一种可替代且经过验证的进入视网膜下腔的注射方法 通过 经巩膜后部入路

本研究的总体目标是描述一种新型的视网膜下注射技术，可用于将病毒载体、药理学试剂或诱导性多能干细胞靶向递送至小鼠的视网膜下腔。该方法可解答视觉科学和眼科学领域中的关键问题，例如评估针对视网膜变性疾病的新型治疗干预措施的有效性。该技术的主要优势在于，能够以高效率将物质递送至视网膜下腔，同时造成最小损伤，并实现视网膜结构与功能的快速恢复。

演示该操作的是我实验室的技术员Sachin P。开始操作前，修剪麻醉小鼠的胡须以方便观察，并使用循环水垫将动物体温维持在37摄氏度。接着，用2.5%去氧肾上腺素滴眼液散瞳。

然后，使用甲基纤维素滴眼液以防止干燥，并尽量减少麻醉引起的暂时性白内障。手术前对器械进行灭菌。随后，在生物安全柜中配制稀释的荧光素。

用注射器吸取适量荧光素。接着，进行足趾夹捏以确认动物已处于深度麻醉状态，并将小鼠摆位，使待注射的眼睛朝上且在解剖显微镜下清晰可见。用一对尖头镊子轻轻夹住颞侧结膜。

然后，使用弯头Vannas剪刀做一个约90度的环形切口。对下方的Tenon囊重复相同操作。随后，用尖头镊子切除周围结缔组织，同时将眼球向鼻侧旋转。

操作时应朝向注射位点进行，位置大约距离视神经0.5毫米，并需格外注意避免损伤眶后静脉窦。暴露注射位点是关键步骤，需要旋转眼球，但不得损伤眼球本身或其相关结构，尤其要避免损伤眶内血囊。在该操作中，使用22.5度眼科刀片轻轻刮擦眼杯的巩膜部位，在注射位点处做一个小切口。

此切口应仅需足够大，以使针尖穿过巩膜即可。接着，将33号斜面针头经巩膜切口插入，斜面朝向并与视网膜平行。通过缓慢而均匀地按压推动器，注入所需量的0.01%荧光素。

需要注意的是，当针头位于视网膜下腔时，推动针栓会感到轻微阻力。若针头刺穿视网膜，则无阻力感；若针头未穿透巩膜或视网膜色素上皮（RPE），则会感到较大阻力。另一个关键步骤是准确将注射靶向视网膜下腔。

此操作必须在不穿透神经感觉层视网膜、不进入玻璃体腔的前提下完成。拔针前需等待数秒，以尽量减少反流。随后，用无菌生理盐水冲洗眼部，并确认眼球已恢复至正常位置。

然后，在注射眼的角膜表面涂抹一层厚厚的三重抗生素眼膏。之后，将小鼠置于洁净的单独笼子中恢复。在麻醉苏醒期间监测其呼吸和体温，并确认小鼠能够维持胸卧位。

进行额外的适当术后监测和治疗，包括皮下注射卡洛芬，以进行术后疼痛管理。这是注射部位穹顶状隆起的三维重建图像。将穹顶状隆起区域填充为致密白色，以显示视网膜脱离的范围和边界。

在OCT图像中，视网膜的横截面呈白色，而视网膜色素上皮层（RPE）和光感受器层水平的液体填充区域则呈黑色。本图展示了注射前、注射后10分钟及注射后四周，在视网膜脱离最显著部位的代表性OCTB扫描图像。该图像显示了由0.3 µL注射所形成的平坦水泡（bleb）的形成与消退过程。

此图像显示了由0.5微升注射引起的穹顶状泡状隆起的形成与消退过程，而此图像则显示了由1微升注射引起的穹顶状泡状隆起的形成与消退过程。最后，这是脉络膜瘢痕形成和视网膜在注射部位变薄的严重情况示例。泡状隆起消退后，视网膜仍保持正常功能。

在九种光照强度下，显示了注射前和注射后四周的暗视杆状细胞介导反应的波形，注射体积分别为 0.3 微升、0.5 微升和 1 微升。掌握该技术后，每只眼睛的操作可在 10 至 15 分钟内完成。在进行该操作时，开始前评估眼睛的健康状况至关重要。

排除存在角膜或晶状体混浊，或因眼窝过深而使该操作极为困难的眼睛。完成此操作后，可进行其他方法，如光学相干断层扫描（OCT）和眼底成像，以评估注射质量。