Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

该程序的总体目标是开发三维肝脏模型来研究病毒和病毒载体。该方法允许研究血管化三维系统中的生物过程，其中人类细胞的生理机能与小鼠或大鼠模型中的啮齿动物细胞不同。此外，这是改善动物福利的一个步骤，因为它避免了对活体动物的实验，并且从长远来看，旨在完全取代动物成分。

虽然我们开发这种方法来研究用于基因转移的病毒载体，但它也可以应用于传染性重要病毒的研究和其他研究领域，例如癌症研究。演示该程序的是我实验室的技术人员 Viola Rohrs。为了动物福利，本研究仅使用多余的动物，这些动物被处死用于其他动物实验，即

不需要额外的动物来获得肝脏支架。首先，首先扩增肝细胞系 Hep G2。将 1500 万个细胞接种到 T175 瓶中，加入 30 毫升含有 10% 胎牛血清和 2 毫摩尔古拉胺、青霉素和链霉素的培养基中。培养 4 天后，在培养条件下使用 5 分钟的胰蛋白酶溶液暴露以松散细胞，然后收获它们。

然后以 300 G 的浓度离心细胞 3 分钟。然后将它们重新悬浮在 4 毫升 PBS 中并进行细胞计数。每瓶应产生约 4500 万个细胞。

6 亿个细胞才能使大鼠肝脏 ECM 重新细胞化。为了使 ECM 再细胞化，首先设置生物反应器系统，其中包含肝脏充血室、充血系统、培养基储液罐和气泡捕集器。再细胞化过程有两个关键步骤。

一种是避免在大量系统中捕获任何气泡。第二个是整个系统必须保持无菌。首先，在 121 摄氏度下对生物反应器系统的这些组件消毒 15 分钟。

其次，用培养基填充管路和消毒的 Profusion 室。然后将脱细胞的大鼠肝脏支架放入肝脏充血室中。下一步是使用管夹将插管门静脉连接到增流系统。

现在将生物反应器系统放入培养箱中，并将其连接到蠕动泵。接下来，在 5 天内用 150 毫升补充培养基平衡支架。将流速设置为 1.25 mL/min。

五天后，断开生物反应器系统与泵的连接，并将其转移到无菌罩中。断开肝脏支架与介质电路的连接。然后在注射器中加入 5 毫升含有 3 亿个 Hep G2 细胞的培养基，并通过门静脉注射细胞，避免形成气泡。

然后让细胞重新填充 ECM 一小时，而不运行泵。一小时后，以每分钟 1.25 毫升的速度启动泵。10 分钟后，将压力增加到每分钟 2.5 毫升。

再 20 分钟后，将泵设置为每分钟 3.75 毫升的运行速度。以全泵速度运行 30 分钟后，关闭泵，再添加 3 亿个细胞，让细胞填充 ECM 一小时。一小时后，像以前一样通过逐步调整泵速来逐渐增加循环。

现在让培养物在两周内使肝脏重新细胞化。每隔一天更换 50 毫升培养基，并从用过的培养基样品中测量生理参数。AAV 载体的生产是一个复杂的过程，涉及文本方案中总结的许多步骤。

在视频的这一部分，演示了一些关键步骤。首先，制备、纯化和定量 AAV 载体。在滚瓶中短暂生产 AAV 载体，并通过碘克沙醇梯度离心纯化它们。

通过在 PD10 凝胶过滤柱上过滤去除残留的碘克沙醇。然后使用基因组 AAV DNA 作为标准品，通过 QPCR 测定 AAV 载体浓度。每个模型总共需要 27 万亿个 AAV 向量。

现在转导肝脏模型。首先，将 27 万亿个载体装入注射器中，装入 5 毫升 PBS 中。酚红的添加量为 5 μg/mL。

然后断开肝脏与培养基回路的连接，并将载体注入系统。注射后，将系统孵育 1 小时，不要泵送。然后如前所述逐渐增加流量。

之后，由于转导的肝脏在 6 天内孵育，因此每隔一天更换 50 毫升培养基。使用手术刀从每个肝叶上切片样本，这些样本大约半厘米厚，1.5 到 2 厘米长。将切片在 4% 多聚甲醛和 4% 蔗糖中在 4 摄氏度下孵育 90 分钟。

然后用 PBS 洗涤样品 3 次，每次洗涤 1 分钟。洗涤后，将样品在 4 摄氏度的 8% 蔗糖中孵育过夜。第二天，将样品装入含有一些固定介质的冷冻模具中。

避免引入任何气泡。加载后，用固定介质完全覆盖样品，并将其置于零下 80 摄氏度。冷冻后，使用冷冻切片机从样品中制备 10 微米的冷冻切片。

根据需要对样品进行染色以确认再细胞化。对于基因表达分析，使用 4 毫米活检打孔器采集样本。为了评估再细胞化，用苏木精和伊红对冷冻切片进行染色。

来自两个转导肝脏和一个重新细胞化但未转导的对照肝脏的叶都重新填充了 Hep G2 细胞。从每个肝脏模型的 28 次穿刺活检中定量 RNA 表达和载体滴度。在两个转导的肝脏模型中，每个细胞分别测量了 55 个和 90 个载体基因组，这足以诱导基因沉默。

正如预期的那样，在对照中没有测量基因组。通过 RT-PCR 和 western blotting 分析 EmGFP 表达。大多数活检显示 EmGFP 的 mRNA 表达和 EmGFP 的蛋白表达。

冷冻切片的免疫状态表明，无论模型在哪里成功再细胞化，也可以看到 EmGFP 表达。这表明 AAV 基因表达良好。接下来，通过定量 RT-PCR 分析 AAV 介导的人亲环蛋白 B 敲低。

人亲环蛋白 B 在两个转导肝脏的所有叶上的平均敲低率在 70% 到 90% 之间。开发后，这项技术为研究人员研究病毒和病毒载体在血管化三维器官系统中的分布铺平了道路。此类研究将有助于改进当前的基因转移技术，并有助于开发新的抗病毒策略。