Name: 用作酶反应器的水滴及其电磁驱动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学习利用电磁驱动水滴微反应器进行自动化级联反应的方法。该技术通过疏水纳米颗粒包裹液滴实现微流控平台，适用于合成生物学中的酶促反应和催化剂筛选研究。

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作者感谢德国研究基金会（DFG）提供的支持。

1. 磁性纳米颗粒的疏水化
<ol>
	<li>为了合成疏水性磁性颗粒，加入0.85 g FeCl3 六水合物（3.14 mmol）和 0.30 g FeCl2 四水合物（1.51 mmol）加入200 mL水/乙醇溶液（4:1 v/v）中。</li>
	<li>向该混合物中加入0.20 mL 1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷（PFOTES）（5.23 mmol），并在磁力搅拌器（500 rpm）剧烈搅拌下混合。在惰性气体氛围（N2使用圆底烧瓶并用软木塞密封，以防止磁铁矿颗粒发生二次氧化。</li>
	<li>用氨水溶液（1.5 M）逐滴调节溶液至 pH 8（pH 值由 pH 计测定）。使用磁力搅拌器搅拌溶液 24 小时。</li>
	<li>将烧瓶置于条形磁铁（钕铁硼长方体磁铁 40 × 20 × 10 mm，吸附力 25 kg）上，通过磁力将颗粒从溶液中分离。保持磁铁吸附在烧瓶底部，倾倒出溶液。</li>
	<li>用条形磁铁按照1.4）中的描述，使用水/乙醇溶液洗涤颗粒三次。在60 °C下干燥颗粒24小时（产率 约 0.43 g</li>
	<li>按照制造商的说明，使用扫描电子显微镜分析颗粒。</li>
</ol>
2. 微反应器的制备
<ol>
	<li>使用玻璃研杵将所有干燥的颗粒轻轻研磨，随后直接转移至称量盘（46 × 46 × 8 mm，聚苯乙烯材质）中。</li>
	<li>用移液器将10 µL反应溶液（成分见5.1节）滴加到所有颗粒上，并轻轻以圆形方式移动称量盘约10秒（10 µL微反应器的颗粒质量：约 3.2 × 10-7 kg 33）。将未围绕反应溶液自组装的剩余颗粒于室温下保存，以备后续使用。</li>
	<li>为测量微反应器的接触角，参照2.2节方法构建一个5 µL的水相微反应器，将其置于聚四氟乙烯膜上，并按照仪器制造商的说明，使用光学接触角测量仪分析接触角。</li>
</ol>
3. 线圈主体的3D打印
<ol>
	<li>设计双线圈体，高度为16 mm（单腔），直径为10 mm，内径为 约 4 mm，具体操作请参照制造商说明使用CAD软件进行。</li>
	<li>使用聚乳酸丝等材料，按照制造商说明通过3D打印机打印线圈主体。使用计算机控制的绕线机，以0.08 mm的铜线在线圈主体上缠绕4,500匝。</li>
</ol>
4. 驱动平台的制备
<ol>
	<li>将双线圈排列成矩阵（例如 3×3 矩阵）安装在带有下方珀尔帖元件的电路板上，将双线圈旋紧并通过带状电缆连接至控制器（图3).</li>
	<li>根据所需的应用，加入一个铁芯（32 mm 高，4 mm 直径）或一个钕磁铁（12.5 mm 高，4 mm 直径，1,035 kA/m）-1) 连接到线圈主体以获得更强的磁场。</li>
	<li>在完成平台搭建时，将一块平板（推荐使用石英玻璃）置于线圈基质上，平板最大高度不超过1 mm。</li>
	<li>将微反应器放置在平台表面。</li>
	<li>使用4.1节中所述的控制器启动内置钕磁铁的线圈，以从反应溶液中吸出上层颗粒，从而打开微反应器；要再次关闭微反应器，则关闭线圈。</li>
	<li>将两个初始的微反应器合并 约 10 mm 间距处，使用 4.2 节所述的钕磁铁。通过激活线圈，将所需线圈体中的磁铁抬起 约 25 秒内打开一个微反应器（微反应器与磁铁之间的所需距离约为 12 mm），并将另一个微反应器移动至平台上的相同位置。</li>
	<li>在平台表面冷却微反应器中的反应溶液，并降低线圈温度，方法是打开位于线圈阵列下方的帕尔帖元件上的开关，具体操作如4.1)所述。</li>
</ol>
5. 通过合并微反应器进行酶促反应
<ol>
	<li>将辣根过氧化物酶溶解至浓度为 0.1 µg/mL-1 在磷酸钾缓冲液（0.1 M，pH 6.5）中。将底物10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪（10 mM，溶于二甲基亚砜（DMSO））用磷酸钾缓冲液（0.1 M，pH 6.5）稀释至浓度为200 µM。</li>
	<li>使用上述每种溶液各10 µL，按照2.2)中的描述构建两个微反应器。通过磁力（钕铁硼圆柱磁铁：12.5 mm × 4 mm，1,035 kA/m）将两个微反应器合并。-1如4.6节所述，在25 °C下进行。</li>
	<li>通过将荧光探针（激发波长：570 nm，发射波长：585 nm）置于适当位置来检测反应 约 合并前，在打开的微反应器上方10毫米处</li>
</ol>

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<li>Zhao, Y., Xu, Z., Parhizkar, M., Fang, J., Wang, X., Lin, T. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10404-012-0976-9">Magnetic liquid marbles, their manipulation and application in optical probing.</a> Microfluid Nanofluid. 13 (4), 555-564 (2012).</li>
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<li>Glettenberg, M., Niemeyer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+Peroxidase+Activity+by+Covalently+Tethered+DNA+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Tuning of Peroxidase Activity by Covalently Tethered DNA Oligonucleotides.</a> Bioconjugate Chem. 20 (5), 969-975 (2009).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为成功应用微流控技术，重要的是能够根据生物技术合成与分析的需求移动相应的反应体积。本文介绍的驱动平台可通过磁力移动微流控液滴。通过使用磁性超疏水外壳包裹液滴，可在反应平台的平面表面上实现液滴在二维方向上的自由移动。因此，该方法提供了一种替代传统微流控系统中预设微通道及复杂流体控制装置的新系统，用于传递溶剂和样品。由此，对微小反应液滴的自动化操控显著简化了现有的芯片实验室平台。此外，该平台还可逆地打开微反应器，以添加或移除反应样品。结合分配系统，可实现高度自动化的反应控制，这是迈向 计算机模拟 虚拟液滴实验室中可设计的微反应。该技术的主要局限在于微反应器只能使用小体积构建（最大至 约 30 µL）。该方案中的一个关键步骤是检测微反应器内的酶促反应，因为必须适当调整荧光探针。另一种可能的检测方法是紫外/可见光光谱法。
平台的开发过程表明，直径为10 mm的电磁线圈足以实现液滴的移动。然而，填充空气或铁芯的双线圈无法产生打开微反应器外壳所需的磁力。因此，线圈中选用了钕磁铁芯来完成此任务。所产生的磁场梯度还可以通过磁体垂直于反应平台的电磁运动进行调节。平...

微反应的技术应用主要在预定义的微通道芯片中进行。这类系统已在文献中得到广泛确立和全面描述（例如1,2,3）。2011年，全球微流控技术的市场规模达到62亿欧元4。相比之下，可自由移动的微反应器单元此前仅被有限地研究和报道。移动水相微液滴最常见的方法是电润湿5。其他驱动液滴在表面运动的方法包括利用电场6、磁力7或声学驱动8。由于这些基于液滴的微反应系统具有不利的表面积与体积比，容易受到强烈的蒸发效应影响。因此，液滴运动通常在液-液两相体系中进行，其中上层相具有高沸点，以保护水相免于蒸发。然而，这种方法存在反应液滴因不受控扩散而被污染的高风险，这成为上述系统在技术上推广应用的重要障碍。
近期研究关注非黏附性液-固相变过程。一种高效的方法是使用超疏水表面，以形成球形水滴。该反应概念的进一步拓展是采用具有超疏水表面或外壳的微反应器，其可由聚四氟乙烯（PTFE）颗粒构成9。此类表面的接触角通常在160°左右（取决于表面粗糙度）。这种球形反应器在表面上移动时阻力极小，同时可有效防止水分蒸发。
微米级聚四氟乙烯颗粒包覆的水滴可保持球形形态，直至直径约为2 mm。当体积更大时，疏水性外壳通常不再完全闭合 10. 高和麦卡锡通过使用离子液体，实现了其他壳材料的影响，并将液态弹珠的应用领域扩展至非极性溶剂 12对于疏水性颗粒基外壳的形成，迄今为止已有直径范围为10 nm–30 µm的颗粒被报道 11,14,16新研究显示，作为壳材料的疏水性纳米颗粒比微粒更为有效。 13初步稳定性研究表明，当粒径从 约 600 nm 至 约 100 nm。这可能是由于在水相球体周围颗粒分布更密集所致。 15.
由疏水外壳保护水相反应腔室并将其命名为液滴弹珠（liquid marbles）的现象，最早于2001年由Aussillous描述。 等 和 Mahadevan 等 17,18自那时以来，关于这些明确定义的反应区域的应用报道较少。例如，一种基于液体弹珠的气体传感器 19 并已开发出一种基于光学定性原理的水质污染检测方法 20作者强调了其微反应系统具有反应速率高和化学品消耗低的优点。近期的文献报道了pH敏感型液态弹珠的制备 16 或具有两种不同功能涂层的“Janus颗粒”的制备。例如，Bormashenko 等 可合成一种微反应器，其壳层由聚四氟乙烯和半导体炭黑制成 21此外，研究还证明，微反应器能够通过可渗透的气液界面吸收外部氧气作为共聚单体，从而高效且便捷地合成聚过氧化物。 24在另一种方法中，基于二氧化硅颗粒的液态弹珠外壳提供了反应性基底表面，以调控经典的银镜反应。 26目前，亲水核-疏水壳液滴在研发领域面临的问题包括颗粒尺寸调控、单分散液滴的可重复制备、表面润湿性，以及第二层亲水壳对微反应区室的影响。 22以及对液滴轨迹的更好控制， 例如 用于连续微流控PCR系统的开发 4.
对这些微反应器进行磁驱动具有在生化系统中实现相对较大幅度运动以及良好力选择性的优势。使用疏水性磁铁矿颗粒时，它们不仅能够将磁力传递至微反应器以驱动其运动，同时还起到疏水外壳的作用。2006年，Lehmann et al. 23 与 Shikida et al. 25 首次提出在液滴内部含有磁性颗粒的情况下实现液滴磁驱动的概念，他们采用手动移动的永磁体作为驱动单个液滴的执行装置。另一种移动少量液体的方法由 Zhao et al. 实现，他们利用疏水性 Fe3O4 颗粒作为磁性外壳，并通过垂直反向磁场从液滴顶部打开磁性液态弹珠的外壳 27。基于此概念，Xue et al. 成功开发出可形成表面张力为 20.1 dyne cm−1 微反应器的颗粒 28。Lin et al. 制备了新型基于纤维素的微/纳米分级结构球体，兼具超顺磁性和超疏水性，为磁性液滴的运输与操控提供了良好的稳定性 31。然而，该研究迄今仅作为原理验证性工作发布，尚未应用于任何实际场景。目前，对液态弹珠的磁控与电控正处于初步探索阶段。Zhao et al.（2010年）15 与 Zhang et al.（2012年）29 已实现通过手动操作位于核壳结构液滴下方的永磁体来操控液滴。Bormashenko et al. 11 通过靠近钕磁体，使铁磁性液态弹珠加速至 25 cm s-1 的速度。上述原理性研究均完全依赖手动移动小型永磁体完成。作为进一步的发展，Zhao et al. 近期通过调节永磁体的距离，估算了驱动磁性液态弹珠所需磁通密度的阈值 30。要实现与常规芯片实验室系统相当的反应控制，必须具备对离散液体体积进行自动化控制的手段。为满足这一需求，我们开发了一种基于可变场梯度的新控制体系，用于固定、移动和开启磁性微反应器。

<table><tbody><tr><td>3D 打印机</td><td>FelixPrinters</td><td>Pro1</td><td></td></tr><tr><td>10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪（Amplex Red）</td><td>Life Technologies</td><td>A12222</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td>TU-KL</td><td>1072</td><td></td></tr><tr><td>CAD 软件</td><td>Siemens</td><td>Soled edge</td><td></td></tr><tr><td>接触角测量仪</td><td>Dataphysics</td><td>OCA 20</td><td></td></tr><tr><td>圆柱形磁铁</td><td>Webcraft GmbH</td><td>S-04-13-N</td><td>https://www.supermagnete.de/stabmagnete-neodym-rund/stabmagnet-durchmesser-4mm-hoehe-12.5mm-neodym-n42-vernickelt_S-04-13-N</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Bernd Kraft</td><td>7758-11</td><td></td></tr><tr><td>干燥烘箱</td><td>Binder</td><td>FD 115</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>68-17-5</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 四水合物</td><td>TU-KL</td><td>1625</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 六水合物</td><td>TU-KL</td><td>1622</td><td></td></tr><tr><td>荧光探针</td><td>PerkinElmer</td><td>LS 55</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶</td><td>Carl Roth</td><td>9003-99-0</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Th.Geyer GmbH &amp;amp; Co</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Bernd Kraft</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>帕尔贴元件</td><td>Conrad&amp;nbsp;</td><td>193569</td><td></td></tr><tr><td>三乙氧基硅烷全氟辛基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51851-37-7</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>FEI</td><td>Helios NanoLab 650 DualBeam</td><td></td></tr><tr><td>分离用条形磁铁</td><td>Webcraft GmbH</td><td>Q-40-20-10-N</td><td></td></tr><tr><td>绕线机</td><td>IWT GmbH</td><td>FW122</td><td></td></tr></tbody></table>

水滴作为酶促微反应器及其电磁驱动

Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation

为了成功实现微流控反应系统（如PCR和电泳）的应用，微量液体的操控至关重要。在传统的芯片实验室平台中，溶剂和样品需通过具有复杂流体控制装置的特定微流控通道进行传输。本文介绍的液滴驱动平台是一种颇具前景的替代方案。该平台可在反应基底（即“液滴实验室”）的平面表面上移动液滴（微反应器）。微反应器在平台疏水表面的驱动依赖于作用在液滴外层上的磁力，该外层由一层超疏水性磁铁矿颗粒构成。平台的疏水表面可避免液体核心与基底之间的任何接触，从而实现微反应器的顺畅移动。在该平台上，可同时定位并移动一个或多个体积为10 µL的微反应器。平台本身由一个3 × 3排列的双线圈阵列组成，线圈中可装入钕磁铁或铁磁芯。磁场梯度可实现自动控制。通过调节磁场梯度，可自动操控微反应器的磁性疏水外壳，从而驱动微反应器移动，或可逆地打开外壳。通过合并微反应器或将微反应器与固定在表面的催化剂接触，即可启动底物与其相应酶之间的反应。

壳层颗粒的直径约为 640 nm。包埋在该氟硅烷壳层颗粒内的磁性纳米颗粒直径范围在 22 nm 至 37 nm 之间。以水作为液核的 5 µL 微反应器，其接触角约为 160°。
如上所述，移动一个10 µL微反应器所需的力为1.34 ± 0.08 µN。图1展示了使用58 mA电流驱动、由4,500圈铜线绕成并带有内铁芯的线圈所产生的电磁力。通过有限元模型（FEM）估算力的分布，以确定移动微反应器所需的线圈参数。如图1所示，该线圈产生的磁力足以驱动微反应器移动至距离线圈中心超过10 mm的位置。
打开微反应器所需的磁力为 0.85 ± 0.05 mN，远高于移动液滴所需的力。由于带铁芯线圈（<strong cla...

液滴实验室反应系统可在微流控尺度下灵活地实现复杂反应。已开发出由3×3电磁线圈阵列组成的自动驱动平台，并成功用于合并两个10 µL的微反应器，从而在生成的液态弹珠中启动酶促反应。

为了成功实施微流控反应系统（如PCR和电泳），小体积液体的移动至关重要。在……

该装置的总体目标是提供一种新的微流控平台技术，实现在微小水相液滴中自动进行级联反应。该方法通过重现微生物利用酶催化复杂反应序列的过程并筛选新型催化剂，有望解答合成生物学领域的一些关键问题。我们这种“液滴实验室”方法的主要优势在于其高度的适应性。与基于通道的微流控芯片不同，该方法的唯一前提是具有亲水性反应环境。尽管该方法可用于研究酶促反应，但也适用于其他体系，例如无机催化剂或配体串联反应。当我尝试设计一种集成了产物分离功能但无需复杂阀门和分离系统的微流控装置时，首次提出了这一方法的构想。通过以液滴形式移动反应溶液，反应控制变得非常简单。首先，使用3D打印技术设计线圈骨架。然后，使用绕线机将每个骨架用0.08毫米的铜线各缠绕4500次。将帕尔贴元件放置在电路板上。将第一层线圈拧到帕尔贴元件上，形成一个正方形。然后，使用3D打印的塑料框架或其他非导电材料将第二层线圈固定在上方。使用带状电缆将电路板连接至磁体控制器。将钕磁铁插入线圈中。在线圈阵列上方放置一片厚度为一毫米的石英玻璃或塑料板。用螺丝固定盖子，完成驱动平台的组装。在惰性气氛下开始纳米颗粒合成时，首先将85克六水合三氯化铁和3克四水合二氯化铁溶于200毫升体积比为4:1的水-乙醇溶液中。然后加入0.2毫升PFOTES，并用磁力搅拌子以500 RPM的速度搅拌混合物。加入1.5摩尔的氢氧化铵至混合物中，调节pH至8.0。然后继续搅拌溶液24小时，以获得疏水性磁性纳米颗粒。将一个吸附力为25千克的条形磁铁固定在反应烧瓶底部。倒掉溶液，用四份水与一份乙醇的混合溶液洗涤颗粒三次。移除磁铁，将颗粒在60摄氏度下干燥24小时。采用扫描电子显微镜对颗粒进行表征。在含有10毫摩尔过氧化氢的0.1摩尔pH 6.5磷酸钾缓冲液中配制0.1微克/毫升辣根过氧化物酶溶液。然后，在磷酸钾缓冲液中配制20微摩尔荧光探针10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪溶液。接着，使用玻璃研钵和研杵轻轻研磨干燥的纳米颗粒。将颗粒转移至聚苯乙烯称量盘中，加入10 µL过氧化物酶溶液。轻轻摇动称量盘约10秒，使纳米颗粒在过氧化物酶溶液周围自组装。将该微反应器转移至驱动平台。使用 10 微升荧光探针溶液重复此过程，并将第二个微反应器放置在平台上。将剩余的颗粒在室温下保存。使用帕尔帖元件将微反应器中的反应溶液保持在 25 摄氏度。将荧光显微镜安装在微反应器上方约10毫米处，并将显微镜连接至计算机。通过磁控装置启动磁体，并旋转以将含有荧光探针溶液的微反应器置于显微镜下。打开激发光源。升起线圈磁铁以打开微反应器，并开始记录荧光显微镜图像。2到5秒后，降下磁铁以关闭微反应器。然后，使用磁铁控制器将过氧化物酶微反应器移动至荧光微反应器附近。打开荧光探针微反应器。将过氧化物酶微反应器拉入探针微反应器中并开启，以启动反应。根据需要通过荧光显微镜观察反应，并打开或关闭合并的微反应器。通过使用疏水性铁纳米颗粒对溶液液滴进行编码，构建了微反应器。通过操控驱动平台下方的钕磁铁，可实现对这些微反应器的移动、开启、关闭和融合。驱动平台的线圈本体中也可加入铁芯进行构建。这提供的磁力足以使微反应器移动超过10毫米，但不足以打开微反应器。因此，必须使用钕磁铁在小体积溶液中进行反应。本研究进行了一项过氧化物酶与荧光标记物之间的代表性酶促反应，并通过荧光显微镜进行监测。反应过程中观察到的米氏动力学与文献值吻合良好，表明微反应器装置不会影响反应进程。观看本视频后，您应能够充分理解如何合成疏水性微粒，并利用这些微粒生成水相微滴。该平台技术可通过液滴合并实现自动化反应控制。此外，可将装有底物的单个微反应器移动到固定化酶的小面积区域上方。利用含有不同酶的多个固定化区域，可实现具有可转移且即时产物的连续反应级联。该原型开发仅是开端。目前，我们正在反应平台上方构建一套自动化分配系统，以将固定化酶沉积至任意位置。线圈矩阵将扩展至10乘10个位置。该技术可为计算机控制的生化反应序列设计与执行奠定基础。

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用作酶反应器的水滴及其电磁驱动

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介绍了电场诱导去润湿装置（Field-DW）的制备与操作方案，以及电场对液滴内含物影响的初步研究。...

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颗粒模板乳化实现无需微流控的液滴分析

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使用微生物微滴培养系统（MMC）进行自动化微生物培养与适应性进化

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基于玻璃的液滴与乳液生成装置

学习利用电磁驱动水滴微反应器进行自动化级联反应的方法。该技术通过疏水纳米颗粒包裹液滴实现微流控平台，适用于合成生物学中的酶促反应和催化剂筛选研究。

水滴作为酶促微反应器及其电磁驱动

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