基于纳米级PCR技术对动物样本中呼吸道病原体的高通量检测

本实时 PCR 检测方法的总体目标是以高通量方式同时检测基于 DNA 和 RNA 的病原体。临床样本中的核酸将使用加载于 OpenArray 板上的通用引物池进行预扩增，并分析其中是否存在病原体。该方法有助于推动传染病领域的“同一健康”（OneHealth）监测工作。

与传统技术相比，该方法能够同时对更多样本检测更多靶标，且各靶标之间不会相互竞争，从而提高了检测效率。该方法使用定制的纳米级PCR板，引物和探针被打印在通孔边缘，样本则通过液体处理仪加载。

我们将以马和犬呼吸道病原体检测的临床样本为例演示该方法。开始此实验前，请按照文本方案中所述设计酶标板。本实验所用酶标板配置为18个靶标，每靶标设三个复孔。

向拭子和气管冲洗液中加入培养基，使液体体积至少达到1至2毫升。在试管中剧烈涡旋振荡拭子与DMEM。然后，使用移液器将约1毫升的培养基转移至新的试管中。

向每根珠管中加入 235 µL 裂解缓冲液和 175 µL 样品。按照生产商的说明书提取总核酸。首先核对样本图谱，然后按照文本方案中的描述进行核酸的逆转录和预扩增（preamp）。

使用96孔标准板的左侧各孔，每孔加入8.5 µL预扩增主混合液和5.5 µL DNA/RNA样本。将样本、阳性对照和阴性对照与预扩增混合液混合后，用透明粘性封板膜将96孔标准板彻底密封。使用刀片去除多余的封板膜，以防止扩增循环过程中产生封膜缝隙。

使用PCR板离心机将密封的板离心20秒。检查以确保所有试剂均汇集于板孔底部。开启常规的热循环仪后，选择预扩增循环程序并启动程序。

只有当通过屏幕上的温度读数确认热循环仪底部达到cDNA合成所需的温度时，才将96孔板放入热循环仪中。预扩增程序运行完成后，确认板子仍保持密封状态。戴上双层手套和袖套后，移除预扩增板上的密封膜。

然后，小心脱去并丢弃外层手套。通过向96孔预扩增板的第1至第6列每孔加入56 µL TE缓冲液，并用移液器反复吹打混匀，将预扩增产物稀释1:5。操作时，移液器仅按至第一停点，从孔底吸取液体，而在较高位置排液，注意不要产生气泡。

无论孔位是否使用，均向所有六列加入 TE 缓冲液。按照文本方案中的描述，准备将样品转移至 384 孔扩增板。完成准备步骤后，戴上新的合身双层手套和袖套。

由于在移取低体积液体时蒸发速率较高，必须高效地分配主混合液和样品，并立即密封反应板。向384孔板中加入2.5 µL扩增主混合液。此处使用白色板进行演示，但应使用黑色板以减少视觉疲劳。

根据文本方案中的示意图，将2.5 µL稀释后的预扩增产物转移至384孔板中。此处显示的彩色骰子示意了固定通道移液器的转移顺序。转移完成后立即用铝箔密封膜 tightly 封盖板孔。

丢弃外层手套和袖套。将384孔板在PCR板离心机中离心20秒。不要移除铝箔封膜，直接将384孔板放入液体处理仪中。

打开包装，取出带有保护外壳的扩增板，小心地将其放入液体处理仪的第一个槽位中，确保序列号位于右侧；拿取时应仅握住外壳边缘，避免触碰板面。待所有组件就位后，移除液体处理仪内384孔板上的铝箔密封膜。点击“下一步”，然后在完成每个步骤后勾选相应的确认框。

关闭液体处理仪的门，并立即开始填充过程。停留在液体处理仪旁边，待微孔板填充完成后立即进入下一步操作。在液体处理仪运行的同时，从一个盒盖底部撕下保护膜。

保持顶部薄膜原位。轻轻拉动红色胶带以使其脱离粘合剂，完成引物准备。从液体处理仪中取出已加载的扩增板，将其轻轻放入压板机中，确保序列号位于右侧。

将盖子放在板上，带缺口的一端朝右，粘性面朝下。小心地向下拉动板压机手柄使其闭合，此时指示灯会闪烁20秒。在此期间请勿触碰板压机。

当指示灯变为稳定的绿色后，抬起杠杆，握住板的边缘，小心取出密封的反应板。在垂直握住密封扩增板边缘的同时，立即将注射器针头插入板盒末端的加样口，然后缓慢、轻柔且连续地注入浸没液，以填充板与盖膜之间的空间。当板完全浸入液体后，在角落处保留一个微小的气泡。

在继续用手指捏住芯片边缘保持其垂直的同时，将密封塞插入加样口并顺时针旋转，施加足够的压力直至手柄断裂脱落。使用经乙醇充分喷洒的无尘布清洁芯片外壳。为干燥外壳，用干净的无尘布自上而下擦拭外壳表面。

将密封好的反应板转移至扩增仪。在仪器选项卡下，选择仪器控制台。选择扩增仪，然后点击开门按钮。

将扩增板放入板适配器的第一个插槽中，确保适配器正确对齐，左上角标有数字“1”。将板的方向调整为条形码朝上，并朝向仪器前方。单击关闭门按钮后，导航至屏幕底部的主页选项卡。

在“运行”菜单下，选择 OpenArray。点击“获取板编号”。要开始运行，请点击“开始运行”。

打开包含结果宏的电子表格。在导出的数据文件中，右键单击屏幕底部的工作表标签，然后选择“移动或复制”。在“目标工作簿”字段中，选择“结果宏”。

然后单击“移至末尾”，并勾选标有“创建副本”的复选框。最后，单击“确定”。删除旧的导出标签，然后将新添加的标签重命名为“export”。

单击“视图”，然后选择“宏”，选中宏后单击“运行”。接下来，对 Macro2 重复此操作：依次单击“视图”、“宏”，选择 Macro2 并单击“运行”。在扩增仪软件中，通过单击屏幕左侧的“分析/扩增曲线”选项，将每个样本和对照的扩增曲线与宏表格进行比对。

然后，选择样本标签页，逐一点击每个样本，确认表格中每个阳性结果均有两条或三条阳性扩增曲线。通过将荧光读数与扩增循环次数作图，表明实时 PCR 已成功进行。大多数样本在实时 PCR 反应的第 2 至第 25 个循环之间达到相对阈值水平。

通过在三个不同日期进行的标准曲线实验，展示使用阳性对照时扩增的线性关系和检测范围。将循环阈值（Ct）与核酸标准品拷贝数的10为底对数进行绘图。两个宏程序将自动填写第一列中的样本名称，并计算每个靶标在阳性结果样本中三个Ct值的平均值。

未扩增的靶标在此表中显示为空白。本示例展示了10个临床样本和4个常规对照的定量结果，其中阴性扩增对照应对所有靶标均为阴性，而阴性提取对照应仅含有内标。该样本集中有一个样本的内标扩增失败，表明样本中存在抑制物。

观看本视频后，您应该能够充分掌握如何开展纳米级 PCR 实验。该方法将有助于更便捷地实施基于综合征的兽医诊断检测面板。此方法还可进行调整，以纳入多种不同传染病病原体的检测分析。