Name: 研究病毒载体在三维肝模型重新填充与人肝癌细胞株HepG2 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 了解利用HepG2细胞在三维肝脏模型中进行病毒载体研究的方法。该技术通过脱细胞大鼠肝脏支架重建人源化肝组织，为基因转移和病毒学研究提供替代动物实验的体外模型。

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作者感谢Bernd Krostitz提供的技术支持，Radoslaw Kedzierski对本项目的初期贡献，Erik Wade的校对及提出的宝贵意见，以及Heike Walles教授提供生物反应器并分享其在器官脱细胞方面的宝贵经验。我们还感谢柏林工业大学对本项目及论文发表提供的经费支持。

注意：R.L. 已获得Landesamt für Gesundheit und Soziales（LaGeSo）关于器官离体的伦理批准。肝脏取自Wister大鼠。通过22 G套管插管下腔静脉和门静脉。此前已有文献描述离体肝脏脱细胞的方法4,5。本研究所用的细胞外基质通过用1%脱氧胆酸钠对大鼠肝脏进行大量灌注获得。
1. 大鼠肝脏细胞外基质（ECM）的再细胞化
<ol>
	<li>肝细胞系 HepG2 的扩增
	<ol>
		<li>在添加了10%胎牛血清、2 mM 谷氨酰胺以及各2 mM 青霉素和链霉素的 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基中培养肝细胞癌细胞系 HepG2。</li>
		<li>将 1.5 × 107 个细胞接种于 T175 培养瓶中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。培养4天后，在 37 °C、5% CO2 条件下用胰酶消化5分钟收集细胞。</li>
		<li>以 300 × g 离心沉淀细胞，用 4 ml PBS 重悬，并在显微镜下使用血细胞计数板进行细胞计数。每个 T175 培养瓶可获得约 4.5 × 107 个细胞。 
		注意：确保培养的细胞数量足以用于大鼠肝脏 ECM 的再细胞化，每份 ECM 需要 6 × 108 个 HepG2 细胞（即 10 个 175 cm2 培养瓶，每瓶含 4–5 × 108 个细胞）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="器官灌注系统设置；器官保存分析；离体实验设备。" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 生物反应器系统。 A) 该生物反应器系统为定制装置，可维持器官模型处于37 °C和5% CO2环境中。蠕动泵的流速可单独调节。 B) 肝脏被放置于培养室中，并连接至灌注回路，该回路由蠕动泵、培养基储液器、气泡捕获装置和压力传感器组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>ECM 的再细胞化
	<ol>
		<li>设置生物反应器系统，包括肝脏灌注室、灌注系统、培养基储液器和气泡捕获装置。对生物反应器系统进行灭菌处理（121 °C，15 分钟）。</li>
		<li>将生物反应器系统与蠕动泵连接，并置于提供适宜条件的培养箱中（37 °C，5% CO2）。将去细胞化的大鼠肝脏支架8放置于生物反应器系统的肝脏灌注室内（图 1）。</li>
		<li>使用管夹将插管的门静脉和下腔静脉连接至灌注系统。以 1.25 ml/min 的流速，用 150 ml RPMI 培养基（如步骤 1.1 所述）对支架进行 5 天的平衡灌注。</li>
		<li>将肝脏支架从培养基回路中断开，通过门静脉使用 5 ml 注射器接种 3 × 108 个 HepG2 细胞（溶于 5 ml 培养基中），避免产生气泡，并在关闭泵的情况下孵育 1 小时，使细胞在 ECM 中重新定植。</li>
		<li>通过调节泵逐步增加流速：先以 1.25 ml/min 运行 10 分钟，再以 2.5 ml/min 运行 20 分钟，最后以 3.75 ml/min 运行 30 分钟。</li>
		<li>重复步骤 1.2.4–1.2.5，使总细胞数达到 6 × 108。</li>
		<li>以 3.75 ml/min 的流速持续运行生物反应器系统，培养再细胞化的大鼠肝脏共 2 周。 
		注意：每隔一天更换三分之一的新鲜培养基（50 ml）。取样培养基以测定生理参数，如乳酸脱氢酶活性、培养基样品的 pH 值以及葡萄糖和乳酸的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大鼠再细胞化肝脏的转导
<ol start="1">
	<li>腺相关病毒载体的大规模生产
	<ol>
		<li>按照先前所述方法生产、纯化并定量腺相关病毒载体：11
		<ol>
			<li>简言之，在滚瓶中生产腺相关病毒载体，并通过碘克沙醇梯度离心法进行纯化。使用PD10凝胶过滤柱过滤以去除残留的碘克沙醇。以基因组腺相关病毒DNA作为标准品，通过qPCR测定腺相关病毒载体浓度。 
			注意：本研究中使用的自互补假型AAV2/6载体编码EmGFP作为报告基因以展示转导效率，同时包含一个shRNA表达盒用于敲低内源性表达的基因（人亲环素B（hCycB），图2）。确保获得足量的6型假型自互补腺相关病毒载体（每肝模型2.7 × 1013 个腺相关病毒载体）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="基因编辑；CMV Pro, EmGFP；载体图谱示意图；质粒设计，表达分析。" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 本研究中使用的自互补假型 AAV2/6 载体的图谱。 该基因组包含 AAV2 的反向末端重复序列（ITR），并在 CMV 启动子控制下编码 EmGFP，同时在 U6 启动子控制下编码一段 shRNA。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>肝脏模型的转导
	<ol>
		<li>通过加入相应体积的 PBS，将 AAV 载体溶液调整至最终浓度为 5 ml 中含 2.7 x 1013 个载体基因组。</li>
		<li>移除套管上的管路，将肝脏与培养基循环系统断开。将一个 5 ml 注射器连接至门静脉套管，并注入全部 AAV 载体溶液（5 ml）。 
		注意：可选地，可在溶液中添加酚红（5 µg/ml），以追踪 AAV 载体溶液在肝脏中的分布情况。</li>
		<li>在无泵流条件下孵育 1 小时。逐步增加流速：先以 1.25 ml/min 持续 10 分钟，再以 2.5 ml/min 持续 20 分钟，最后以 3.75 ml/min 持续 30 分钟。将再细胞化的 大鼠肝脏继续培养 6 天。 
		注意：参照第 1.2.7 步注释中的说明，更换三分之一的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 转导大鼠肝脏再细胞化的评估
<ol start="1">
	<li>苏木精-伊红（HE）染色与免疫组织化学分析
	<ol>
		<li>使用手术刀从每个肝叶取样（0.5 × 0.5 × 1.5–2 cm）。</li>
		<li>将样品（来自步骤3.1.1）在4%多聚甲醛（PFA）+ 4%蔗糖溶液中于4 °C孵育1.5小时。（注意：PFA具有毒性且为致癌物。操作时务必在通风橱内进行，并穿戴适当的防护服。）用PBS洗涤三次（每次洗涤1分钟），然后在4%蔗糖溶液中于4 °C过夜孵育。</li>
		<li>将固定介质倒入塑料冷冻模具中，将样品置于无气泡的固定介质中。加入足够量的固定介质以完全覆盖样品。将包埋的样品储存在-80 °C，直至后续使用。</li>
		<li>使用冷冻切片机12制备冷冻切片（10 µm）。通过苏木精+伊红染色8评估再细胞化情况。通过针对目的基因（此处为EmGFP）的免疫组织化学染色评估转导效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分子生物学取样
	<ol>
		<li>使用活检打孔器（直径4 mm）对每个肝叶取样。根据试剂盒说明书提取总RNA、DNA和蛋白质，用于检测EmGFP的转基因表达以及hCycB基因的敲低效果8。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+and+spheroid+culture+of+human+liver+hepatocellular+carcinoma+cell+line+cells+demonstrate+distinct+global+gene+expression+patterns+and+functional+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes.</a> Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).</li>
<li>Butler, D., Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientists+in+the+dark+after+French+clinical+trial+proves+fatal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal.</a> Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).</li>
<li>Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+penetrate+human+solid+tumor+tissue+in+vivo+more+effectively+than+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394(2011).</li>
<li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+Decellularization+of+Rat+Livers+in+an+Oscillating-pressure+Perfusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device.</a> J. Vis. Exp. (102), e53029(2015).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).</li>
<li>Yagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-scale+whole-organ+bioengineering+for+liver+transplantation%3A+a+regenerative+medicine+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach.</a> Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).</li>
<li>Wagner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+three-dimensional+humanized+liver+model+for+the+study+of+viral+gene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors.</a> J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).</li>
<li>Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+gene-based+therapies%3A+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).</li>
<li>Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endgame%3A+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li>
<li>Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+quantification+of+adeno-associated+virus+vectors+for+RNA+interference+applications+using+quantitative+polymerase+chain+reaction+and+purified+genomic+adeno-associated+virus+DNA+as+a+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard.</a> Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).</li>
<li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissected+region-specific+gene+expression+analysis+with+methacarn-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+by+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR.</a> J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的重建三维肝脏为在人源化系统中研究病毒载体提供了一种模型。利用人肝细胞癌细胞系重建造大鼠肝脏的细胞外基质，可生成具有血管化的系统，从而允许对大分子生物制剂进行研究。这些结果证明了该重建肝脏模型可被病毒载体高效转导的概念可行性。
在本实验中，肝脏的每个叶均被AAV载体转导。然而，在一些初步实验中，发现单个肝叶未被细胞充分占据。因此，防止细胞碎片或其他成分阻塞血管系统至关重要。为检测所有肝叶是否均可灌注，可通过肝脏模型灌注酚红等无毒染料进行验证。
另一个关键问题是保持肝脏支架的无菌状态。虽然使用乙醇或抗生素处理对血管系统具有不利影响，但采用γ射线照射细胞外基质可有效保存血管结构并实现样本的灭菌。
此外，移植肝脏的大小会存在差异，因此可能需要调整用于再细胞化过程的细胞数量和再殖时间，以获得可重复的实验结果。
本研究中使用的大鼠肝脏相对较大，需要大量的细胞和检测试剂（例如，AAV 载体）。此外，再殖过程耗时超过两周，这限制了在合理工作量下可完成的重复实验次数。我们目前正在建立小鼠肝脏模型，其体积仅为大鼠肝脏的约五分之一，因而可减少细胞和检测试剂的使用量。尽管按比例减少细胞数量似乎是合理的，但确切的用量仍需通过进一步实验来确定。
当前模型的另一个不足之处在于使用了肝细胞 HepG2 细胞系。目前正在进行实验，以开发使用由诱导性多能干细胞分化而来的肝细胞，这将提供一个在生理上更具相关性的模型。此外，肝脏除了肝细胞外，还包含多种其他细胞类型，e.g.，库普弗细胞和肝窦。我们假设，当向细胞外基质（ECM）重新接种多种细胞类型时，不同类型的细胞将定植于其天然的微环境中。
3D 肝脏模型结合了多种优势。传统 in vivo 模型的一个主要缺点是动物生理学与人类生理学存在显著差异。因此，治疗人类患者时可能出现的毒性副作用可能无法被检测到。通过使用更接近人类患者生物学特征的人源细胞重建 3D 肝脏模型，可以克服这一不足。
肝脏模型的第二个优势在于其对动物福利的贡献。尽管重建实验需要使用动物组分，但该方法仍然遵循3R原则（替代、减少、优化）的目标，可利用因其他动物实验而被处死的多余动物。 即，无需额外使用动物，且该方法完全避免了常与动物实验相关的动物痛苦 体内 实验。类球体是研究三维体系中细胞过程的替代工具。然而，类球体不具备血管化结构，因此大分子物质和生物制剂无法深入渗透至其内部区域。这些问题已通过血管化的三维肝模型得以解决。
在本研究所描述的实验中，腺相关病毒（AAV）载体被作为研究对象，因为它们是基因治疗应用中最具有前景的候选载体之一。由于大量基因治疗策略旨在靶向肝脏， 例如， 用于治疗乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染，或α-1-抗胰蛋白酶缺乏症时，该3D肝脏模型可用于这些腺相关病毒（AAV）载体的开发过程。当然，它也适用于其他嗜肝病毒载体的研究。 例如腺病毒载体。此外，该模型还可用于研究感染性肝炎病毒，如乙型或丙型肝炎病毒，并可用于设计新的抗病毒策略。再者，三维器官模型是开发新型抗癌细胞毒药物及开展毒理学研究的有力工具。从长远来看，人工肝脏有望作为移植材料应用于再生医学。综上所述，三维肝脏模型在感染生物学及其他生物医学研究领域具有广泛的应用前景。

目前大多数生物医学研究依赖于两种方法之一：二维（2D）细胞培养实验或本质上为三维（3D）的动物模型。然而，这些方法存在一些严重缺陷。在2D培养条件下生长的细胞，其基因表达模式和细胞生理特性已被证明与在3D条件下培养的细胞存在差异1。动物模型除了涉及伦理问题外，通常也不能很好地模拟人体生理。尽管在首次进行人体给药前，必须通过动物模型确认化合物无明显毒性作用，但已有多个案例记录显示，在临床试验中出现了严重的、有时甚至是致命的不良反应2。
为了克服这些局限性，人源化的三维ex vivo器官模型已成为重要的研究工具。在适宜条件下培养时，细胞会自组装形成称为球状体的三维结构。然而，这些球状体缺乏血管系统，从而限制了小分子化合物、大分子生物制剂以及病毒载体的分布。例如，腺病毒载体仅能转导由人胶质母细胞瘤制备的球状体的外层细胞。3 解决这一问题的方法是使用包含血管系统的器官模型。为此，可将目标器官从动物体内取出，并用人类细胞替代动物细胞。已有多种通过去污剂或牛磺胆酸钠处理来脱细胞化动物肝脏的方法被报道。4-6 所获得的细胞外基质（ECM）含有调控多种细胞过程的细胞因子和生长因子。7 该基质可作为支架，用于接种人类细胞以重建细胞，从而获得功能性的器官模型。
在最近的一项研究中，我们使用人源化的三维肝脏模型来研究腺相关病毒（AAV）载体的分布及其外源基因的表达。8 AAV载体是目前基因治疗应用中最有前景的病毒载体之一。9 在西方世界，首个且迄今为止唯一获批的基因治疗干预手段即采用AAV载体来递送脂蛋白脂酶基因。10

<table><tbody><tr><td>培养箱</td><td>Fraunhofer</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Fraunhofer</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>带凹槽法兰</td><td>Duran</td><td>2439454</td><td>经gaffer修改</td></tr><tr><td>透明O型圈</td><td>Duran</td><td>2922551</td><td></td></tr><tr><td>快速夹钳</td><td>Duran</td><td>2907151</td><td></td></tr><tr><td>平法兰盖</td><td>Duran</td><td>2429857</td><td>经gaffer修改</td></tr><tr><td>螺纹管</td><td>Duran</td><td>2483802</td><td>经gaffer修改</td></tr><tr><td>螺纹管</td><td>Duran</td><td>2483602</td><td>经gaffer修改</td></tr><tr><td>硅胶密封圈</td><td>Duran</td><td>2862012</td><td></td></tr><tr><td>螺口盖</td><td>Duran</td><td>2924013</td><td></td></tr><tr><td>螺口盖</td><td>Duran</td><td>2924008</td><td></td></tr><tr><td>带孔螺口盖</td><td>Duran</td><td>2922709</td><td></td></tr><tr><td>带孔螺口盖</td><td>Duran</td><td>2922705</td><td></td></tr><tr><td>滤器</td><td>Sarstedt</td><td>831,826,001</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>VWR</td><td>228-1500</td><td></td></tr><tr><td>管路连接头</td><td>Ismatec</td><td>ISM556A</td><td></td></tr><tr><td>生物相容性管路</td><td>Ismatec</td><td>SC0736</td><td></td></tr><tr><td>T175培养瓶</td><td>Greiner bio-one</td><td>660 160</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0501-500</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>X0551-100</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0940-100</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>cc pro</td><td>S-10-M</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Weckert-Labortechnik</td><td>600001</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 180</td><td></td></tr><tr><td>冷冻模具 15 x 15 x 5 mm</td><td>Sakura</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>4 mm活检打孔器</td><td>pfm medical</td><td>48401</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin miRNA</td><td>Macherey &amp;amp; Nagel</td><td>740971.10</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA/DNA缓冲液套装</td><td>Macherey &amp;amp; Nagel</td><td>740944</td><td></td></tr></tbody></table>

在三维肝模型中研究人肝细胞癌细胞系hepg2再增殖的病毒载体

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

本方案描述了一种三维（3D）模型的构建方法 离体 肝脏模型及其在病毒载体系统研究与开发中的应用。该模型通过将去细胞化大鼠肝脏的细胞外基质重新接种人肝细胞系获得。该模型可在血管化的三维细胞系统中开展研究，替代可能对活体动物造成伤害的实验。另一优势在于该模型具有人源化特性，相较于动物模型更接近人体生理状态。
在本研究中，我们展示了利用腺相关病毒（AAV 载体）衍生的病毒载体对这一肝脏模型进行转导。为三维肝脏模型提供培养基的灌注回路可便捷地施加该载体。该系统允许监测肝脏的主要代谢参数。在最终分析时，可采集组织样本，通过组织学技术评估再细胞化的程度。病毒载体的分布情况以及所递送的外源基因的表达水平可通过定量 PCR（qPCR）、Western 印迹和免疫组织化学进行分析。该载体模型在基础研究及基因治疗应用开发中具有广泛的应用前景，包括新型抗病毒药物的研发、癌症研究以及病毒载体及其潜在副作用的研究。

为了评估再细胞化的程度，从每个再细胞化肝脏模型的每个叶制备冷冻切片，并通过苏木精和伊红染色进行分析。如图3所示，三个肝脏模型的各个叶（分别标记为TLM1、TLM2（转导肝脏模型1和2）以及Ctrl（再细胞化但未转导的对照肝脏模型））均已被HepG2细胞重新填充。该肝细胞癌细胞系源自一名15岁阿根廷男孩的肿瘤组织。部分区域的再细胞化程度较其他区域更为密集，其原因仍有待确定。
<img alt="比较TLM1、TLM2和对照组在各肺叶的组织学肺组织分析示意图，200 μm比例尺。" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 三种分析肝脏模型中每个肝叶的苏木精和伊红染色结果。 TLM1+2：转导肝脏模型1和2；Ctrl.：重新细胞化的对照肝脏模型，但未进行转导。比例尺：200 µm。（经参考文献8许可重印。） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
接下来，评估了肝模型的转导效果。为此，从每种肝模型的28个穿孔活检样本中提取DNA，并通过qPCR定量测定载体滴度。两种转导肝模型平均每细胞分别检测到55和90个内化载体基因组（VG/cell）。二维细胞培养实验表明，每细胞30个载体基因组足以实现较强的外源基因表达及RNA干扰介导的基因沉默。通过RT-PCR和Western blotting分析EmGFP的表达。事实上，在mRNA和蛋白水平上，分别在80–90%的活检样本中检测到报告基因的表达8。为了全面了解转导效率，对冷冻切片进行了免疫组织化学分析。如图4所示，经DAPI染色显示成功再细胞化的肝模型区域，在EmGFP表达的免疫组织化学分析中也呈现出强烈的荧光信号。正如预期，未经AAV载体处理的对照肝模型未显示任何EmGFP表达。
<img alt="荧光显微镜图像；组织样本；TLM1、TLM2、对照；蛋白表达分析。" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. EmGFP表达的免疫组织化学分析。 通过DAPI染色（蓝色）显示定植于肝模型中的细胞；EmGFP表达通过免疫化学染色（红色）显示。TLM1+2：转导的肝模型1和2；Ctrl.：重新接种细胞但未进行转导的对照肝模型。比例尺：200 µm。（经参考文献8许可重印。） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在最终测试中，通过qRT-PCR分析了AAV介导的hCycB基因敲低效果。在两个转导的肝脏模型的所有叶中，hCycB基因的敲低效率介于70%至90%之间，平均值如图5所示（Figure 5）。
<img alt="基因表达柱状图；比较TLM1、TLM2与对照组中hCycB的表达水平；实验。" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图5. RNAi介导的基因敲低 hCycB 在AAV转导的三维肝模型中。 基因沉默 hCycB 通过qRT-PCR测定。对每种转导的三维肝模型（TLM1和TLM2）的所有样本计算均值和标准差（SD），并以非转导对照组（Ctrl.）的均值为基准进行归一化。（转载自参考文献8，经许可。） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

脱细胞大鼠肝脏的再细胞化细胞外基质可作为人源化的三维ex vivo模型，用于研究病毒或病毒载体的分布及其转基因表达。

在三维肝模型中研究人肝细胞癌细胞系HepG2再增殖的病毒载体

本方案描述了一种三维（3D）离体肝脏模型的构建及其在病毒载体研究与开发中的应用……

本实验的总体目标是构建一种三维肝脏模型，用于研究病毒及病毒载体。该方法能够在具有血管化结构的三维系统中，利用人类细胞研究生物学过程，这些人类细胞的生理特性与小鼠或大鼠模型中的啮齿类细胞存在差异。此外，该方法有助于提升动物福利，因为它避免了对活体动物进行实验，并且从长远来看，旨在完全取代动物组分。尽管我们开发此方法旨在研究用于基因转移的病毒载体，但它也可应用于感染性活病毒的研究以及其他研究领域，如癌症研究。演示该实验操作的是我实验室的技术员 Viola Rohrs。出于动物福利的考虑，本研究仅使用了因其他动物实验被处死后的多余动物，即获取肝脏支架无需额外使用动物。首先，将肝细胞系Hep G2扩增，取1500万个细胞接种于T175培养瓶中，加入含10%胎牛血清以及2毫摩尔谷氨酰胺、青霉素和链霉素的30毫升培养基。培养4天后，在培养条件下用胰蛋白酶溶液消化5分钟，使细胞脱落，随后收集细胞。然后在300 ×g下离心细胞3分钟。随后将细胞重悬于4 mL PBS中，并进行细胞计数。每瓶应获得约4500万个细胞。重细胞化大鼠肝脏 ECM 需要 6 亿个细胞。为进行 ECM 重细胞化，首先建立包含肝脏灌注室、灌注系统、培养基储液器和除泡阱的生物反应器系统。重细胞化过程包含两个关键步骤。一是要避免在灌注系统中产生气泡。二是整个系统必须保持无菌。首先，将生物反应器系统的这些组件在121摄氏度下灭菌15分钟。第二步，用培养基填充管道和已灭菌的灌注室。然后将去细胞化的大鼠肝脏支架放入肝脏灌注室中。下一步是使用管夹将插管的门静脉连接到灌注系统。现在将生物反应器系统放入培养箱中，并将其连接至蠕动泵。接下来，用150毫升的完全培养基对支架进行5天的平衡处理，流速设定为1.25毫升每分钟。五天后，将生物反应器系统与泵断开，并转移至无菌操作台。将肝支架从培养基循环系统中断开。然后用含有3亿个Hep G2细胞的5毫升培养基充满注射器，通过门静脉注入细胞，避免产生气泡。然后在不运行泵的情况下让细胞在 ECM 中重新定植 1 小时。1 小时后，以 1.25 毫升/分钟的流速启动泵。10 分钟后，将流速提高至 2.5 毫升/分钟。再过20分钟后，将泵速调至3.75毫升/分钟的工作速度。在全速泵送30分钟后，关闭泵，再加入3亿个细胞，并让细胞在细胞外基质（ECM）中孵育1小时。1小时后，通过逐步调节泵速的方式，如前所述逐渐增加循环流量。让细胞在肝脏中重新定植培养两周。每隔一天更换 50 毫升培养基，并从用过的培养基样品中检测生理参数。AAV 载体的制备是一个复杂的流程，涉及多个步骤，文本方案中对此进行了概述。在本视频片段中，将演示一些关键步骤。首先，制备、纯化并定量 AAV 载体。简而言之，使用旋转瓶生产 AAV 载体，并通过碘克沙醇梯度离心法进行纯化。通过PD10凝胶过滤柱过滤去除残留的碘克沙醇。然后以基因组AAV DNA为标准品，采用定量PCR测定AAV载体浓度。每种模型需要总共27万亿个AAV载体。现在对肝脏模型进行转导。首先，将27万亿个载体溶于5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，并加入注射器内。可按每毫升5微克的浓度加入酚红。然后将肝脏从培养基循环系统中断开，并向系统中注射载体。注射后，在不泵送的情况下孵育系统一小时。随后按照先前所述逐步增加流速。随后，在转导后的肝脏孵育六天的过程中，每隔一天更换 50 毫升培养基。使用手术刀从每个肝叶切取约 0.5 厘米厚、1.5 至 2 厘米长的组织样本。将组织切片置于含 4% 多聚甲醛和 4% 蔗糖的溶液中，于 4 摄氏度孵育 90 分钟。然后用 PBS 洗涤样品，每次 1 分钟，共洗涤 3 次。洗涤后，将样品在 4°C 条件下于 8% 蔗糖中过夜孵育。次日，将样品加载至含有固定介质的冷冻模具中。避免引入任何气泡。加样后，用固定液完全覆盖样品，并置于负80摄氏度条件下。待样品完全冻结后，使用冷冻切片机从样品中制备10微米的冷冻切片。根据需要对样本进行染色以确认再细胞化。进行基因表达分析时，使用4毫米活检打孔器取样。为评估再细胞化，对冷冻切片进行苏木精和伊osin染色。从两个转导肝脏和一个未转导但重新接种细胞的对照肝脏中获取的肝叶均重新植入了Hep G2细胞。从每种肝脏模型的28个穿刺活检样本中定量分析了RNA表达水平和载体滴度。在两个转导肝脏模型中，检测到每细胞分别含有55和90个载体基因组，该载体含量足以诱导基因沉默。对照组中未检测到基因组，符合预期。通过RT-PCR和蛋白质印迹法分析EmGFP的表达。大多数活检样本显示出EmGFP的mRNA表达和蛋白表达。冷冻切片的免疫染色显示，在模型成功再细胞化的区域，均可观察到EmGFP表达，表明AAV基因表达良好。接下来通过定量RT-PCR分析AAV介导的人源亲环素B的基因敲低效果。人源亲环素B在两个转导肝脏的所有叶中平均敲低效率为70%至90%。该技术建立后，为研究人员研究病毒及病毒载体在血管化三维器官系统中的分布奠定了基础。此类研究将有助于改进现有的基因转移技术，并推动新型抗病毒策略的开发。

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Research

科研

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Cancer Research

癌症研究

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一种用于研究肝细胞癌中肿瘤-间质相互作用的三维球状模型

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利用人类细胞系进行肝脏器官发生建模、类组装体构建及合成组织设计的体外培养技术

了解利用HepG2细胞在三维肝脏模型中进行病毒载体研究的方法。该技术通过脱细胞大鼠肝脏支架重建人源化肝组织，为基因转移和病毒学研究提供替代动物实验的体外模型。

在三维肝模型中研究人肝细胞癌细胞系HepG2再增殖的病毒载体

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