基于RPA-CRISPR/Cas12a-SPM与深度学习的DNA病毒检测系统

本方案介绍了一种针对蛙病毒3型的快速且高灵敏度检测系统。该方法能够实现DNA病毒的即时检测，在预防大流行性疾病发生方面发挥着关键作用。该技术的主要优势在于将RPA与CRISPR/Cas12a系统相结合，并辅以便携式智能手机显微镜和人工智能分类技术。

这种整合显著提高了检测效率和准确性，同时减少了由人为因素引起的误差。首先，在反应缓冲液中加入四种关键的RPA酶，然后将预先设计的引物加入该混合物中。

充分涡旋混匀混合物。向每个RPA反应中加入1 µL从蛙病毒3型获得的目标DNA，并涡旋充分混匀。接着，用移液器加入7 µL 100 mmol/L氯化镁以启动反应。

将混合物在 37 摄氏度孵育 30 分钟以完成检测。将毛螺科细菌 CAS12a 蛋白与 CRISPR RNA 共同孵育，形成具有功能的复合物。将细菌蛋白与 10 X CRISPR/Cas12a 反应缓冲液混合。

现在加入500纳摩尔的单链DNA报告探针。将1微升RPA反应产物加入CRISPR/Cas12a CRISPR RNA反应混合物中。在37摄氏度下孵育该混合物30分钟。

使用酶标仪测量荧光信号。若使用智能手机显微镜进行检测，首先将制备好的反应混合物移液至经处理的玻片上，然后在孵育前加盖盖玻片。

将载玻片放置在智能手机显微镜的载物台上，调整焦距和清晰度。拍摄图像以测量荧光信号。使用 ImageJ 测量每张图像的平均灰度值以及同一浓度组中平均灰度值的标准差。

采用深度学习模型 AlexNet 33 进行分类。现在使用 Python 将输入图像重塑为 224 × 224 × 三个通道。最后，使用在 ImageNet 数据集上预训练的骨干网络提取图像特征。

第六对引物提供了最高的扩增效率，因此被选用。CRISPR RNA-3 在旁切反应中表现出最高的效率。使用选定的 RPA 引物和 CRISPR RNA 构建的检测系统，可在 10 aM FV3 与对照之间产生显著差异。

需要牢记的最重要一点是特定的 CAS 12a 检测步骤。可根据 CAS 12a 检测对反应中的 CRISPR RNA 进行修饰或重新设计，以靶向其他 DNA 病毒。所提出的方法可有助于对目标病毒的数量进行初步评估。

基于此，可采用其他方法（如 qPCR）来获得更准确的病毒载量。该技术为 DNA 病毒的便携式检测提供了初步尝试。对于本方案中使用的蛙病毒 3 号（frog virus 3），及时检测可促使采取有效的防护措施，从而减少养殖业的损失。