Name: 用于访问视网膜下腔的另类和验证注射法通过一经巩膜后路 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学习一种新型小鼠视网膜下腔注射技术，用于递送病毒载体和药物制剂。该方法具有高效、损伤小、恢复快的特点，适用于视觉科学和眼科治疗研究。

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我们衷心感谢 Harold 和 Pauline Price 眼科学讲席以及 Jules Stein 眼科研究所对 MBG 的支持，NEI 核心资助（EY00331-43）对 SN 的支持。本研究部分得到了 Sakaria 家族向 SN 和 MGB 捐赠的慷慨资助，以及防盲研究组织向眼科学系提供的无限制资助。我们感谢加州大学伯克利分校视光学院的 Charlotte Yiyi Wang 协助获取了视网膜下注射的初始光学相干断层扫描图像。

动物：在加州大学洛杉矶分校（UCLA）繁育的野生型 C57Bl/6J 小鼠。所有动物年龄介于 11 至 17 周之间，包含雄性和雌性小鼠。所有小鼠均群养，维持在 12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下，并自由获取食物和水 随意摄取所有实验均遵循加州大学洛杉矶分校的机构指南以及视觉与眼科研究协会关于动物在眼科和视觉研究中使用的声明。
注：所有药物和注射用制剂均为美国药典（USP）级。
1. 手术准备
<ol>
	<li>使用生理盐水配制的氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（8 mg/kg）混合液，通过腹腔注射麻醉小鼠。麻醉深度应达到小鼠无足趾夹捏反射和角膜触碰反射。</li>
	<li>使用循环水垫将小鼠体温维持在 37.0 °C。</li>
	<li>使用 2.5% 去氧肾上腺素滴眼液散瞳，并修剪胡须以方便观察。胡须为小鼠提供重要的感觉输入，因此修剪胡须时仅应去除遮挡眼睛视野的部分，不应剪至胡须根部。根据我们的经验，小鼠在此操作后可正常恢复。&#160;使用甲基纤维素滴眼液以防止角膜干燥，并减少麻醉引起的暂时性白内障13。</li>
	<li>手术前对器械进行灭菌处理（例如，使用聚维酮碘和乙醇或高温珠灭菌器）。</li>
	<li>若需进行可视化操作（见下文第 3 节），应在无菌环境（例如，生物安全柜）中配制稀释荧光素（0.01%，使用 0.9% 生理盐水）。</li>
</ol>
2. 注射部位准备
<ol>
	<li>准备一支注射器（例如，5 µl 注射器）并设置适当的注射体积（例如，0.3 至 1.0 µl。</li>
	<li>将小鼠置于解剖显微镜下，使其眼睛朝上并清晰可见。</li>
	<li>用精细尖头镊子轻轻夹住颞侧结膜。使用弯头Vannas剪刀做约90度的环形切口。</li>
	<li>用下方的Tenon囊重复步骤2.3。</li>
	<li>用精细尖头镊子分离周围结缔组织，同时将眼球向鼻侧旋转。操作逐步向视神经外侧约0.5 mm的注射部位推进。需格外小心，避免损伤眶后静脉窦。</li>
</ol>
3. 巩膜切口与视网膜下注射
注意：建议在学习本操作时使用0.9%生理盐水中含0.01%荧光素钠的溶液进行注射，以辅助观察。荧光素的地形分布可通过眼底成像有效记录（见下文第4节）。
<ol>
	<li>使用22.5度的眼科刀在注射部位轻轻刮擦眼杯，制作一个小的巩膜切口。该切口仅需足够针尖穿过巩膜即可。</li>
	<li>将斜面朝向视网膜且与视网膜平行的33 G斜面针插入巩膜切口（角度为5–10°），注入所需体积的液体（例如，用于学习目的时可注入0.3至1.0 µl的0.01%荧光素钠溶液）。 
	注意：每次注射前，应使用适当的溶剂和去离子水依次彻底清洗注射器，以保持其无菌状态。</li>
	<li>缓慢按压推杆（约3秒内完成），期间保持针头不动，并施加均匀压力。 
	注意：当针头位于视网膜下腔时，按压推杆会感受到轻微阻力；若针头刺穿视网膜，则无或仅有极小阻力；若针头未穿透巩膜或视网膜色素上皮（RPE），则会感受到较大阻力。</li>
	<li>拔出针头前等待数秒，以尽量减少反流。</li>
	<li>用无菌缓冲生理盐水冲洗眼睛，并确认眼球已恢复至正常位置。</li>
</ol>
4. 通过光学相干断层扫描和眼底成像评估视网膜脱离
<ol>
	<li>注射后立即进行OCT成像，以评估注射质量，并根据需要在注射后的适当时间点进行成像，以评估视网膜结构。 
	注意：OCT在类似研究中的应用示例此前已有描述7,14。
	<ol>
		<li>调整并校准OCT图像，以准确定位注射部位。注射部位应位于视盘颞侧0.5 mm处的中线上。若脱离区域超出视野或未理想居中，可根据需要重复调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过en-face眼底成像观察视网膜脱离区域及染料注射范围7,14。 
	注意：若无OCT成像系统，可使用携带示踪剂的少量荧光素进行练习性注射，随后利用任何具备荧光素血管造影功能的眼底相机（使用相同的激发波长和阻断滤光片）进行观察。若准确靶向视网膜下腔，可在血管结构下方出现局部高荧光区域，且血管边界清晰分明。注射形成的隆起（bleb）边缘将表现为由高荧光向低荧光的过渡带。目前已有多种仪器可实现小鼠的此类成像；本研究所用设备的详细信息见其他文献14。</li>
</ol>
5. 术后护理
<ol>
	<li>在注射眼的角膜表面涂抹一层厚厚的三重抗生素眼膏。</li>
	<li>将小鼠放入清洁的单独笼子中恢复。在小鼠完全恢复之前，不得将接受过手术的小鼠合笼饲养。</li>
	<li>在麻醉恢复期间监测呼吸和体温。持续观察动物，直至其能够维持胸卧位。</li>
	<li>进行其他适当的术后监测和治疗，包括皮下注射卡洛芬（5 mg/kg），用于术后疼痛管理。</li>
</ol>
6. 通过视网膜电图（ERG）评估视网膜功能
<ol>
	<li>根据需要，在注射前及注射后适当时间点进行ERG分析，以评估视网膜功能。若注射至视网膜下腔，视网膜脱离应在72小时内消退。
	<ol>
		<li>采用标准ERG技术在注射前后评估视网膜功能，具体方法如前所述14,15。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 三维重建与膜泡体积定量
注意：应优先选用能够完整涵盖视野范围内整个脱离区域且具有高对比度的OCT扫描图像。本研究使用了ImageJ/Fiji17,18 和 Imaris，但也可使用其他软件。
<ol>
	<li>导出感兴趣的B扫描图像，导入ImageJ/Fiji并进行裁剪（图像 &#62; 使用矩形选择工具裁剪（Crop）需要建模的OCT扫描图像区域。
	<ol>
		<li>调整对比度（图像 &#62; 调节 &#62; 亮度/对比度）并通过线条连接两部分来勾画任何缺失的边界。</li>
		<li>使用线条工具（按住 shift 键）绘制一条从视网膜色素上皮层（RPE）延伸至光感受器层的直线。测量（Analyze） &#62; 测量该线段的长度，以获得第7.8步中最大脱离尺寸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用材料表中列出的3D重建软件导入裁剪后的帧 &#34;RGB 转灰度&#34; 插件和 MATLAB 编译器运行时</li>
	<li>在“图像属性”下，使用OCT扫描的校准参数（x, y, z）设置体素大小。</li>
	<li>执行 &#34;RGB 转灰度&#34; 在“图像属性”中使用插件，对每个通道赋予相等权重，生成第四个通道。删除原始的红-绿-蓝通道。</li>
	<li>反转灰度通道的对比度。保存图像。</li>
	<li>点击 &#34;添加新表面&#34; 在3D视图选项卡中点击按钮，然后开始引导式四步操作以创建表面。
	<ol>
		<li>设置表面层级细节（第1步，共4步）。 
		注：根据我们的经验，8.0 至 12.0 是最有效的范围。</li>
		<li>将最大球体尺寸（在背景选择下）设置为略小于在7.1.2中测得的最大脱离尺寸。创建表面并取消灰度通道反转（四步中的第二步）。</li>
		<li>将阈值设为最大值，以确保视网膜外部的负空间表面与脱离区域不发生接触（4步中的第3步）。</li>
		<li>将滤波器类型设置为体素数量，并按尺寸分离脱离部位的负空间。完成表面处理（共4步中的第4步）。 
		注意：分离表面的体积位于统计选项卡中“体积”下方。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
</ol>

所有作者均无商业利益披露。

视网膜下注射是基础研究和临床治疗中用于递送病毒载体及干细胞来源疗法以操控光感受器和视网膜色素上皮（RPE）的首选方法。在患者中，视网膜下注射通常通过睫状体平坦部的前部巩膜切口、后部核心玻璃体切除，并在直视下用针头穿透视网膜完成。与大多数玻璃体切除手术一样，除非眼球已为人工晶状体眼，否则常会过早发生白内障。在小鼠中，传统的视网膜下注射采用位于视网膜前方的巩膜切口，该方法常导致晶状体被划伤（晶状体占据眼球后腔的大部分空间），以及可能引起玻璃体嵌顿和完全性视网膜脱离的经视网膜穿刺。在小鼠中采用后部入路技术可减少这些不良后果，并提高对预期干预效应进行准确解读的能力。
本文所述视网膜下注射技术的优点包括对结构和功能的影响最小，并减少附带损伤（例如， 因晶状体损伤、玻璃体渗漏或炎症导致的混浊，从而更便于评估实验结果并缩短恢复时间。该技术需要对眼球进行较多操作以到达后极部，但每只眼的操作可在约10至15分钟内完成，成功率较高，且无任何眼球被排除在分析之外。在大多数注射案例中，4周内即可观察到视网膜结构和功能恢复正常。相比之下，既往研究报道的结构与功能恢复时间为5至8周，或未报告...

视网膜下注射是将细胞和病毒制剂递送至小鼠视网膜的主要方法，用于研究其对光感受器及下方视网膜色素上皮（RPE）的影响1,2。目前大多数小鼠视网膜下注射方案采用角膜或巩膜途径，注射位点位于赤道前部（图1）。该方法可能造成一系列固有的继发性损伤，包括角膜切口导致晶状体划伤和混浊、玻璃体完整性破坏、神经视网膜和虹膜穿通、视网膜出血、显著的视网膜脱离以及持续性视网膜下水肿3-9。实验操作必须克服这些影响，才能准确评估治疗干预的效果3,7,10,11。本研究详细描述并验证了一种后部经巩膜注射技术，该方法可避免上述并发症，最大限度减少创伤，并具有较高的成功靶向视网膜下腔的率。
在小鼠中进行靶向视网膜下腔的注射通常非常困难，大多数研究人员在操作过程中会频繁失败，例如将载体注射到错误的位置，或造成明显的视网膜损伤，甚至完全的视网膜脱离6。由于注射并发症而被排除在分析之外的眼球数量在小鼠研究中通常未被报道，但根据我们自身的经验以及与其他研究人员的交流，注射失败的比例可能高达50%，且具体比例取决于操作人员的经验和技术水平。注射是否成功通常通过直接眼底成像和/或光学相干断层扫描（OCT）7,9进行评估。一种易于掌握且成功率高的小鼠视网膜下注射方法，可加快实验进程，并降低针对美国主要致盲性视网膜疾病治疗方案的临床前研究成本。
本文所述的经巩膜后部视网膜下注射技术源自临床及临床前研究方案9,12。对注射后小鼠进行的无创诊断评估显示，损伤轻微且高度局限，未出现其他并发的晶状体、视网膜或视网膜色素上皮（RPE）损伤。此外，实验人员经过相对较少的练习即可获得较高的成功率（80–90% 或更高），从而降低此类研究的相关成本。该方法可用于在临床前研究中向光感受器和/或视网膜色素上皮（RPE）递送细胞、病毒或药理学治疗干预，并便于评估实验性干预措施。

<table><tbody><tr><td>Hamilton 型号 62 RN 注射器</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>注射器 × 1</td></tr><tr><td>Hamilton 针头 33 G，1.0&quot;，20 度，尖端 3（304 不锈钢）</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>针头 × 6</td></tr><tr><td>Vannas 弯头剪刀</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>1347</td><td>5 mm 刀片</td></tr><tr><td>22.5 度显微外科刀</td><td>Wilson Ophthalmic Corp.</td><td>91204</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;nbsp;</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-609-02</td><td>氯胺酮</td></tr><tr><td>Anased</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NDC 61311-482-10</td><td>赛拉嗪</td></tr><tr><td>荧光素钠 10% AK-Fluor</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>0.9% 生理盐水 USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-50</td><td>0.9% NaCl</td></tr><tr><td>抗生素眼膏</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>眼科用</td></tr><tr><td>水循环泵</td><td>Gaymar</td><td>TP-500 T/Pump&amp;nbsp;</td><td>货号 07999-000</td></tr><tr><td>sd-OCT</td><td>Bioptigen</td><td>R系列</td><td>商用</td></tr><tr><td>眼底相机</td><td>Phoenix Research Laboratories</td><td>MICRON III</td><td></td></tr><tr><td>3 型镊子</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>5385-3SU</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 去氧肾上腺素</td><td>Paragon BioTeck</td><td>NDC 42702-102-15</td><td>眼科用</td></tr><tr><td>IMARIS8</td><td>Bitplane</td><td></td><td>版本 8.1.2</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>V1.8.0_77</td></tr><tr><td>羟丙甲纤维素&amp;nbsp;2.5%</td><td>Goniovisc</td><td>AX0401</td><td>甲基纤维素</td></tr><tr><td>滴眼液（冲洗用）</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td></td><td>生理盐水溶液</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>光源</td><td>Fostec</td><td>货号 20520</td><td>光源</td></tr></tbody></table>

一种可替代且经过验证的进入视网膜下腔的注射方法 通过 经巩膜后部入路

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

视网膜下注射已成功应用于人类和啮齿类动物，用于将蛋白质、病毒载体及细胞等治疗性干预物质递送至与光感受器和视网膜色素上皮（RPE）直接接触的视网膜感光细胞间隙/视网膜下腔室。近期的临床前及临床试验中，对浆原酶原以及病毒载体和干细胞的视网膜下注射已证明了向晚期视网膜疾病患者递送治疗剂的安全性和/或有效性。视网膜疾病的小鼠模型，尤其是遗传性视网膜营养不良模型，对于这些疗法的测试至关重要。在啮齿类动物中最常见的注射方法是采用小的角膜或巩膜切口，从前段途径接近视网膜。该方法中，注射针需穿透神经感觉性视网膜，从而破坏下方的RPE，并且在插入过程中容易划伤晶状体，导致晶状体混浊并影响无创成像。通过巩膜后部途径进入视网膜下腔可避免上述问题：针头在距视神经约0.5 mm处穿过巩膜，无需穿透视网膜，且不干扰玻璃体。由此产生的附带损伤仅限于局灶性巩膜切开术相关损伤以及短暂性浆液性视网膜脱离的影响。该方法操作简便，可最大限度减少眼部损伤，确保视网膜快速复位和恢复，失败率低。对视网膜和RPE造成的微小损伤使得能够清晰评估治疗剂本身的疗效及其直接作用。本文描述了一种新型的视网膜下注射技术，可用于高效、低损伤、快速恢复地将病毒载体、药理学制剂、干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞）靶向递送至小鼠的视网膜下腔。

对16只野生型小鼠的31只健康眼采用后入路经巩膜下视网膜注射，分别注射0.01%荧光素溶液0.3 µl（n = 18）、0.5 µl（n = 8）和1.0 µl（n = 5）。其中一只眼因预先存在的角膜混浊而无法进行结构和功能分析，故未实施注射。本报告包含所有注射后的眼部数据。未观察到任何意外的视网膜脱离、神经感觉层视网膜穿孔或液体渗漏至玻璃体的情况，也未发现晶状体损伤、炎症反应、葡萄膜炎或术后感染的迹象。
通过光学相干断层扫描（OCT）成像在注射前、注射后10分钟及注射后4周评估视网膜结构（图2和图3）。在注射后10分钟的en face扫描图像上放置一个9点网格，其中中心点对准最大脱离区域的中心（图2B）。利用血管解剖标志，将注射前和注射后4周的扫描图像旋转至与注射后10分钟的扫描图像对齐，从而实现精确匹配。这使得能够在注射前和注射后的视网膜扫描图像中识别完全相同的...

视网膜下注射是将大分子治疗剂（如蛋白质和病毒载体）递送至光感受器和视网膜色素上皮层的最常用技术。本文介绍了一种在小鼠中可有效靶向视网膜下腔、造成最小附带损伤且恢复时间较快的替代方法。

视网膜下注射已成功应用于人类和啮齿类动物，用于递送蛋白质、病毒载体和细胞等治疗性干预物质至……

本研究的总体目标是描述一种新型的视网膜下注射技术，可用于将病毒载体、药理学试剂或诱导性多能干细胞靶向递送至小鼠的视网膜下腔。该方法可解答视觉科学和眼科学领域中的关键问题，例如评估针对视网膜变性疾病的新型治疗干预措施的有效性。该技术的主要优势在于，能够以高效率将物质递送至视网膜下腔，同时造成最小损伤，并实现视网膜结构与功能的快速恢复。演示该操作的是我实验室的技术员Sachin P。开始操作前，修剪麻醉小鼠的胡须以方便观察，并使用循环水垫将动物体温维持在37摄氏度。接着，用2.5%去氧肾上腺素滴眼液散瞳。然后，使用甲基纤维素滴眼液以防止干燥，并尽量减少麻醉引起的暂时性白内障。手术前对器械进行灭菌。随后，在生物安全柜中配制稀释的荧光素。用注射器吸取适量荧光素。接着，进行足趾夹捏以确认动物已处于深度麻醉状态，并将小鼠摆位，使待注射的眼睛朝上且在解剖显微镜下清晰可见。用一对尖头镊子轻轻夹住颞侧结膜。然后，使用弯头Vannas剪刀做一个约90度的环形切口。对下方的Tenon囊重复相同操作。随后，用尖头镊子切除周围结缔组织，同时将眼球向鼻侧旋转。操作时应朝向注射位点进行，位置大约距离视神经0.5毫米，并需格外注意避免损伤眶后静脉窦。暴露注射位点是关键步骤，需要旋转眼球，但不得损伤眼球本身或其相关结构，尤其要避免损伤眶内血囊。在该操作中，使用22.5度眼科刀片轻轻刮擦眼杯的巩膜部位，在注射位点处做一个小切口。此切口应仅需足够大，以使针尖穿过巩膜即可。接着，将33号斜面针头经巩膜切口插入，斜面朝向并与视网膜平行。通过缓慢而均匀地按压推动器，注入所需量的0.01%荧光素。需要注意的是，当针头位于视网膜下腔时，推动针栓会感到轻微阻力。若针头刺穿视网膜，则无阻力感；若针头未穿透巩膜或视网膜色素上皮（RPE），则会感到较大阻力。另一个关键步骤是准确将注射靶向视网膜下腔。此操作必须在不穿透神经感觉层视网膜、不进入玻璃体腔的前提下完成。拔针前需等待数秒，以尽量减少反流。随后，用无菌生理盐水冲洗眼部，并确认眼球已恢复至正常位置。然后，在注射眼的角膜表面涂抹一层厚厚的三重抗生素眼膏。之后，将小鼠置于洁净的单独笼子中恢复。在麻醉苏醒期间监测其呼吸和体温，并确认小鼠能够维持胸卧位。进行额外的适当术后监测和治疗，包括皮下注射卡洛芬，以进行术后疼痛管理。这是注射部位穹顶状隆起的三维重建图像。将穹顶状隆起区域填充为致密白色，以显示视网膜脱离的范围和边界。在OCT图像中，视网膜的横截面呈白色，而视网膜色素上皮层（RPE）和光感受器层水平的液体填充区域则呈黑色。本图展示了注射前、注射后10分钟及注射后四周，在视网膜脱离最显著部位的代表性OCTB扫描图像。该图像显示了由0.3 µL注射所形成的平坦水泡（bleb）的形成与消退过程。此图像显示了由0.5微升注射引起的穹顶状泡状隆起的形成与消退过程，而此图像则显示了由1微升注射引起的穹顶状泡状隆起的形成与消退过程。最后，这是脉络膜瘢痕形成和视网膜在注射部位变薄的严重情况示例。泡状隆起消退后，视网膜仍保持正常功能。在九种光照强度下，显示了注射前和注射后四周的暗视杆状细胞介导反应的波形，注射体积分别为 0.3 微升、0.5 微升和 1 微升。掌握该技术后，每只眼睛的操作可在 10 至 15 分钟内完成。在进行该操作时，开始前评估眼睛的健康状况至关重要。排除存在角膜或晶状体混浊，或因眼窝过深而使该操作极为困难的眼睛。完成此操作后，可进行其他方法，如光学相干断层扫描（OCT）和眼底成像，以评估注射质量。

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一种可替代且经过验证的进入视网膜下腔的注射方法通过经巩膜后部入路

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