Name: 基于RPA-CRISPR/Cas12a-SPM和深度学习的DNA病毒检测系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: 学习基于RPA-CRISPR/Cas12a结合智能手机显微镜和深度学习AlexNet模型的DNA病毒快速检测方法，用于蛙病毒3的现场即时诊断。该技术整合等温扩增与基因编辑系统，提高检测效率与准确性，适用于水产养殖业的病毒监测与公共卫生防护。

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本工作得到国家自然科学基金 31970752、深圳市科技创新委员会 JCYJ20190809180003689、JSGG20200225150707332、JSGG20191129110812708、WDZC20200820173710001；深圳湾实验室开放基金 SZBL2020090501004；中国博士后科学基金 2020M680023；中华人民共和国海关总署 2021HK007 的支持。

1. 样品处理
<ol>
	<li>取蛙病毒3型（Frog Virus 3，FV3，属Ranavirus，科Iridoviridae），一种双链DNA病毒。选择主要衣壳蛋白（mcp）基因为FV3的检测靶标，因其高度保守，通常被视为蛙病毒检测的靶标。所选靶序列见表1。 
	注意：本方案中以蛙病毒3型为例。</li>
	<li>对于靶DNA片段的制备，使用来自FV3和传染性脾肾坏死病毒（ISKNV，另一种蛙病毒）的mcp基因DNA片段。 
	注意：本研究中，靶DNA片段通过商业途径获得，供应商列于材料表中。这些片段将作为后续检测的靶标和对照。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td colspan="3">序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">FV3 MCP</td>
			<td colspan="3">NTS: 5’ …gtaacccggctttcGGGCAGCAGTTTCGGTCGGCGTtcccaggtcg… 3’ (240 bp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">TS: 5’ …ccgacctgggaACGCCGACCGAAACTGCTGCCCtgctgcccgaaagc… 3’ (240 bp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">ISKNV MCP</td>
			<td colspan="3">NTS: 5’ …ggccatgccaatttTGGGCAGGAGTTTAGTGTGACGgtggcgaggg… 3’ (231 bp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">TS: 5’ …ccctcgccaccgtcACACTAAACTCCTGCCCAAAATtggcatggcc… 3’ (231 bp)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本方法中选定的靶序列。
2. RPA 反应
<ol>
	<li>针对目标序列设计并合成RPA引物对。RPA引物对的序列见表2。</li>
	<li>配制5x RPA反应缓冲液（表3）和MgCl2（100 mM）。</li>
	<li>将四种关键RPA酶（UvsX、UvsY、GP32、Bsu蛋白）与预先设计的引物一同加入1x RPA反应缓冲液中，具体成分见表4。</li>
	<li>充分涡旋混匀该混合物。</li>
	<li>每个RPA反应中加入1 µL来自步骤1获得的目标样本，并再次涡旋充分混匀。</li>
	<li>加入7 µL MgCl2（100 mM）以启动反应。每个RPA反应的终体积为50 µL。</li>
	<li>在37 °C下反应30分钟。</li>
	<li>RPA产物可在4 °C保存数天。由于RPA产物会逐渐降解，建议尽快用于后续检测以获得更佳的诊断结果。</li>
	<li>[可选] 进行DNA凝胶电泳。
	<ol>
		<li>取5 µL RPA产物，加入适量6x DNA上样缓冲液，在Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液中进行DNA凝胶电泳。</li>
		<li>在120 V电压下电泳约20分钟，直至指示染料条带迁移至凝胶底部。</li>
		<li>通过比较样品条带与DNA Marker条带的大小，判断目标序列是否从样本中成功扩增。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td>序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA 引物 F</td>
			<td>ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA 引物 R</td>
			<td>GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：本方法中使用的RPA引物。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>原始浓度</td>
			<td>添加量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 20,000</td>
			<td>-</td>
			<td>114 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>125 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>48 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>1 M</td>
			<td>125 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>1 M</td>
			<td>125 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸肌酸</td>
			<td>1 M</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肌酸激酶</td>
			<td>10 μg/μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>-</td>
			<td>277 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：5x RPA 反应缓冲液（pH 7.5）的组成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>原始浓度</td>
			<td>添加量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x RPA 反应缓冲液</td>
			<td>-</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UvsX 蛋白</td>
			<td>5 mg/mL</td>
			<td>2.6 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UvsY 蛋白</td>
			<td>5 mg/mL</td>
			<td>0.9 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP32 蛋白</td>
			<td>5 mg/mL</td>
			<td>2.54 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsu 蛋白</td>
			<td>5 mg/mL</td>
			<td>0.88 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>正向引物</td>
			<td>100 μM</td>
			<td>0.25 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反向引物</td>
			<td>100 μM</td>
			<td>0.25 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>-</td>
			<td>24.58 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>靶标</td>
			<td>-</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*MgCl2</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>7 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td></td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*MgCl2 需最后加入以启动 RPA 反应。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：RPA反应的组成。
3. 无需 SPM 的 CRISPR/Cas12a 检测
<ol>
	<li>使用靶序列的crRNA（材料表）以及连接了荧光团和淬灭基团的单链DNA（ssDNA）报告探针进行CRISPR/Cas12a检测。此处，羧基四甲基罗丹明（TAMRA）作为荧光团连接在ssDNA报告探针的5'端，Black Hole Quencher-2（BHQ2）作为淬灭基团连接在3'端。crRNA和ssDNA报告探针的具体序列见表5。</li>
	<li>准备Lachnospiraceae bacterium Cas12a（LbCas12a）蛋白及10倍浓度的CRISPR/Cas12a反应缓冲液。</li>
	<li>将第2部分中的1 µL RPA反应产物溶解于1倍浓度的CRISPR/Cas12a反应缓冲液中，加入LbCas12a-crRNA复合物和500 nM的ssDNA报告探针，总体积为100 µL。</li>
	<li>将LbCas12a与crRNA混合后，静置至少5分钟以形成功能性复合物。孵育完成后，向反应体系中加入其他组分，并在37 °C下进行整个反应。每次CRISPR/Cas12a反应的终体积为100 µL。各组分在每次CRISPR/Cas12a反应中的具体浓度见表6。</li>
	<li>在37 °C下进行100 µL的CRISPR/Cas12a检测反应，持续30分钟。</li>
	<li>使用酶标仪持续检测荧光信号，激发波长为535 nm，发射波长为595 nm，增益设为60。 
	注意：激发光和发射光的不同波长检测取决于先前设计的ssDNA报告探针中所选用的荧光团和淬灭基团。</li>
	<li>对所采集的数据，以阴性对照值除以阳性样本的测量值进行数据归一化处理，随后进行双样本t检验分析。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td colspan="2">序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV3 的 LbCas12a crRNA</td>
			<td colspan="2">uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA 报告探针</td>
			<td colspan="2">/5TAMRA/TTATT/3BHQ2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：本方法中使用的CRISPR/Cas12a crRNA和ssDNA报告分子的序列。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>原始浓度</td>
			<td>添加量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer r2.1&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lba Cas12a (Cpf1)</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>0.5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crRNA</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>0.625 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">至少等待 5 分钟，使 LbCas12a/crRNA 复合物充分结合。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 报告分子</td>
			<td>100 μM</td>
			<td>0.5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>-</td>
			<td>87.375 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>靶标</td>
			<td>-</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>-</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表6：CRISPR/Cas12a 反应体系的组成。
4. SPM 设置
<ol>
	<li>在激发光路中，使激光束通过中性密度（ND）滤光片，以衰减激光强度。</li>
	<li>使用非球面透镜（下文简称 L1）产生准直光束，并通过二向色镜（DM）将其反射。</li>
	<li>将光束引导至放置样品的载玻片，通过物镜（20倍）照射并激发样品的荧光。样品载物台可实现焦平面的精确调节，将光束指向物镜的后焦平面。上述步骤构成了SPM仪器的激发光路。</li>
	<li>在发射光路中，放置一个外部透镜（下文简称 L2），在物镜另一侧形成中间像。物镜同时用于照射样品并收集发射信号。</li>
	<li>将智能手机置于发射光路末端，用于记录样品发出的荧光信号。使用稳定的支架以避免抖动。</li>
	<li>在 L1 与智能手机相机之间设置一个带通滤光片，以滤除激发光，仅允许样品发射的光到达相机，从而优化检测效果。</li>
	<li>将SPM装置固定在光学面包板上，以实现便携式部署。 
	注意：基于RPA-CRISPR/Cas12a反应的荧光检测SPM设备的示意图及实物图见图2。CRISPR/Cas12a检测在下一步所述的预处理载玻片上进行。</li>
</ol>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64833/64833fig02.jpg" /> 
图2：用于荧光检测的SPM装置的示意图与实物外观。（A）RPA-CRISPR/Cas12a反应后用于荧光成像的SPM装置实物图。（B）基于RPA-CRISPR/Cas12a反应的SPM荧光检测装置示意图。该图经修改（调整图像位置和颜色）后转载自Lei等35，已获许可。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/64833fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
5. 原子力显微镜检测用载玻片的处理
<ol>
	<li>按10:1的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基料与固化剂，随后在80 °C的加热板上烘烤2 h，以制备PDMS。</li>
	<li>将PDMS和载玻片（长度：75 mm；高度：50 mm）均用氧气等离子体处理120 s，然后将二者压合在一起。</li>
	<li>在95 °C下将玻璃/PDMS烘烤2 h，通过Si-O-Si键实现永久密封。PDMS具有高透明性且无自发荧光，有利于SPM检测。载玻片与PDMS的处理参照He等32的方法进行。</li>
</ol>
6. 基于SPM的CRISPR/Cas12a检测
<ol>
	<li>使用靶序列的crRNA（材料表）以及连接了荧光团和淬灭基团的单链DNA（ssDNA）报告探针进行CRISPR/Cas12a检测。在本方法中，四甲基罗丹明羧酸（TAMRA）作为荧光团连接在ssDNA报告探针的5'端，Black Hole Quencher-2（BHQ2）作为淬灭基团连接在3'端。crRNA和ssDNA报告探针的具体序列见表5。</li>
	<li>准备Lachnospiraceae bacterium Cas12a（LbCas12a）蛋白及10倍浓度的CRISPR/Cas12a反应缓冲液。</li>
	<li>将第2部分的1 µL RPA反应产物溶解于含有LbCas12a-crRNA复合物和500 nM ssDNA报告探针的1倍CRISPR/Cas12a反应缓冲液中，总体积为100 µL。</li>
	<li>将LbCas12a与crRNA混合后，静置至少5分钟以形成功能性复合物。孵育完成后，向反应体系中加入其余组分，并在37 °C下完成反应。每次CRISPR/Cas12a反应的终体积为100 µL。各组分在每次CRISPR/Cas12a反应中的具体浓度见表6。</li>
	<li>在预处理的载玻片上进行100 µL的CRISPR/Cas12a检测反应，并加盖盖玻片。将载玻片置于室温下孵育10分钟。</li>
	<li>使用SPM测量荧光信号。将进行检测反应的载玻片放置在SPM的载物台上，保持适当距离，调节焦距和清晰度，然后寻找反应视野并聚焦以获取图像。 
	&#8203;注意：应首先建立标准曲线，以便将样品数据换算为近似的浓度范围。使用不同浓度的纯化靶标进行检测，包括10 nM、1 nM、100 pM和10 pM，并以前RPA阶段的另一种病毒作为阴性对照。</li>
</ol>
7. 数据集与数据增强
<ol>
	<li>将第6节检测实验中获得的荧光图像作为数据集。每个样本至少重复三次平行检测，以确保数据的平行性。
	<ol>
		<li>可采用一些适当的方法来提高平行性。例如，在采集每个样本的荧光图像时，手动调焦并寻找相对明亮的视野进行成像；同时，对每个样本在五个以上不同位置拍摄图像，以获取更全面的荧光信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用ImageJ软件测量每幅图像的平均灰度值，以及同一浓度组内平均灰度值的标准差。</li>
	<li>设定一个强度范围 [中位数 - 标准差, 中位数 + 标准差]，用于数据清洗。 
	&#8203;注意：在前期步骤获得的图像中，可能存在差异较大的图像，因此需要进行筛选。若图像的强度超出设定阈值范围，则视为异常值并予以剔除。</li>
	<li>将对应于目标物纯品在浓度递增条件下的图像，按浓度从低到高依次标记为0–6。</li>
	<li>为增强系统的鲁棒性并防止过拟合，通过Python中的变换函数实施图像增强技术，如水平翻转、垂直翻转和添加随机噪声，以在数据集中引入更多变异。</li>
</ol>
8. 迁移学习
<ol>
	<li>作为骨干网络，采用深度学习模型 AlexNet33 用于分类。</li>
	<li>为满足第7节中预训练模型的约束条件，将输入图像重塑为224像素 × 224像素 × 3通道&#160;（高度和宽度为 224 像素，通道数为 3）&#160;通过 Python 中的变换函数对红色、绿色和蓝色颜色通道进行处理。 
	注意：此步骤是迁移学习中针对异构数据的常见预处理步骤，包括变换。</li>
	<li>使用在 ImageNet 数据集上预训练的骨干网络提取特征，同时利用所学习的中间隐藏层的权重。</li>
	<li>在荧光分类任务中，将神经网络原有的全连接层（该层最初包含1000个神经元，用于ImageNet任务）替换为一个包含2个或7个神经元的全连接层。</li>
	<li>基于 Lawton 和 Viriri 的方法，通过一系列指标评估训练模型的性能，包括混淆矩阵、准确率、精确率、召回率和 F1 分数34.</li>
</ol>

<ol><li>Gire, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+surveillance+elucidates+Ebola+virus+origin+and+transmission+during+the+2014+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak.</a> Science. 345 (6202), 1369-1372 (2014).</li>
<li>The Ebola Outbreak Epidemiology Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+Ebola+virus+disease+in+the+Democratic+Republic+of+the+Congo%2C+April-May+2018%3A+an+epidemiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Outbreak of Ebola virus disease in the Democratic Republic of the Congo, April-May 2018: an epidemiological study.</a> Lancet. 392 (10143), 213-221 (2018).</li>
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<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+all-solution+phase+African+Swine+Fever+Virus+%28ASFV%29+detection+using+CRISPR-Cas12a+and+fluorescence+based+point-of-care+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">High-throughput and all-solution phase African Swine Fever Virus (ASFV) detection using CRISPR-Cas12a and fluorescence based point-of-care system.</a> Biosens Bioelectron. 154, 112068(2020).</li>
<li>Krizhevsky, A., Sutskever, I., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageNet+classification+with+deep+convolutional+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+ACM%22%5BJournal%5D)">ImageNet classification with deep convolutional neural networks.</a> Commun. ACM. 60 (6), 84-90 (2017).</li>
<li>Lawton, S., Viriri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+COVID-19+from+CT+lung+scans+using+transfer+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Intell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detection of COVID-19 from CT lung scans using transfer learning.</a> Comput Intell Neurosci. 2021, 5527923(2021).</li>
<li>Lei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+frog+virus+3+by+integrating+RPA-CRISPR%2FCas12a-SPM+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Detection of frog virus 3 by integrating RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with deep learning.</a> ACS Omega. 8 (36), 32555-32564 (2023).</li>
<li>Chen, Z., Huang, J., Zhang, F., Zhou, Y., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+shrimp+hemocyte+iridescent+virus+by+recombinase+polymerase+amplification+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection of shrimp hemocyte iridescent virus by recombinase polymerase amplification assay.</a> Mol Cell Probes. 49, 101475(2020).</li>
<li>Fu, X., Sun, J., Ye, Y., Zhang, Y., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+ultrasensitive+dual+detection+platform+based+on+Cas12a+for+simultaneous+detection+of+virulence+and+resistance+genes+of+drug-resistant+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A rapid and ultrasensitive dual detection platform based on Cas12a for simultaneous detection of virulence and resistance genes of drug-resistant Salmonella.</a> Biosens Bioelectron. 195, 113682(2022).</li>
<li>Habimana, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+of+CRISPR%2FCas+nucleases+for+programmable+targeting+and+early-stage+diagnosis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights of CRISPR/Cas nucleases for programmable targeting and early-stage diagnosis: A review.</a> Biosens Bioelectron. 203, 114033(2022).</li>
<li>Liang, Y., Lin, H., Zou, L., Deng, X., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+tracking+of+Omicron+variant+of+SARS-CoV-2+using+CRISPR-Cas12a-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and tracking of Omicron variant of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas12a-based assay.</a> Biosens Bioelectron. 205, 114098(2022).</li>
<li>Sivaraman, D., Biswas, P., Cella, L. N., Yates, M. V., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+RNA+viruses+in+living+mammalian+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Detecting RNA viruses in living mammalian cells by fluorescence microscopy.</a> Trends Biotechnol. 29 (7), 307-313 (2011).</li>
<li>Wang, I. H., Burckhardt, C. J., Yakimovich, A., Greber, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging%2C+tracking+and+computational+analyses+of+virus+entry+and+egress+with+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Imaging, tracking and computational analyses of virus entry and egress with the cytoskeleton.</a> Viruses. 10 (4), 166(2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本方法中，我们开发了一种在人工智能辅助下的快速、易于实施、高灵敏度、序列特异性的即时检测（POC）DNA病毒检测系统。在获取样本后，首先采用RPA技术扩增目标序列，随后CRISPR/Cas12a可识别目标DNA并释放荧光信号，从而放大检测信号。通过构建便携式智能手机显微镜采集荧光图像，并利用结合迁移学习的深度学习模型对阳性与阴性样本的图像进行二分类判读。本方法以FV3作为阳性样本，从多个角度对其进行研究，以提升所提出系统的特异性和灵敏度。
第一种策略是设计特异性的RPA引物，并筛选出效率最高的引物。RPA反应的扩增效率受不同引物的影响36。用于扩增DNA病毒株目标基因的引物特异性，可通过与核苷酸序列标准数据库进行比对（blast）来确认。由于目前尚无设计高效RPA引物对的指导原则，因此需要通过实验验证37。
另一种方法是针对目标病毒设计用于CRISPR/Cas12a反应的crRNA，因为附带切割效率显著影响检测的灵敏度38,39。在选择更优crRNA时，需考虑在不使用RPA的情况下CRISPR/Cas12a反应所触发的荧光信号强度。此外，LbCas12a蛋白的附带活性可持续激活长达24小时32，这有利于检测的进行。
为了鉴定病毒并可视化病毒颗粒，已应用荧光显微镜技术40,41。然而，传统显微镜在快速床旁诊断（POC）中操作繁琐且成本较高。因此，在本系统中，构建了一种低成本的便携式SPM，通过捕获图像来获取荧光信号，以实现床旁检测。这种便携式SPM的成本远低于商用酶标仪或实时PCR仪，有利于降低检测系统的搭建成本。
该平台在某些方面仍需进一步改进。当将此检测平台应用于其他DNA病毒检测时，需要重新设计RPA引物和Cas12a-crRNA序列。由于目前尚无明确的设计指南，必须通过实验评估其效率。尽管该系统已具备便携性优势，但整体尺寸仍需进一步缩小，以实现更轻便的设计。此外，由于手机摄像头在近距离拍摄时难以对焦，在获取荧光图像的过程中需要花费时间调整视野，以获得质量更佳的图像。
随着相关技术的进步及其新应用的出现，即时检测（POC）的效率将持续提升。本文介绍的方法即是一种改进示例，可通过CRISPR/Cas12a系统与SPM平台结合，并在新型人工智能辅助下，助力即时检测的发展。此外，由于crRNA具有可重新编程的特性，该集成系统还可用于识别任何DNA靶标。RPA-CRISPR/Cas12a-AI系统在DNA病原体检测的灵敏度、特异性、检测时间及可靠性方面，将在未来占据重要地位。

近年来，由不同病毒引起的传染病疫情频繁发生，包括2014年1和2018年2的埃博拉病毒病（EVD）疫情、2015年的中东呼吸综合征（MERS）3、2015年的寨卡病毒病疫情4、由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）5，以及2022年持续发生的由猴痘病毒（MKPV）引起的猴痘疫情6。这些突发性传染病疫情造成了大量人员死亡，并带来了巨大的经济损失和社会动荡。因此，迫切需要建立一种快速且准确的检测系统，以实现对感染的快速诊断，并防止病毒进一步传播。
近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas）受到全球广泛关注，并在核酸检测方面展现出良好的应用前景7,8,9,10,11,12,13,14,15。CRISPR/Cas12a 蛋白在 CRISPR RNA（crRNA）的引导下，可结合并切割目标 DNA。该活性可引发非特异性单链 DNA（ssDNA）的释放，即反式切割效应，可用于增强核酸检测的检测信号。一些传统检测方法，如聚合酶链式反应（PCR）、定量实时 PCR（qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA），在即时检测（POC）中存在操作复杂、耗时长且成本高的问题。我们前期工作已成功开发出一种基于 CRISPR/Cas12a 技术的自动化、集成化且成本效益高的非洲猪瘟病毒（ASFV）检测系统。在该系统中，无需扩增步骤，即可在 2 小时内实现 1 pM 的检测限。该系统结合了 CRISPR/Cas12a 与重组酶聚合酶扩增（RPA）技术，以提高痕量 DNA 检测的灵敏度和特异性。与其他等温扩增技术相比，RPA 设计简单、操作便捷，因其反应时间更短，且无需复杂的温度控制设备。
为了实现对病原体的即时检测（POC），已开发出智能手机显微镜（SPM）、手持式荧光仪或侧向流动试纸条等仪器用于结果读取16,17,18。SPM 通过摄像头捕获图像，并将其上传至移动应用程序以进行快速数据分析。此类显微镜构建了一个便携、廉价且微型化的信号采集系统，具有高灵敏度，已在检测 H5N1、寨卡病毒和 SARS-CoV-2 等病原体方面展现出优势19,20。&#160;因此，我们构建了一套便携式 SPM 系统，用于捕获由 RPA-CRISPR/Cas12a 检测目标 DNA 病毒所触发的荧光信号。当 CRISPR/Cas12a 识别到目标 DNA 病毒时，连接了荧光团和淬灭基团的单链 DNA 报告探针将被切割，荧光团所发射的荧光可被 SPM 捕获。
与通常用于从SPM21荧光图像中获取结果信息的专业软件相比&#160;，一些专家采用机器学习和深度学习方法在获得荧光图像后对病毒DNA浓度进行量化22，但该方法耗时更长。在医学图像分类方面，通常使用传统的卷积神经网络（CNN）以端到端的方式直接从原始像素化图像中学习特征23,24,25,26。基于CNN的主流深度学习模型，如AlexNet、DenseNet-121和EfficientNet-B7，已在该领域成功应用27,28。然而，在特定领域获取大规模数据集往往具有挑战性，因此需要采用迁移学习29,30。该方法首先利用大规模数据集对深度学习模型进行预训练，然后将预训练模型作为小数据集新任务的起点。该技术可减少对大规模数据集的需求，缓解过拟合问题，并缩短训练时间31。本文中，我们采用结合迁移学习的深度学习模型对阳性与阴性样本的荧光图像进行二分类。
本方法中，我们结合重组酶聚合酶扩增技术（RPA）与CRISPR/Cas12a系统，用于DNA病毒的痕量检测。目标DNA分别由RPA和CRISPR/Cas12a进行扩增与识别，从而激活Cas12a的旁切活性，切割带有荧光基团和淬灭基团标记的DNA报告分子，产生荧光信号。我们构建了一套便携式SPM装置用于采集荧光图像，实现即时检测（POC），并开发了深度学习模型用于二分类判读。所构建的POC检测系统示意图见图1。&#160;该RPA-CRISPR/Cas12a-SPM系统结合人工智能（AI）辅助分类，无需专业操作人员和大型仪器，展现出在即时DNA病毒检测中的巨大应用潜力。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64833/64833fig01.jpg" /> 
图 1：RPA-CRISPR/Cas12-SPM 检测系统示意图及所采集图像的 AI 分类。 动物源性样本中的核酸通过 PINDBK 释放。病毒的靶标 DNA 由 RPA-CRISPR/Cas12a 系统进行特异性扩增与识别。CRISPR/Cas12a 与 crRNA 结合，形成的 Cas12a-crRNA 复合物与靶标 DNA 结合，从而激活 CRISPR/Cas12a 对单链 DNA 报告探针的附带切割作用。报告探针上的荧光基团被释放，荧光信号可由商用酶标仪或我们构建的 SPM 装置检测。采用三种不同的深度学习模型——包括 AlexNet、DenseNet-121 和 EfficientNet-B7，并结合迁移学习对荧光图像进行分类。该图经 Lei 等人许可重复使用35。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/64833fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>

<table><tbody><tr><td>20倍扩增</td><td>OLYMPUS</td><td>OPLN20X</td><td></td></tr><tr><td>532 nm 绿色激光器</td><td>Thorlabs</td><td>PL201</td><td>输出功率为 0.9 mW</td></tr><tr><td>535 nm 截止波长</td><td>chrome</td><td>AT535</td><td></td></tr><tr><td>6x DNA 上样缓冲液</td><td>Thermo scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>96孔黑色微孔板</td><td>Corning Incorporated</td><td>3603</td><td>黑色，带透明平底</td></tr><tr><td>非球面透镜</td><td>Lubang</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>SEMROCK</td><td>FF01-542/27-25</td><td></td></tr><tr><td>Bsu DNA 聚合酶</td><td>ATG Biotechnology</td><td>M103</td><td>大片段</td></tr><tr><td>crRNA</td><td>Sangon Biotech</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DNA 片段</td><td>Sangon Biotech</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜支架</td><td>Ruicage</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>SEMROCK</td><td>FF555-Di03-25x36</td><td>截止波长为 535 nm</td></tr><tr><td>E.Z.N.A 凝胶回收试剂盒</td><td>Omega Biotek</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>EnGen Lba Cas12a (Cpf1)</td><td>New England Biolabs (Beijing) LTD</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>滤光片支架</td><td>Ruicage</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>荧光团-单链DNA-淬灭剂报告探针</td><td>Sangon Biotech</td><td>N/A</td><td>5'端使用 TAMRA（羧基四甲基罗丹明）作为荧光团；3'端使用 BHQ2（黑洞淬灭剂-2）作为淬灭剂</td></tr><tr><td>GP32</td><td>ATG Biotechnology</td><td>M104</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>开源软件</td><td>版本 1.53t 24</td><td>从 https://imagej.nih.gov/ij/&amp;nbsp; 下载</td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>SPARK, TECAN</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>多模块梯度PCR仪</td><td>LongGene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer r2.1</td><td>New England Biolabs (Beijing) LTD</td><td>B6002S</td><td>10x CRISPR/Cas12a 反应缓冲液</td></tr><tr><td>氧气等离子体处理&amp;nbsp;</td><td>Electro-Technic&amp;nbsp; Products</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>病原体灭活、无需核酸提取、直接用于PCR的蛋白酶K缓冲液（PINDBK）</td><td>Ebio</td><td>PINDBK -25mL</td><td></td></tr><tr><td>PCR引物对</td><td>Sangon Biotech</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>RPA引物对</td><td>Sangon Biotech</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>智能手机</td><td>Huawei</td><td>Mate10</td><td></td></tr><tr><td>平移台</td><td>Ruicage</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>透射式中性密度滤光片</td><td>Thorlabs</td><td>ND40A</td><td></td></tr><tr><td>三胶合消色差透镜</td><td>Thorlabs</td><td>TRH127-020-A</td><td></td></tr><tr><td>UvsX</td><td>ATG Biotechnology</td><td>M105</td><td></td></tr><tr><td>UvsY</td><td>ATG Biotechnology</td><td>M106</td><td></td></tr></tbody></table>

基于rpa-crispr/cas12a-spm与深度学习的dna病毒检测系统

DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

我们报道了一种快速、易于实施、高灵敏度、序列特异性的即时检测（POC）DNA病毒检测系统，该系统结合了重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a技术，用于痕量DNA病毒的检测。目标DNA分别通过RPA和CRISPR/Cas12a进行扩增与识别，从而激活Cas12a的旁切活性，切割带有荧光基团-淬灭基团标记的DNA报告探针，产生荧光信号。为实现即时检测，系统构建了便携式智能手机显微镜以采集荧光图像。此外，系统内部署了用于阳性或阴性样本二分类的深度学习模型，具有高准确率。以蛙病毒3型（FV3，属Ranavirus，虹彩病毒科Iridoviridae）为例对该DNA病毒POC检测系统进行了测试，检测限（LoD）可在40分钟内达到10 aM。该便携式、微型化的RPA-CRISPR/Cas12a-SPM系统结合人工智能（AI）辅助分类，无需专业操作人员和大型仪器，展现出在DNA病毒即时检测中的巨大潜力，有助于防止此类病毒的传播。

该方法聚焦于一种快速、易于实施、高灵敏度且适用于现场即时检测（POC）的DNA病毒检测系统。RPA反应的引物对设计以及CRISPR/Cas12a反应的crRNA设计是其中两个关键环节，因为它们将影响RPA-CRISPR/Cas12a反应的效率，并进而影响后续的检测与分型。
在此方法中，蛙病毒3型（FV3）被用作DNA病毒检测的示例。设计了若干对针对FV3的RPA引物，筛选出效率最高的一对，并通过凝胶电泳检测RPA扩增产物的条带亮度和大小（如步骤2.8所述）来确认其具有良好的扩增效率。同时，设计了CRISPR/Cas12a系统的crRNA，并根据在无RPA反应条件下CRISPR/Cas12a系统触发的荧光信号强度筛选出效率最高的crRNA。三对RPA正向引物、三对反向引物以及三条Cas12a crRNA的序列如下所示 表7根据琼脂糖凝胶电泳结果所示 图3，第6th 一对引物具有更高的扩增效率（F2 和 R1），被选用于该方法。如图所示 图 4，crRNA-3 在附带切割方面效率最高，因此在本方法中被选用。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPA 引物 F1</td>
			<td colspan="2">ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA 引物 F2</td>
			<td colspan="2">ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA 引物 F3</td>
			<td colspan="2">TCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAGTGGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA 引物 R1</td>
			<td colspan="2">GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA 引物 R2</td>
			<td colspan="2">GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA 引物 R3</td>
			<td colspan="2">CGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAACG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LbCas12a crRNA-1</td>
			<td colspan="2">uaauuucuacuaaguguagauATCGACTTGGCCACTTATGACAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LbCas12a crRNA-2</td>
			<td colspan="2">uaauuucuacuaaguguagauTCAAGGAGCACTACCCCGTGGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LbCas12a crRNA-3</td>
			<td colspan="2">uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表7：用于反应优化的RPA引物和crRNA序列。
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64833/64833fig03.jpg" /> 
图3：用于评估RPA效率的琼脂糖凝胶电泳结果。 RPA反应在相同条件下使用不同引物组合进行，目标物浓度为1 nM的纯化样品。编号1代表RPA-F3与RPA-R3的组合，2代表RPA-F3与RPA-R2，3代表RPA-F3与RPA-R1，4代表RPA-F2与RPA-R3，5代表RPA-F2与RPA-R2，6代表RPA-F2与RPA-R1，7代表RPA-F1与RPA-R3，8代表RPA-F1与RPA-R2，9代表RPA-F1与RPA-R2。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/64833fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64833/64833fig04.jpg" /> 
图4：利用CRISPR/Cas12a系统通过三种不同的crRNA检测FV3靶标片段。 检测中使用的纯化片段浓度范围为10 nM至100 pM的靶标DNA，对照DNA浓度为10 nM，孵育时间为30分钟。此图经Lei等人35许可重用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/64833fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
为了生成图5中的数据，我们采用了优化的RPA引物、crRNA以及SPM装置。为了更好地评估样本中的浓度，我们利用PCR扩增试剂盒对蛙病毒3型（FV3）和传染性脾肾坏死病毒（ISKNV，Iridoviridae科）的高度保守的主要衣壳蛋白（MCP）基因的240 bp DNA片段进行扩增，分别作为检测靶标和对照，具体操作步骤如表8所示。通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增DNA的大小，并从凝胶中回收纯化双链DNA靶标和对照片段。使用NanoDrop 2000分光光度计对纯化的DNA片段进行定量。
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64833/64833fig05.jpg" /> 
图5：纯化的目标DNA与对照DNA的荧光图像。（A）阴性对照。（B）纯化的目标DNA（100 pM）。该图经Lei等35许可重用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/64833fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>阶段</td>
			<td>温度 (°C)</td>
			<td>时间</td>
			<td>循环数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>热启动</td>
			<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变性</td>
			<td>95</td>
			<td>30 s</td>
			<td rowspan="3">35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>退火</td>
			<td>60</td>
			<td>45 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>延伸</td>
			<td>72</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>延伸</td>
			<td>72</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>保存</td>
			<td>4</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表8：PCR扩增操作步骤。
作为参考，数据清洗后获得了一个包含 162 张荧光图像的数据集。进一步分析所需的荧光图像数量需要扩充，因此我们分别使用 337 张荧光图像进行二分类训练，以及 398 张图像进行多分类训练。
我们在约40分钟内完成了检测，其中包括30分钟的RPA扩增和RPA后10分钟的LbCas12a检测。使用所开发的检测系统配合选定的RPA引物和crRNA时，10 aM FV3与对照组的信号强度显示出显著差异，如补充图1所示。
补充图1：使用不同浓度纯化片段在RPA-LbCas12a反应中采集的荧光图像信号强度统计结果。*：p &#60; 0.05；**：p &#60; 0.01；***：p &#60; 0.001；****：p &#60; 0.0001；F：FV3，I：ISKNV；a.u.：吸收单位。本图经Lei等35许可重用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/revised-LoD.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们提出了一种将重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a系统相结合的方案，用于DNA病毒的痕量检测，并构建了便携式智能手机显微镜，结合人工智能辅助分类，实现现场DNA病毒检测。

基于RPA-CRISPR/Cas12a-SPM与深度学习的DNA病毒检测系统

我们报告了一种快速、易于实施、高灵敏度、序列特异性的即时检测（POC）DNA病毒检测系统，该系统结合了重组酶……

本方案介绍了一种针对蛙病毒3型的快速且高灵敏度检测系统。该方法能够实现DNA病毒的即时检测，在预防大流行性疾病发生方面发挥着关键作用。该技术的主要优势在于将RPA与CRISPR/Cas12a系统相结合，并辅以便携式智能手机显微镜和人工智能分类技术。这种整合显著提高了检测效率和准确性，同时减少了由人为因素引起的误差。首先，在反应缓冲液中加入四种关键的RPA酶，然后将预先设计的引物加入该混合物中。充分涡旋混匀混合物。向每个RPA反应中加入1 µL从蛙病毒3型获得的目标DNA，并涡旋充分混匀。接着，用移液器加入7 µL 100 mmol/L氯化镁以启动反应。将混合物在 37 摄氏度孵育 30 分钟以完成检测。将毛螺科细菌 CAS12a 蛋白与 CRISPR RNA 共同孵育，形成具有功能的复合物。将细菌蛋白与 10 X CRISPR/Cas12a 反应缓冲液混合。现在加入500纳摩尔的单链DNA报告探针。将1微升RPA反应产物加入CRISPR/Cas12a CRISPR RNA反应混合物中。在37摄氏度下孵育该混合物30分钟。使用酶标仪测量荧光信号。若使用智能手机显微镜进行检测，首先将制备好的反应混合物移液至经处理的玻片上，然后在孵育前加盖盖玻片。将载玻片放置在智能手机显微镜的载物台上，调整焦距和清晰度。拍摄图像以测量荧光信号。使用 ImageJ 测量每张图像的平均灰度值以及同一浓度组中平均灰度值的标准差。采用深度学习模型 AlexNet 33 进行分类。现在使用 Python 将输入图像重塑为 224 × 224 × 三个通道。最后，使用在 ImageNet 数据集上预训练的骨干网络提取图像特征。第六对引物提供了最高的扩增效率，因此被选用。CRISPR RNA-3 在旁切反应中表现出最高的效率。使用选定的 RPA 引物和 CRISPR RNA 构建的检测系统，可在 10 aM FV3 与对照之间产生显著差异。需要牢记的最重要一点是特定的 CAS 12a 检测步骤。可根据 CAS 12a 检测对反应中的 CRISPR RNA 进行修饰或重新设计，以靶向其他 DNA 病毒。所提出的方法可有助于对目标病毒的数量进行初步评估。基于此，可采用其他方法（如 qPCR）来获得更准确的病毒载量。该技术为 DNA 病毒的便携式检测提供了初步尝试。对于本方案中使用的蛙病毒 3 号（frog virus 3），及时检测可促使采取有效的防护措施，从而减少养殖业的损失。

dna-virus-detection-system-based-on-rpa-crisprcas12a-spm-deep

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

基于RPA-CRISPR/Cas12a-SPM和深度学习的DNA病毒检测系统

本文介绍了一种鉴定具有双链DNA基因组植物病毒的新方法。我们采用标准方法从感染的叶片中提取DNA和RNA，并进行高通量测序。生物信息学工具将测序结果组装成重叠群，识别代表病毒基因组的重叠群，并将这些基因组归类到相应的分类群中。...

结合粗提病毒颗粒中的DNA分析与感病叶片中的RNA分析以发现新病毒基因组

RNA病毒复制过程中产生的双链RNA可被模式识别受体识别，从而诱导先天免疫反应。对于负链RNA病毒而言，低水平的双链RNA与模式识别受体之间的相互作用仍不明确。我们开发了一种共聚焦显微镜方法，用于在单个细胞中可视化沙粒病毒的双链RNA和模式识别受体。...

负链RNA病毒感染中双链RNA与模式识别受体的共聚焦成像

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

本方案提供了从DNA提取到数字液滴PCR（ddPCR）实验建立的完整步骤，包括在gRNA引导的Cas9切割及DNA修复后，对靶位点处非同源末端连接（NHEJ）事件进行鉴定与定量的分析方法。该方法的其他应用还包括多态性检测和基因编辑变异体验证等。...

利用数字液滴PCR检测基因改造按蚊群体中的插入缺失突变

本研究建立了一种基于重组酶聚合酶扩增联合CRISPR-Cas12a的快速、灵敏且便携的Candidatus Liberibacter...

可现场部署的结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR-Cas12a技术的Candidatus Liberibacter asiaticus检测方法

基于CRISPR-Cas系统与抗CRISPR蛋白的基因数字电路

基于脱氧核酶的纳米机器可用于核酸的高选择性和高灵敏度检测。本文以EB病毒片段的检测为例，详细描述了利用免费软件设计含有10-23核心的脱氧核酶纳米机器的实验方案及其应用。...

基于DNAzyme 10-23的核酸识别纳米机器

本文介绍了基于重组酶的等温扩增反应和基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）反应的预混、冻干试剂的逐步制备方法，可用于检测传染病病原体的核酸生物标志物或其他感兴趣的遗传标志物。...

基于CRISPR的现场快速诊断技术及其预混冻干试剂

为了实现对Acinetobacter baumannii的快速且精准检测，我们提出了一种结合重组酶聚合酶扩增技术（RPA）与LbaCas12a内切酶的检测方案，用于鉴定A.

基于重组酶聚合酶扩增/Cas12a系统的Acinetobacter baumannii感染快速特异性检测

本方案介绍了一种结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a检测技术的方法，用于检测侵入性植物病原菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense...

联合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a检测法用于检测 Fusarium oxysporum 专化型 cubense 热带4号小种

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现场检测锥虫科寄生虫和Nosema ceranae的DNA：基于碱裂解联合RPA/CRISPR/Cas12a系统的方法

学习基于RPA-CRISPR/Cas12a结合智能手机显微镜和深度学习AlexNet模型的DNA病毒快速检测方法，用于蛙病毒3的现场即时诊断。该技术整合等温扩增与基因编辑系统，提高检测效率与准确性，适用于水产养殖业的病毒监测与公共卫生防护。

基于RPA-CRISPR/Cas12a-SPM与深度学习的DNA病毒检测系统

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