在动物标本呼吸道病原体的高通量检测通过纳米PCR

这种实时荧光定量 PCR 检测方法的总体目标是以高通量方式同时检测基于 DNA 和 RNA 的病原体。来自临床标本的核酸将使用加载到 OpenArray 板上的公共引物库进行预扩增，并分析是否存在病原体。这种方法可以帮助促进 OneHealth 对传染病的监测工作。

与传统技术相比，该方法允许针对更多目标测试更多样品，而不会相互竞争，从而提高测试效率。该方法使用定制的纳米级 PCR 板。引物和探针打印在通孔的边缘，并使用液体处理器加载样品。

我们将在正在测试马和狗的一组呼吸道病原体的临床标本上演示该方法。要开始此过程，请按照文本协议中的说明设计板。这里使用的板配置了 18 个靶标，一式三份。

将培养基添加到拭子和气管清洗液中，使至少有 1 到 2 毫升液体。在试管中用力涡旋拭子和 DMEM。然后，使用移液器将大约 1 毫升的培养基转移到新试管中。

向每个微珠管中加入 235 μL 裂解缓冲液和 175 μL 样品。按照制造商的方案提取总核酸。通过首先验证样品图，准备核酸或前置放大器的逆转录和预扩增，如文本方案中所述。

仅使用板的左侧，将 8.5 μL 前置放大器预混液和 5.5 μL DNA/RNA 样品添加到标准 96 孔板的每个孔中。将样品、阳性对照和阴性对照与前置放大器混合物混合后，用透明胶粘剂密封标准 96 孔板。使用剃须刀片去除任何多余的密封件，以防止在循环过程中形成密封间隙。

使用 PCR 板离心器将密封板离心 20 秒。检查以确保所有试剂都混合在板孔的底部。打开常规热循环仪后，选择前置放大器循环程序并启动该程序。

通过监测屏幕上的温度读数，只有当热循环仪的底部达到 cDNA 生产所需的温度时，才将 96 孔板放入热循环仪中。前置放大器运行完成后，验证板是否保持密封状态。戴上双层手套和袖套后，从前置放大器板上取下密封件。

然后，小心地取下并丢弃外手套。向 96 孔前置放大器板的第 1 至第 6 列的每个孔中加入 56 微升 TE 缓冲液，并通过上下移液混合，稀释前置放大器产物 1 至 5。为此，请仅转到移液器的第一个止动点，从底部吸出并向上分配，但不要产生气泡。

将 TE 缓冲液添加到所有六根柱中，无论未使用的孔如何。按照文本方案中的说明准备将 384 孔转移到扩增板。完成准备步骤后，戴上新的合身的双层手套和袖套。

由于低体积移液时蒸发速率高，因此高效分配预混液和样品并立即密封板至关重要。将 2.5 μL 扩增预混液添加到 384 孔板中。此处使用白色板用于演示目的，但应使用黑色板以减少眼睛疲劳。

根据文本方案中的映射，将 2.5 微升稀释的前置放大器产品转移到 384 孔板中。此处显示的彩色骰子说明了固定通道移液器的转移顺序。立即用铝箔密封盖紧板。

丢弃外手套和袖套。将 384 孔板在 PCR 板离心杯中离心 20 秒。不要取下铝箔密封，而是将 384 孔板放入液体处理器中。

打开装有封装扩增板的包装，小心地将其放入液体处理器中的第一个插槽中，序列号在右侧，握住包装盒的边缘，不要接触扩增板的表面。一切就绪后，从液体处理器内的 384 孔板上取下铝箔密封件。单击 下一步 ，然后在每个步骤完成后选中所有框。

关闭液体处理器的门，立即开始灌装过程。待在液体处理器旁边，并在板装满后立即进行下一步。在液体处理器运行时，撕下箱盖底部的保护膜。

将顶部薄膜留在原位。轻轻拉动繁文缛节，将其从胶粘剂中释放出来。从液体处理器中取出加载的扩增板，轻轻将其放入压板机中，序列号在右侧。

将盖子放在板的顶部，缺口端在右侧，粘合剂在底部。拉下压板杆，小心关闭它，指示灯将闪烁 20 秒。在此期间，请勿触摸印版机。

指示灯变为绿色常亮后，抬起控制杆并握住密封板的边缘，小心地将其取下。在垂直握住密封的扩增板的同时，立即将注射器尖端插入注射液盒末端的加载口，然后以一个轻柔的连续动作缓慢分配浸入液，以填充板和盖子之间的空间。板浸入后，在角落里留下一个小气泡。

在继续垂直握住板的边缘的同时，将塞子插入端口并顺时针旋转塞子以密封加载端口，施加足够的压力直到手柄折断。用彻底喷洒了乙醇的无绒湿巾清洁外壳。要擦干外壳，请用干净的抹布向下擦拭外壳。

将密封板带到扩增机上。在仪器选项卡下，选择 仪器控制台。选择放大机，然后单击开门按钮。

将放大板放入板适配器的第一个插槽中，检查适配器是否与左上角的适配器正确对齐。调整板的方向，使条形码朝上并朝向仪器的正面。单击关门按钮后，导航到屏幕底部的主页选项卡。

在运行菜单下，选择 OpenArray。单击 Get plate IDs（获取板 ID）。要开始运行，请单击 start run。

打开包含 results 宏的电子表格。在导出的数据文件中，右键单击屏幕底部的选项卡，然后选择 move or copy。在 目标书 字段中，选择 结果宏。

然后点击 move to end 并选中标有 create copy 的框。最后，点击 好的.删除旧的 export 选项卡，然后将新添加的选项卡重命名为 export。

依次单击 view 和 macros，选择 macro，然后单击 run。接下来，对 Macro2 重复此作，方法是依次单击 view 和 macros，选择 Macro2 并单击 run。在扩增机软件中，通过选择屏幕左侧的分析/扩增图，检查每个样品的曲线并根据宏表进行控制。

然后，选择样品选项卡并单击每个样品，以确认表中每个阳性结果都有两条或三条阳性扩增曲线。将荧光读数与扩增循环作图，以说明实时荧光定量 PCR 已成功进行。大多数样品在实时荧光定量 PCR 反应的第 2 个循环和第 25 个循环之间达到相对阈值水平。

绘制在三个不同日期运行的标准曲线，以证明使用阳性对照的线性和扩增范围。将循环阈值与核酸标准品拷贝数的对数以 10 为底的图谱作图。这两个宏将填写第一列中的样本名称，以及每个靶标的三个 Ct 值的平均值，用于具有阳性结果的靶标。

未扩增的靶标在此表中显示为空白。显示了 10 个临床样品和 4 个常规对照的定量结果，如此处所示，所有靶标的阴性扩增对照都应为阴性，而阴性提取对照应仅包含内部对照。该组中的一个样品显示内部对照失败，这表明样品中存在抑制剂。

观看此视频后，您应该对如何进行纳米级 PCR 实验有很好的了解。该程序将使在兽医诊断中运行基于综合征的面板变得更加容易。这种方法可以适用于包括许多不同传染病的病原体的论文。