用于访问视网膜下腔的另类和验证注射法通过一经巩膜后路
2016年12月7日
视网膜下注射是将蛋白质和病毒载体等大型治疗剂递送到光感受器和视网膜色素上皮的最常用技术。这里描述了一种在小鼠中成功靶向视网膜下间隙的替代方法，具有最小的附带损伤和快速的恢复时间。
本研究的总体目标是描述一种新型视网膜下注射技术，该技术可用于靶向病毒载体、药物或诱导多能干细胞进入小鼠的视网膜下间隙。这种方法可以回答视觉科学和眼科领域的关键问题，例如评估新型治疗干预对视网膜变性的疗效。该技术的主要优点是可用于将材料输送到视网膜下空间，效率高、损伤小，视网膜结构和功能恢复快。
演示该程序的是我实验室的技术人员 Sachin P。要开始此过程，请修剪麻醉小鼠的胡须以促进可视化，并用循环水垫将动物的体温保持在 37 摄氏度。接下来，用 2.5% 去氧肾上腺素滴眼液扩张其瞳孔。
然后，使用甲基纤维素滴眼液以防止干燥，并尽量减少麻醉引起的短暂性白内障。手术前对器械进行消毒。然后，在生物安全柜中制备稀释的荧光素。
用适量的荧光素填充注射器。接下来，进行脚趾捏捏以确保动物被深度麻醉，并放置鼠标，使要注射的眼睛朝上，在解剖显微镜下清晰可见。用一对细尖镊子轻轻捏住颞结膜。
然后，使用弯曲的 Vannas 剪刀做一个大约 90 度的圆周切口。在下面的 Tenon 胶囊上重复该过程。之后，用细尖镊子切开周围的结缔问题，同时向鼻部旋转眼球。
在距离视神经约 0.5 毫米的地方向注射部位工作，并非常小心地避免破坏眶后窦。一个关键步骤是暴露注射部位，这需要眼睛旋转，而不会损坏眼睛本身或相关结构，特别是避免损坏眼眶血囊。在此过程中，用 22.5 度的眼科刀片轻轻刮擦眼罩，在注射部位的牙膜上做一个小切口。
这个切口应该足够大，以便针尖穿过粘膜。接下来，将斜面 33 号针头插入硬化切开术，斜面朝向并与视网膜平行。通过均匀的压力缓慢按压柱塞，注入所需量的 0.01% 荧光素。
请注意，当针头位于视网膜下间隙时，按下柱塞时会感到轻微的阻力。如果针头刺穿视网膜，则不会有阻力，但如果针头没有穿透巩膜或 RPE，则阻力很高。另一个关键步骤是针对视网膜下间隙的注射。
这必须在不穿透神经感觉视网膜到玻璃体腔的情况下完成。等待几秒钟后再取出针头，以尽量减少回流。随后，用无菌盐水冲洗眼睛，并确保眼睛已旋转回正常位置。
然后，在注射眼睛的角膜表面涂上一层厚厚的三联抗生素眼霜。之后，将鼠标放在干净的单独笼子中进行恢复。在麻醉恢复期间监测其呼吸和温度，并检查其是否能维持胸骨斜躺。
进行额外的适当术后监测和治疗，包括皮下注射卡洛芬，以进行术后疼痛管理。这是注射部位圆顶形气泡的 3D 重建。然后用密集的白色填充圆顶状水泡，以显示视网膜脱离的范围和边缘。
OCT 的视网膜横截面可以用白色看到，而 RPE 和光感受器水平的充满液体的空间是黑色的。在此图中，显示了注射前、注射后 10 分钟和注射后 4 周在最大视网膜脱离部位的代表性 OCTB 扫描。该图显示了 0.3 μL 注射液中扁平水泡的形成和分辨率。
这张图片显示了 0.5 μL 注射液中圆顶水泡的形成和分辨率，而这张图片显示了 1 μL 注射液中圆顶泡泡的形成和分辨率。最后，这是注射部位严重脉络膜疤痕和视网膜变薄的例子。Bleb 分辨后视网膜仍可保持正常功能。
在 9 种照明强度下，显示了 0.3 μL、0.5 μL 和 1 μL 注射的注射前和注射后 4 周的暗视杆介导反应的波形。一旦掌握，这项技术可以在每只眼睛 10 到 15 分钟内完成。在尝试此程序时，在开始之前评估眼睛的健康状况很重要。
排除角膜或晶状体混浊的眼睛，或深陷的眼睛，这些手术将非常困难。在此程序之后，可以执行其他方法，例如 OCT 和眼底成像，以评估注射质量。
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概述
本研究描述了一种新的视网膜下注射技术，用于向小鼠视网膜下空间输送治疗剂。该方法旨在最大限度地减少附带损害，同时确保视网膜结构和功能的快速恢复。
关键研究组成部分
科学领域
- 视觉科学
- 眼科学
背景
- 视网膜下注射常用于治疗输送。
- 现有方法可能造成附带损害和较长的恢复时间。
- 本研究提出了一种具有改进结果的替代技术。
研究目的
- 描述一种新的视网膜下注射技术。
- 评估治疗视网膜退行性疾病的干预措施的有效性。
- 促进病毒载体和药理剂的输送。
使用的方法
- 修剪麻醉小鼠的胡须以便于观察。
- 使用循环水垫将体温保持在37摄氏度。
- 使用2.5%苯肾上腺素眼药水扩张瞳孔。
- 由受过训练的技术人员演示该程序。
主要结果
- 该技术能够高效地输送材料。
- 观察到对视网膜结构的损害最小。
- 实现了视网膜功能的快速恢复。
结论
- 这种新的视网膜下注射技术适用于研究。
- 它有望推进眼科学的治疗策略。
- 进一步的研究可以探索其在视网膜退行性疾病中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This transcleral posterior subretinal injection method addresses a key challenge in preclinical ophthalmology: delivering therapeutic agents to the subretinal space while minimizing surgical trauma and preserving retinal integrity. By avoiding retinal penetration and vitreous disruption, the technique enables more accurate assessment of drug efficacy in rodent models of retinal degeneration. This supports de-risking of target validation and lead identification efforts in vision science pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise delivery of viral vectors, pharmacological agents, or stem cells to the subretinal space for functional target validation in retinal disease models.
- Operational Value: Minimizes confounding tissue damage, allowing clearer interpretation of therapeutic effects on photoreceptors and RPE.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces consistent, reproducible subretinal delivery with quantifiable outcomes via OCT and fundus imaging.
- Operational Value: Standardizes injection depth and location (0.5 mm from optic nerve), reducing variability across experiments and operators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports longitudinal assessment of retinal structure and function due to rapid retinal reattachment and minimal chronic scarring.
- Operational Value: Compatible with postoperative monitoring using OCT, fundus imaging, and ERG to evaluate therapeutic durability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling reliable delivery of candidate therapeutics to the subretinal space, a critical step before efficacy testing in degenerative retinal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing targeted delivery of agents to interrogate retinal pathways and cell-specific functions.
- Screening: Enables standardized preparation of disease models for compound screening with minimal procedural failure.
- Analytics: Generates clear OCT- and fundus-based readouts to quantify retinal detachment resolution and functional recovery over time.
- Translational Research: Supports continuity from discovery to preclinical validation by preserving retinal architecture for accurate biomarker and functional assessments.
- Enterprise Reuse: Reusable across studies involving viral vectors, proteins, or cell-based therapies for retinal degeneration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing surgical artifacts that could mask or mimic therapeutic effects.
- Operational Value: Short procedure time (10–15 minutes per eye) and low failure rate improve throughput in preclinical studies.
- Strategic Value: Reduces biological noise in efficacy data, supporting better go/no-go decisions in target prioritization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of retinal therapeutics by providing cleaner preclinical data on mechanism and durability.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise and fine motor control for sclerotomy and needle placement.
- Dependent on specialized instrumentation including Vannas scissors, 22.5° ophthalmic blade, and 33-gauge beveled needle.
- Necessitates standardized postoperative care including antibiotics, analgesics, and monitoring for retinal reattachment.
- Adaptation to other model systems may require adjustment of incision size and needle angle based on ocular anatomy.
- Limited to posterior segment access; not suitable for anterior segment or intravitreal delivery applications.
