙醇中处理 2 次，每次 20 分钟；70% 乙醇中处理 2 次，每次 20 分钟；96% 乙醇中处理 2 次，每次 20 分钟；100% 乙醇中处理 2 次，每次 30 分钟。
	<ol>
		<li>每 8.5 cm 直径的培养皿在每一步中加入 15 ml 液体，并在每次孵育后小心移除液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用以下两种方法之一对乙醇中的样品进行干燥。
	<ol>
		<li>乙醇中空气干燥法：
		<ol>
			<li>将一张直径为 9 cm 的纤维素滤纸剪成四等份。将其中一份短暂浸入 100% 乙醇中，然后小心地将一个漂浮的生物膜菌落转移至该滤纸上。将湿润的滤纸放入内衬滤纸的培养皿中，盖上皿盖，在通风橱中静置过夜使生物膜菌落自然干燥。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用二氧化碳（CO2）作为过渡流体进行临界点干燥（CP 干燥）：
		<ol>
			<li>将临界点干燥仪腔室填充 75% 体积的 100% 乙醇。将样品转移至样品架中，每个样品置于独立腔室内。如有需要，可用剪刀将生物膜剪成更小的片段。所有操作过程中应始终保持样品浸没于乙醇中。随后将样品架放入腔室并紧密关闭。</li>
			<li>将腔室冷却至 7 °C 并启动搅拌。将液态 CO2 完全充满腔室。在 7 分钟的孵育时间内，使乙醇与 CO2 充分混合。然后排出 25% 的溶液。 
			注意：切勿将腔室排空至样品液面以下。</li>
			<li>重复步骤 3.8.2.2 四次。</li>
			<li>仅以 5 分钟孵育时间重复步骤 3.8.2.2 五次。最终应完全以 CO2 替代乙醇。</li>
			<li>在最后一次循环中，仅排出 5% 的腔室内容物。关闭搅拌和冷却系统，开始加热腔室至 42 °C。当温度达到 31.1 °C、压力达到 73.9 bar 时，液态 CO2 达到临界点，此时气相密度与溶剂液相密度相同27。当温度升至 42 °C 后，继续孵育 10 分钟。在 42 °C 时，腔室内的 CO2 处于超临界气态。 
			注意：需持续监测腔室压力。在 42 °C 时，压力不得超过 120 bar。</li>
			<li>在持续加热的同时缓慢释放气体。此过程可使样品保持在 CO2 气相中，避免因液体表面张力导致样品形貌变形。通过精细调节流量控制阀，将流量计设定为 5 L/hr。待腔室内压力完全释放后，打开腔室并小心从样品架上取出样品。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在电子显微镜样品台表面贴上碳导电胶带。使用镊子小心地将生物膜菌落转移至样品台上。使用碳胶带在每个菌落与样品台之间建立细小的连接桥，这对于在电子束照射下消除电荷积累至关重要。此阶段应小心操作生物膜菌落，因其极为脆弱。将样品置于干燥器中至少保存 24 小时，或直至进行观察。</li>
	<li>在使用扫描电子显微镜观察当天，将生物膜菌落在金-钯溅射镀膜仪中以 60° 角度溅射镀膜 2 分钟。重复此步骤两次，每次之间将样品旋转 120°。最后，从正上方对样品进行一次 3 分钟的溅射镀膜。约 20 nm 厚的金-钯镀层可提高样品导电性，并增强扫描电镜成像时的对比度。</li>
	<li>将样品保存在干燥器中，以防止样品在扫描电子显微镜29,30成像前重新吸水28。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Bacillus subtilis 在液体（菌膜）和固体培养基（菌落）中均能形成坚固且高度有序的生物膜。因此，它是用于表征特定生物膜抑制剂作用机制的理想模式生物。在固体培养基上，细胞会形成具有明显特征的多细胞结构，例如从中心向边缘辐射的皱褶，而这些特征在菌膜中并不明显。因此，菌膜和菌落是研究 B. subtilis 多细胞性的互补体系。
本研究的目标是建立一种用于抑制生物膜（菌膜和菌落）的 B. subtilis 模型系统。为确保生物膜干扰实验的可重复性，多个步骤至关重要。首要的关键步骤是确认所观察到的对生物膜形成的抑制效应并非源于测试化合物对浮游生活方式细菌的普遍毒性。可通过比较特定浓度的小分子抑制剂对生物膜形成的相对抑制作用与其对浮游生长的影响来评估这一点。若该分子对生物膜发育的抑制作用显著强于对浮游生长的作用，则有助于识别出特异性参与生物膜发育的靶向机制。此外，本研究所述内容表明，前培养条件对菌膜的形成及其对小分子的敏感性具有重要影响。在表征小分子作用之前，应首先确立可重复且稳定的实验条件（例如，菌膜生长...

多细胞细菌群落在自然环境和人为环境中均发挥着重要作用，可能有益，也可能极具危害性。这些多细胞菌落被称为生物膜，其中单个细胞被包裹在自身产生的胞外聚合物基质（EPS）中。EPS 能使细胞牢固地附着于其定植的表面，起到抵御机械和化学作用力的屏障作用，并促进相邻细胞之间的紧密接触，从而有利于细胞间通讯1。生物膜可被视为一种具有分化的群落，其中细胞通过高度调控且协调有序的过程，来协调群落内部乃至不同物种之间的活动2-5。从浮游、自由生活的生长模式转变为生物膜状态的过程通常与发育过程相关。一个典型的例子是革兰氏阳性土壤细菌 Bacillus subtilis，因此其非驯化菌株被广泛用作研究生物膜形成发育阶段的可靠模式生物。在这种细菌中，可运动的细胞会自组织形成显著的多细胞结构，以执行特定功能4。其中一类细胞为基质生成细胞，可分泌胞外多糖6、淀粉样蛋白 TasA7,8 以及表面疏水性蛋白 BslA9,10；这些成分均参与 EPS 基质的组装11-13。
鉴于生物膜在自然环境和人为环境中广泛存在，且可能造成致命性损害，因此迫切需要寻找防止其形成的方法。小分子抑制剂有助于发现参与生物膜形成的新的调控通路、酶和结构蛋白，从而促进对多细胞群体组装这一复杂过程的理解。由于B. subtilis是研究生物膜形成的经典模式生物14,15，可用于评估各种生物膜抑制剂的作用效果。本研究聚焦于四种基本方法，这些方法对于评价生物膜对小分子抑制剂的响应至关重要。首先，为了确保这些抑制剂的作用靶点具有生物膜特异性，必须将抑制剂对浮游生长的影响与对生物膜形成的影响区分开来。大多数抗菌剂主要靶向细胞的浮游生长阶段，而能够靶向生物膜生活方式的分子则较为罕见。此外，那些不影响浮游生长的分子通常不具有毒性，因而可降低有利于抗生素耐药突变体产生的选择压力16。例如，当使用D-氨基酸或某些其他干扰细胞壁的分子处理生物膜时，生物膜结构会被破坏或解体，但这些抑制剂对浮游生长的影响较轻微12,17。相反，许多抗生素会显著抑制浮游生长，但对生物膜形成几乎没有或完全没有影响17。
其次，建立一个稳定且可重复的实验体系来研究小分子的作用至关重要。我们观察到，小分子抑制剂的活性浓度范围对预培养条件以及用于研究这些小分子抑制剂作用的实验设置较为敏感。已有多种报道，特别是针对B. subtilis的研究，揭示了D-氨基酸抑制菌膜（即漂浮的细菌生物被膜）形成时其有效浓度范围存在差异12,17-19。本文结果表明，以下因素可解释活性浓度范围的差异：预培养条件（对数生长期12,17与后期稳定期20）、预培养所用培养基（富集型、非定义型培养基[如LB培养基]与定义型培养基[如谷氨酸钠-甘油培养基，MSgg]）、接种比例，尤其是接种前是否去除预培养培养基。静态菌膜生长温度对本研究中代表性D-氨基酸小分子抑制剂D-亮氨酸的活性范围影响相对较小。
最后，当生物膜经过特定的生物膜抑制剂处理后，需要采用可靠且信息丰富的手段来表征这些抑制剂对生物膜适应性的影响。本文详细描述了两种可独立评估小分子抑制剂作用的方法：（1）评估抑制剂对生物膜菌落内单个细胞及其对抗抗菌剂能力的影响。与游离生长的细菌相比，生物膜中的细胞通常对抗生素具有更强的耐受性21-23。尽管这一现象由多种因素共同导致，但胞外多糖（EPS）限制抗生素渗透的能力常被视为一个合理的解释24。该方法用于评估已形成的生物膜细胞在接触抗菌物质后的存活情况。（2）评估抑制剂对生物膜菌落结构从宏观到微观尺度的影响。生物膜菌落的特征在于其三维结构以及胞外多糖（EPS）的存在。通过扫描电子显微镜，可从较大尺度（mm）到较小尺度（µm）观察细胞形态、生物膜菌落结构以及EPS的结构特征和丰度变化。

<table><tbody><tr><td>LB培养基，Lennox</td><td>Difco</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>细菌琼脂</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾&amp;nbsp;</td><td>Sigma，136.09 g/mol</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific，174.18 g/mol</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>3-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-吗啉代)丙磺酸</td><td>Fisher Scientific，209.27 g/mol</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁&amp;nbsp;</td><td>Merck，203.30 g/mol&amp;nbsp;</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>无水氯化钙</td><td>J.T. Baker，110.98 g/mol</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>四水合氯化锰(II)</td><td>Sigma，197.91 g/mol</td><td>31422-250G-R</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化铁(III)&amp;nbsp;</td><td>Sigma，270.30 g/mol</td><td>F2877-500G</td><td></td></tr><tr><td>无水氯化锌&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics，136.29 g/mol</td><td>424592500</td><td></td></tr><tr><td>盐酸硫胺</td><td>Sigma，337.27 g/mol</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-色氨酸</td><td>Fisher Scientific，204.1 g/mol</td><td>BP395-100</td><td></td></tr><tr><td>L-苯丙氨酸</td><td>Sigma，165.19 g/mol</td><td>P5482-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-苏氨酸</td><td>Sigma，119.12 g/mol</td><td>T8625-100G</td><td></td></tr><tr><td>无水甘油</td><td>Bio-Lab Itd</td><td>712022300</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸单钠盐水合物&amp;nbsp;</td><td>Sigma，169.11 g/mol</td><td>G1626-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-亮氨酸</td><td>Sigma，169.11 g/mol</td><td>855448-10G</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Gadot</td><td>830000054</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Eddison</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>圆形纤维素滤纸</td><td>Whatman，90 mm</td><td>1001-090</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>EMS (Electron Microscopy Science)，水中25%</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>EMS，水中16%</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠</td><td>Merck，214.05 g/mol&amp;nbsp;</td><td>8.2067</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Merck，147.02 g/mol&amp;nbsp;</td><td>1172113</td><td></td></tr><tr><td>铝制样品台（带槽头）</td><td>EMS</td><td>75230</td><td></td></tr><tr><td>碳导电胶带</td><td>EMS</td><td>77825-12</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 摇床</td><td>New Brunswick Scientific Innowa42</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf 台式离心机 5424</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>数字超声波破碎仪，型号 250，配双阶梯微探头</td><td>Branson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;deg;C 培养箱</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>23 &amp;deg;C 培养箱</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>过滤系统，500 ml，聚苯乙烯材质</td><td>Cornig Incorporated</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床 - Orbitron Rotatory II</td><td>Boekel</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>S150 溅射镀膜仪&amp;nbsp;</td><td>Edwards</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 临界点干燥仪</td><td>BAL-TEC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>环境扫描电子显微镜</td><td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

研究方法学 枯草芽孢杆菌 生物膜作为小分子生物膜抑制剂表征的模型

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

本研究评估了多种方法，用于分析小分子生物膜抑制剂（如D-氨基酸）对生物膜形成及其抗逆性的影响 枯草芽孢杆菌 生物膜。首先，介绍选择针对生物膜特异性靶点的小分子抑制剂的方法，以区分这些小分子抑制剂对浮游生长的影响与其对生物膜形成的影响。接着，我们关注接种条件如何影响多细胞、漂浮性聚集体的敏感性 B. subtilis 培养物对小分子抑制剂的反应差异。结果表明，诸如D-氨基酸等抑制剂在不同研究中报道的效果差异，主要是由于预培养条件不一致所致。此外，本文介绍了一种近期开发的实验方案，用于评估小分子处理对生物膜抵抗抗菌物质能力的贡献。最后，提供了扫描电子显微镜（SEM）技术，用于分析细胞及其周围胞外基质的三维空间排列情况 枯草芽孢杆菌 生物膜。扫描电镜有助于深入了解三维生物膜结构及其基质纹理。结合本文所述方法，可极大促进在有或无生物膜抑制剂条件下生物膜发育的研究，并有助于阐明这些抑制剂的作用机制。

浮膜实验是研究高度调控且动态过程的一种方法 B. subtilis 多细胞性。此外，利用单个细胞培养多孔板，可在一次实验中通过表膜检测法测试多种预培养条件或小分子浓度。然而 B. subtilis 成膜形成对预培养条件敏感（例如，预培养基的培养基成分及其生长阶段）、接种比例以及预培养基的去除。因此，我们首先筛选了一种能够重现D-亮氨酸抑制菌膜形成的实验条件。我们的结果表明，若将细胞在未定义的丰富LB培养基中预培养至对数中期生长阶段（单菌落接种于3 ml LB培养基中培养至对数中期） 37 °C 振荡培养4小时后，离心并重悬于定义明确的MSgg培养基中，随后进行1:1,000的接种（图3A）。当细胞在MSgg培养基中生长至对数中期时（将1 ml LB培养基中的单菌落培养2小时后，按1:100重新稀释至3 ml MSgg培养基中，并在37℃下培养5小时 37 °C 在200 rpm振荡培养条件下，去除预培养基对D-亮氨酸的活性没有影响。处于静止生长期的细胞（单菌落于1 ml LB培养基中培养2小时，按1:100重新稀释至3 ml MSgg培养基中，并在室...

本研究介绍了可重复方法的开发，用于研究生物膜抑制剂及其对生物膜的影响 枯草芽孢杆菌 多细胞生物性

本研究评估了多种方法，用于分析小分子生物膜抑制剂（如D-氨基酸）对生物膜形成及发育的影响。

细菌生物膜对人类健康具有重要意义，可保护其内部的细菌免受环境侵害和抗菌剂的作用。本实验的目的是建立一个模型系统，用于评估小分子抑制剂对生物膜形成的影响。这些方法有助于建立一套关键工具，使生物膜研究领域能够筛选出特异性靶向生物膜形成的抑制剂。这些方法的主要优势在于，它们基于一个一致且稳健的实验框架，能够对生物膜特异性抑制剂的作用机制提供定量和定性的深入分析。尽管这些方法可用于研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的生物膜，也可应用于其他形成生物膜的细菌，例如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）或植物病原菌柑橘黄单胞菌（Xanthomonas citri）。扫描电子显微镜对于分析小分子对生物膜形成的影响至关重要，因为它能够观察胞外基质，并提供单细胞分辨率。首先，挑选一个合适的单菌落，将其转移至3 mL的LB肉汤培养基中。将该初始培养物置于37摄氏度的摇床培养箱中培养4小时。培养结束后，取1.5 mL初始培养物，以4分钟离心处理。小心移除上清液，然后将沉淀重悬于 1.5 毫升 MSgg 培养基中。为培养菌膜，准备一个 12 孔细胞培养板，每孔加入 3 毫升 MSgg 培养基。向其中部分孔中加入含有小分子抑制剂的 MSgg 培养基，设置不同浓度梯度，并将不同浓度的处理组在培养板上均匀分布，以避免边缘效应。测量重悬的起始培养物在600纳米处的光密度。培养物的光密度值应在0.6至1.0之间。这对系统的稳健性至关重要。向培养板的每个孔中接种3 µL重悬的起始培养物。随后，在23 °C条件下静置培养三天。之后，从培养箱中取出培养板，观察菌膜形成情况。为了培养生物膜，使用模板在8.5厘米干燥的1.5% MSgg琼脂平板上对称地点加四滴未洗涤的起始培养物，每滴1.5微升。待液滴完全渗入培养基后，再移动平板。将平板置于30°C条件下孵育三天。使用双目显微镜并在光照均匀的条件下，检查生物膜菌落是否已发育并形成三维皱褶结构。首先，取一把洁净的剃刀刀片，在模板的辅助下将生物膜菌落切成大小相等的两半。用洁净的刮勺小心地挑起其中一半菌落，并转移至含有 500 微升 PBS 的 1.5 毫升微量离心管中。取菌落的另一半，转移至含有500 µL 50%乙醇的微量离心管中。这些样品将用于评估对消毒剂的抗性。随后，同样取D-赖氨酸处理的菌落前半部分，放入PBS中。然后，取该菌落的另一半，转移至乙醇中。将含有生物膜两半部分的所有试管在室温下孵育10分钟，随后在18,000 × g 条件下离心5分钟。使用移液器小心吸去上清液。加入 300 微升 PBS，然后用微探头超声仪在低功率条件下对细胞进行超声处理。再加入 700 微升 PBS，使最终体积为 1 毫升。接下来，在 PBS 中进行 10 的负 7 次方的系列稀释。取其中一种稀释液 100 微升，接种至含 1.5% 琼脂的 LB 培养皿中。每份样品另选两种稀释度重复此步骤。使用玻璃珠涂布接种物，然后在30摄氏度下倒置培养平板过夜。观察平板并计数菌落形成单位（CFU）。计算每毫升的CFU数值后，进一步计算PBS处理组与乙醇处理组中存活菌的比例百分比。开始样品固定时，首先为所需数量的生物膜菌落配制足量的新鲜固定液。向每个培养皿中小心加入 5 毫升固定液，避免将液体直接吹打到菌落上。菌落将开始从琼脂表面脱离并漂浮起来。用封口膜仔细密封培养板，在室温下于旋转摇床上孵育两小时。将培养板转移至4 °C环境中过夜保存。使用连接真空泵的巴斯德吸管轻轻移除固定液。加入10毫升含有100纳摩尔二甲胂酸钠和5毫摩尔氯化钙的缓冲液以洗涤生物膜，并孵育5分钟。使用巴斯德吸管小心地将生物膜菌落的中心部分从琼脂平板上分离。为使菌落空气干燥，将纤维素滤纸剪成四等份，然后将其中一份浸入100%乙醇中。小心地将一个漂浮的生物膜菌落转移到滤纸上。将滤纸放入铺有干燥滤纸的培养皿中。然后盖上培养皿，置于化学通风橱中过夜干燥。为了保持生物膜菌落的形态，必须用纤维素纸完全托住漂浮的生物膜。一旦将生物膜置于纸上，便不能再进行调整。先在电子显微镜载台表面涂上导电碳胶带，然后使用镊子小心地将生物膜菌落转移至载台上。通过添加一条细小的导电胶带将每个菌落连接到样品台后，将样品台置于干燥器中保存24小时，或保存至需要使用时。此步骤需要操作者手部稳定且精准，因为在此阶段生物膜非常脆弱，容易破裂。挑战在于将生物膜的大部分完整固定，同时避免产生裂纹。在检查当天，将菌落放入金-钯溅射镀膜仪中。以60度角对样品镀膜两分钟。重复此步骤两次，每次之间将样品旋转120度。最后，从上方对样品进行一次三分钟的镀膜处理。样品现已准备好用于扫描电镜成像。这些图像显示了在生物膜诱导型MSgg培养基中培养的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的菌膜形成情况。加入小分子抑制剂D-赖氨酸后，菌膜的形成受到抑制。随着抑制剂浓度的增加，菌膜的形成呈现相应的减少趋势。该图显示了经D-赖氨酸抑制剂处理或未处理的生物膜菌落中细胞在乙醇暴露下的存活情况。经D-赖氨酸处理并暴露于50%乙醇10分钟的菌落，其存活率较未经处理组显著降低。自上而下的双目显微图像显示，在D-赖氨酸存在条件下生长的菌落整体较小，且形成的皱褶不如未经处理的菌落明显。临界点干燥生物膜菌落的扫描电子显微镜图像进一步揭示了生物膜发育的改变。胞外聚合物基质（EPS）在未经处理的样品中呈现出类似蜘蛛网的结构，而在经过处理的样品中则显示出较少的有序性。最后，在单个细菌细胞分辨率下的观察显示，经处理的细胞在形态上更长，EPS 覆盖较少，且与邻近细胞的连接不如未经处理的细胞紧密。在进行该实验操作时，必须牢记建立一致的研究框架以评估生物膜抑制剂对于获得可重复的实验结果至关重要。一旦掌握，若操作得当，小分子化合物抑制生物膜形成的筛选可在不到一周的时间内完成。通过遵循本实验方案，还可进一步开展其他方法，例如单个生物膜细胞中基因表达的研究，以深入了解小分子抑制剂的作用靶点。观看本视频后，您应能够充分理解如何分析特定生物膜抑制剂对生物膜形成及抗生素耐药性所产生的整体影响。

methodologies-for-studying-b-subtilis-biofilms-as-model-for

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

方法学研究<em&gt;乙。枯草</em&gt;生物膜作为模型的表征小分子抑制剂生物膜

来源：Tay, S. B., et al. 利用工程化群体感应淬灭乳糖酶实现对致病性生物膜的抗毒力破坏。J. Vis. Exp.

量化酶诱导的病原菌生物膜抑制作用

来源：Tay, S. B., et.al. 利用工程化群体感应淬灭乳糖酶实现对致病性生物膜的抗毒力破坏。 J. Vis. Exp.

酶介导抑制生物膜形成的显微评估

来源：Bucher, T., 等. 以B. subtilis生物膜为模型研究小分子生物膜抑制剂的方法学。J. Vis. Exp. (2016)本视频演示了一种利用枯草芽孢杆菌（Bacillus...

评估抑制剂对菌膜形成的影响 枯草芽孢杆菌

来源： Bucher, T., 等．用于研究枯草芽孢杆菌生物膜以表征小分子生物膜抑制剂的方法学．J. Vis. Exp.

评估生物膜基质完整性的乙醇抗性检测

来源：Bucher, T., et. al., 利用枯草芽孢杆菌生物膜模型研究小分子生物膜抑制剂的方法学。J. Vis.

用于形态学分析的细菌生物膜菌落制备

群体感应淬灭酶是一种抗毒力和抗细菌的策略，可通过抑制毒力因子以及与抗生素耐药性和生物膜形成相关基因的表达，在不引发耐药性风险的情况下减轻病原性。在本研究中，我们报告了一种方法，用于验证群体感应淬灭酶在细菌生物膜破坏中的有效性。...

利用工程化群体感应淬灭乳糖酶抗毒力破坏致病性生物膜

大多数细菌感染都会形成生物膜。由于其所处的环境，与生物膜相关的细菌通常在表型上具有耐药性。因此，开发能够杀灭生物膜中细菌的新型抗菌分子成为当务之急。我们建立了一种检测方法，用于快速筛选可有效清除生物膜的抗菌化合物。...

使用基于刃天青的药物敏感性检测靶向生物膜相关Staphylococcus aureus

生物膜感染对化学治疗表现出高度耐受性。单一检测方法无法全面反映生物膜的复杂性，因此需要采用多种互补的检测手段。我们介绍一种针对金黄色葡萄球菌（S.

适用于天然化合物库筛选的抗生物膜检测平台

天然产物是开发新药和治疗剂的有前景的起点。然而，由于化学多样性高，从植物中发现新的治疗化合物是一项具有挑战性且耗时的任务。我们描述了一种简化的方法，用于从植物提取物和组分中鉴定抗菌和抗生物膜分子。...

从植物提取物和组分中系统筛选新型抗菌及抗生物膜分子以预防龋齿

本方案介绍了利用自组装深孔PCR板装置进行生物膜生长及生物量测定的方法，适用于高通量96孔带钉盖静态生物膜筛选。...

利用PCR板深孔微孔板装置生成更多的细菌生物膜生物量

本方案描述了一种结合静态与动态方法的策略，用于评估有机过氧酸在消除乳制品行业中生物膜方面的功效。该方法也可用于测试新型生物或化学制剂在控制生物膜方面的有效性。...

评估结合静态与动态方法的有机过氧酸在清除乳制品生物膜中的功效

了解利用枯草芽孢杆菌生物膜模型评估小分子抑制剂的方法。本研究建立了可重复的实验框架，通过扫描电镜分析生物膜形成机制，为开发抗生物膜治疗策略提供定量与定性依据。

研究方法学枯草芽孢杆菌生物膜作为小分子生物膜抑制剂表征的模型

探索更多视频

研究方法学 枯草芽孢杆菌 生物膜作为小分子生物膜抑制剂表征的模型

探索更多视频

研究方法学枯草芽孢杆菌生物膜作为小分子生物膜抑制剂表征的模型