评估视网膜小胶质细胞吞噬功能在体内使用基于流式细胞术流量测定
2016年10月18日
在组织的动态平衡和吞噬功能不足的维护工作在病理上被牵连的小胶质细胞的吞噬作用是至关重要的。然而， 在体内评估小胶质细胞的功能在技术上具有挑战性。我们已经开发出一种简单而坚固的技术用于精确监测和量化小胶质细胞的吞噬潜力在生理环境。
该程序的总体目标是评估视网膜小胶质细胞在体内的吞噬功能。这种方法可以帮助回答眼科领域的关键问题，例如某些化合物是否在生理环境中改变小胶质细胞的吞噬功能。该技术的主要优点是它使用流式细胞术，可以对小胶质细胞吞噬作用进行快速和精确的定量分析。
帮助我演示该程序的是我实验室的博士后 Susumu Sakimoto。首先在 33 号针头和注射器中加入 0.5 微升荧光标记的颗粒溶液。然后将麻醉的小鼠在手术显微镜下侧向放在柔软的材料上，并通过对脚趾捏无反应来确认适当的镇静水平。
接下来，使用镊子小心地在一个眼睑周围施加压力，使眼球略微从眼窝中弹出。然后用两根手指抓住耳朵上方和动物下巴的头部，轻轻拉伸平行于眼睑的皮肤，使眼睛略微凸出眼窝。玻璃体内注射具有挑战性，如果作不当，将导致结果偏倚和可变。
为了减少对眼睛的创伤，请将动物保持在稳定的位置，尽量减少头部运动。要刺穿眼球，请用一只手轻轻抓住鼠标。然后找到角膜和巩膜连接处的角膜缘，在色素沉着的小鼠中可以看到一个灰色圆圈。
另一只手握住注射器，将针头插入角膜缘。然后稍微缩回针头以排出少量玻璃体液，并缓慢按下柱塞以注入颗粒。当所有珠子都已输送完毕后，慢慢取出注射器以避免注射材料回流，并在眼睛缩回原位后涂抹保湿滴剂以保持眼睛水分。
然后将动物放在自己笼子里的加热垫上，并进行监控，直到它完全恢复。玻璃体内注射 3 小时后，用 45 度角镊子轻轻按压眼睑，使眼球突出。将镊子放在眼球后面并拉动。
然后将眼球转移到培养皿的干燥区域，在解剖显微镜下含有少量含有钙和镁的 PBS。并使用超细镊子的一个尖端在角膜角膜缘中穿孔眼睛。接下来，用 45 度斜角的细镊子握住眼球，用弹簧剪刀剪开角膜缘周围，直到剪掉大约一半的圆周。
将眼球转移到 PBS 中，并使用第二对 45 度角的细镊子将角膜和巩膜撕裂。晶状体和视网膜会完好无损地出来。确保晶状体和视网膜分离，并将视网膜转移到 5.4 毫升聚苯乙烯试管中，该试管含有 2 毫升含钙和镁的 PBS。
为了获得视网膜细胞的单细胞悬液，请根据制造商的说明使用神经元组织解离试剂盒，并将细胞重悬于 200 微升染色缓冲液中。然后将样品转移到 96 孔 U 形底板的一个孔中。离心后，倒置板以弃去上清液，并用每孔含有 CD16、CD32 抗体的 25 μL 染色缓冲液在室温下封闭 FC 受体 5 分钟。
接下来，在室温下避光中用目标抗体标记细胞 15 分钟。然后沉淀细胞，然后在每孔中加入 200 μL 新鲜染色缓冲液洗涤。现在将沉淀重悬于 200 μL 染色缓冲液和活性染料中，并将样品转移到 1.2 mL 微量滴定管中。
然后用额外的 100 μL 染色缓冲液和活性染料洗涤孔，并将洗涤液与相应的样品混合，以便通过流式细胞术进行分析。该方法可用于 10 至 20 日龄的出生后或成年小鼠，并且可以适用于测试化合物的作用和/或小胶质细胞吞噬作用的遗传作。例如，在该实验中，在用不同剂量的 LPS 进行腹膜内攻击后，与载体攻击的对照组相比，确定每公斤剂量 1.42 毫克的 LPS 诱导吞噬小胶质细胞百分比的统计学显着增加。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在六个小时内完成。在此程序之后，其他方法（如细胞分选后进行 qPCR 或蛋白质组学分析）可用于回答有关视网膜中吞噬性和非吞噬性小胶质细胞之间差异的进一步问题。在开发这项技术时，我们期望我们现在能够让视觉和神经科学家在原位和生理相关背景下进一步探索小胶质细胞吞噬功能。
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概述
本文介绍了一种新的技术，用于评估视网膜小胶质细胞体内吞作用功能。通过利用流式细胞术，研究人员可以快速、精确地对小胶质细胞吞噬作用进行定量分析，这对于理解组织稳态和病理至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 眼科学
- 细胞生物学
背景
- 小胶质细胞的吞噬作用对于维持组织稳态至关重要。
- 不充分的吞噬功能与各种病理相关。
- 体内评估小胶质细胞功能存在技术挑战。
- 流式细胞术为分析提供了一种强有力的方法。
研究目的
- 在生理环境中评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能。
- 确定特定化合物对小胶质细胞吞噬作用的影响。
- 为未来眼科学研究提供可靠的方法。
使用的方法
- 用荧光标记的颗粒溶液装载33规格针。
- 使用手术显微镜进行精确观察。
- 监控麻醉的小鼠以确保适当的镇静。
- 使用流式细胞术进行定量分析。
主要结果
- 该技术可以准确测量小胶质细胞的吞噬作用。
- 与传统方法相比，流式细胞术提供了快速的结果。
- 可以评估化合物对吞噬功能的潜在影响。
- 该方法增强了对小胶质细胞在健康和疾病中的作用的理解。
结论
- 开发的技术是研究小胶质细胞功能的重大进展。
- 它为神经炎症和视网膜健康研究开辟了新途径。
- 未来的研究可以利用这种方法探索治疗干预。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of retinal microglial phagocytic function using flow cytometry addresses a critical gap in CNS target validation and mechanistic de-risking for neuroinflammatory and neurodegenerative disease pipelines. This approach enables precise, reproducible measurement of microglial activity in physiologically relevant settings, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. The method's adaptability and speed facilitate robust compound evaluation and portfolio triage for CNS and ophthalmology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of microglial phagocytic function in vivo for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying functional responses to genetic or pharmacological perturbations.
- Facilitates predictive confidence in CNS and retinal disease models by providing quantitative readouts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, physiologically relevant microglial systems for downstream compound screening.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative phagocytosis measurements via flow cytometry.
- Enables rapid assessment of compound effects on microglial function, supporting scalable screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker development in neurodegeneration and retinal disorders.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling in vivo functional assays.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative microglial activity data.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry-based assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, compound screening, and translational research in CNS and ophthalmology pipelines.
- Discovery Biology: Quantifies microglial phagocytosis to clarify pathway function and de-risk biological hypotheses.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in validated in vivo systems.
- Analytics: Generates statistically robust measurements for comparing experimental conditions and compound effects.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by enabling functional biomarker alignment in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to various CNS and retinal research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microglial target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, rapid, and scalable phagocytosis assays for cross-team use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of CNS and ophthalmology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent ocular procedures and flow cytometry analysis.
- Needs access to surgical microscopes, flow cytometers, and validated antibody panels.
- Demands cross-team standardization of injection and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptable to different rodent ages and potentially other CNS tissues with protocol optimization.
- Dependent on precise intravitreal injection technique to minimize variability and bias.
