在三维肝模型中研究人肝细胞癌细胞系HepG2再增殖的病毒载体

本实验的总体目标是构建一种三维肝脏模型，用于研究病毒及病毒载体。该方法能够在具有血管化结构的三维系统中，利用人类细胞研究生物学过程，而这些人类细胞的生理特性与小鼠或大鼠模型中的啮齿类动物细胞存在差异。此外，该方法有助于改善动物福利，因为它避免了对活体动物进行实验，并且从长远来看，旨在完全取代动物成分。

尽管我们开发此方法旨在研究用于基因转移的病毒载体，但它也可应用于感染性活病毒的研究以及其他研究领域，如癌症研究。本次实验操作将由本实验室的技术员 Viola Rohrs 演示。出于动物福利的考虑，本研究仅使用了因其他动物实验而被处死后的多余动物，即

获取肝脏支架无需额外使用动物。首先，将1500万个Hep G2肝细胞系细胞接种至含有30毫升培养基的T175培养瓶中，培养基中包含10%胎牛血清以及2毫摩尔的谷氨酰胺、青霉素和链霉素。培养四天后，在培养条件下使用胰蛋白酶溶液处理五分钟，使细胞脱落，随后收集细胞。

然后以300 ×g离心细胞3分钟。再将细胞重悬于4 mL PBS中，并进行细胞计数。每瓶应获得约4500万个细胞。

再细胞化一个大鼠肝脏细胞外基质（ECM）需要6亿个细胞。为了再细胞化该ECM，首先设置包含肝脏灌注室、灌注系统、培养基储液器和气泡捕集器的生物反应器系统。再细胞化过程有两个关键步骤。

一是要避免在灌注系统中产生气泡。二是整个系统必须保持无菌。首先，将生物反应器系统的这些组件在121摄氏度下灭菌15分钟。

其次，用培养基填充管路和已灭菌的灌注室。然后将脱细胞大鼠肝脏支架放入肝脏灌注室中。下一步是使用管夹将插管的门静脉连接到灌注系统。

现在将生物反应器系统放入培养箱中，并将其连接至蠕动泵。接下来，用150毫升的完全培养基对支架进行5天的平衡处理，流速设定为1.25毫升每分钟。

五天后，将生物反应器系统与泵断开，并转移至无菌操作台。将肝支架与培养基循环系统断开。然后用含有3亿个Hep G2细胞的5毫升培养基充满注射器，通过门静脉注入细胞，注意避免产生气泡。

然后停止运行泵，让细胞在细胞外基质中重新定植一小时。一小时后，以每分钟1.25毫升的流速启动泵。10分钟后，将流速提高至每分钟2.5毫升。

再过 20 分钟后，将泵速调至 3.75 毫升/分钟的工作速度。在全速泵送 30 分钟后，关闭泵，再加入 3 亿个细胞，并让细胞在 ECM 中定植 1 小时。1 小时后，像之前一样通过逐步调节泵速逐渐增加循环。

现在让细胞在两周内重新定植肝脏。每隔一天更换 50 毫升培养基，并从用过的培养基样品中检测生理参数。AAV 载体的制备是一个涉及多个步骤的复杂过程，这些步骤在文本方案中进行了总结。

在本段视频中，将演示一些关键步骤。首先，制备、纯化并定量AAV载体。简而言之，使用旋转瓶生产AAV载体，并通过碘克沙醇梯度离心法进行纯化。

通过PD10凝胶过滤柱过滤去除残留的碘克沙醇。然后以基因组AAV DNA为标准品，采用定量PCR（QPCR）测定AAV载体浓度。每种模型需要总共27万亿个AAV载体。

现在对肝脏模型进行转导。首先，将27万亿个载体溶于5毫升磷酸盐缓冲液中，并加入注射器内。可按每毫升5微克的浓度加入酚红。

然后将肝脏从培养基循环系统中断开，并向系统中注射载体。注射后，在不泵送的情况下孵育系统一小时。随后按照先前所述逐步增加流速。

随后，将转导后的肝脏在六天内进行孵育，每隔一天更换 50 毫升培养基。使用手术刀从每个肝叶切取厚度约半厘米、长度 1.5 至 2 厘米的组织样本。将组织切片置于含 4% 多聚甲醛和 4% 蔗糖的溶液中，在 4 摄氏度下孵育 90 分钟。

然后用 PBS 洗涤样品，每次 1 分钟，共洗涤 3 次。洗涤后，将样品在 4°C 条件下于 8% 蔗糖中孵育过夜。次日，将样品加入含有固定介质的冷冻模具中。

避免引入任何气泡。加样后，用固定液完全覆盖样品，并置于零下80摄氏度环境中。待样品完全冻结后，使用冷冻切片机从样品中制备10微米的冷冻切片。

根据需要对样本进行染色以确认再细胞化。进行基因表达分析时，使用四毫米活检打孔器取样。为评估再细胞化，对冷冻切片进行苏木精和伊红染色。

两个经转导的肝脏和一个未转导但重新接种细胞的对照肝脏的叶段均重新植入了Hep G2细胞。从每种肝脏模型的28个穿刺活检样本中定量分析了RNA表达水平和载体滴度。在两个经转导的肝脏模型中，检测到每个细胞分别含有55和90个载体基因组，该载体含量足以诱导基因沉默。

对照组中未检测到基因组，符合预期。通过RT-PCR和蛋白质印迹法分析EmGFP的表达。大多数活检样本显示出EmGFP的mRNA表达和蛋白表达。

冷冻切片的免疫染色显示，在模型成功再细胞化的区域，均可观察到EmGFP表达，这表明AAV基因表达良好。接下来，通过定量RT-PCR分析了AAV介导的人源亲环素B的敲低效果。

在两个转导肝脏的所有叶中，人环孢素B的平均敲低效率为70%至90%。该技术建立后，为研究人员研究病毒及病毒载体在具有血管化的三维器官系统中的分布奠定了基础。此类研究将有助于改进现有的基因转移技术，并推动新型抗病毒策略的开发。