Name: 高密度的脑电图采集在啮齿动物模型使用低成本的开源资源 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: 学习在小鼠模型中使用低成本开源资源构建和植入慢性高密度脑电图电极阵列的方法。该技术可用于神经科学、麻醉学、癫痫和睡眠神经生物学研究，具有可重复性和实验定制化的优势。

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本研究工作得到了麻醉教育与研究基金会指导研究培训基金（ARM）、美国国立卫生研究院基金 GM107117（MBK）和 GM088156（MBK）以及宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院麻醉学与重症监护科的资助。

本研究中进行的所有实验均符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的要求，并已获得宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 头部组件的设计与构建
<ol>
	<li>使用镊子从100位插座连接器的2 × 50针砖中移除每第八排的针脚，方法是将针脚的插座部分推过塑料砖。 
	注意：针脚朝下的一面将是本方案后续步骤中所参考的方向。（请特别注意步骤2.6中的说明）。</li>
	<li>在针脚上涂一层极薄的指甲油以进行绝缘，并让指甲油完全干燥。</li>
	<li>用丙酮和一小块布擦除针尖处的指甲油。</li>
	<li>使用剃刀刀片或剪线钳修剪2 × 7针砖多余的塑料部分。最终得到的2 × 7针砖沿针脚长度方向被绝缘，仅针尖暴露。这些将作为经颅脑电图（EEG）电极。一套完整的慢性电极阵列需要两个2 × 7针砖（图1A）。</li>
	<li>切割两个1 × 2针砖用于肌电图（EMG）信号记录。使用与上述相同的方法，用镊子移除不需要的针脚，并剪去多余塑料以制成1 × 2针砖。确保这些1 × 2针砖保留来自原始100位插座的平整侧面，因为该距离将成为每个头件的标准针距，从而使单个适配器适用于所有头件（图1A）。</li>
	<li>使用双组分环氧树脂将1 × 2针件粘接到2 × 7针件上（图1D）。
	<ol>
		<li>由于两组针脚必须保持相同方向，应将1 × 2针件粘接在头件两半的外侧，使1 × 2和2 × 7针件的平整面相互接触。将1 × 2的针孔和针脚与2 × 7针件最后方的两排针脚对齐。 
		注意：头件的两个半部分之间不进行环氧粘接。这使得头件适配器的两半之间具有一定的灵活性，便于在适应期和实验日进行连接（图1E）。</li>
		<li>让头件两半过夜固化。完成后，头件呈双侧对称结构。每一半均由一个2 × 7针砖组成，其外侧附有一个1 × 2针砖，且该1 × 2针砖与2 × 7针砖最后方的两排针脚对齐。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于肌电图（EMG）信号记录的导线。使用单股、31号线规、全氟烷氧基绝缘的银线进行EMG信号记录（图1D）。但如有需要，也可使用多股导线或其他金属导线替代。
	<ol>
		<li>制作胸部EMG导线时，取一段3.0 cm长的全氟烷氧基绝缘银线，用剃刀刀片从一端去除1 cm的塑料绝缘层。将裸露的导线在一对镊子上缠绕两圈。取下导线后，用剃刀刀片从非环状端去除25 mm的绝缘层。</li>
		<li>制作颈部EMG导线时，重复上述过程，使用一段1.5 cm长的导线。一套完整的头件需要两根颈部EMG导线和两根胸部EMG导线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除两个头件最前排外侧的针脚，该位置对应于前囟前3.3 mm、前囟外侧2.3 mm的立体定位坐标，根据小鼠脑图谱显示，该位置下方无脑组织20（图2A）。</li>
	<li>在两个头件的每一半上，使用剪线钳将1 × 2针砖的针脚剪至与头件塑料基座齐平（距针尖3.0 mm），并将颈部EMG导线焊接到前方的针脚上，胸部EMG导线焊接到后方的针脚上。
	<ol>
		<li>检查每个针脚是否电学隔离。使用数字万用表进行连续性测试：将电压表的两个探针分别连接到不同的针脚上，并置于连续性检测模式。电学隔离的针脚在测试中不会发出蜂鸣声，而电学连通的针脚则会发出声音。在焊点上涂覆指甲油，待其干燥后，将EMG导线弯折，使其平行于前后轴方向，并尽量减少横向偏移。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将针脚修剪至相对长度，使其与脑表面轮廓相匹配。
	<ol>
		<li>借助小鼠脑图谱，记录每个针脚坐标从前囟到脑表面的腹侧距离20。从前囟起腹侧距离最大的针脚将作为修剪其他针脚的参考基准。该针脚本身不进行修剪，其余所有针脚均以此最大腹侧距离针脚为基准进行裁剪（表1）。 
		注意：可通过研磨方式将针脚磨至所需长度，但操作需谨慎，因为针脚与砂轮之间的摩擦可能导致头件针脚弯曲。若发生弯曲，可用镊子将其校直。另一种替代方法是使用剪线钳直接修剪针脚。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用银溶液笔将所有针尖涂覆银溶液，并使其干燥。此步骤可将电极阻抗降低至≤30 kΩ，提高信噪比，同时消除针脚修剪造成的毛刺，从而减少组织损伤风险并加快术后恢复。完成后的半个头件重量约为0.5 g。</li>
</ol>
2. 接头构建与通道映射
<ol>
	<li>使用剃刀将36针双排公头纳米微型连接器的连接导线裁剪至统一长度，约为2或3厘米。对每根导线，剥除末端2.5 mm的绝缘层，并对裸露的金属部分进行镀锡处理。镀锡时需确保每根纳米适配器导线仅保留一根细小的镀锡金属丝，这对于隔离各个引脚至关重要。使用剪线钳剪掉已剥离的绝缘部分（图1C）。</li>
	<li>使用Conn Strip Header 2 x 50制作与头件匹配的公-公连接器。从一块2 x 50的连接器上切割出两个2 x 7和两个2 x 1的段。通过折断其中一个公针，然后用镊子将同一部件未断裂的另一半从连接器上推出，以去除2 x 50连接器上不需要的引脚（图1B）。 
	注意：这些引脚的一侧将作为适配引脚插入每个头件，而另一半则需焊接到已镀锡的纳米连接器导线上。确保2 x 1和2 x 7的扁平塑料边缘相互接触，以保证公-公连接器与第1步中制作的头件正确对接。</li>
	<li>将纳米连接器的一根接地/参考导线焊接到所需的接地/参考引脚上。在RHD2132放大器芯片上，接地和参考导线是连接在一起的。使用位于前囟前方0.60 mm、前囟外侧1.00 mm处的单个引脚作为参考和接地（左侧头件，从前向后数第三排最内侧的引脚；但也可根据需要指定其他引脚，图2）。请注意，若需将接地与参考分离，可通过移除连接两者的0Ω电阻，在放大器芯片上实现独立。</li>
	<li>将已镀锡的纳米连接器导线焊接到公-公连接器上与接地/参考引脚相同的一侧。每根导线对应特定通道，因此此时可完成通道配置。放大器头级的通道映射图可在Open Ephys Wiki网站获取（https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home）。根据已知通道信息，将相应导线焊接到对应的引脚，以实现所需的通道映射。</li>
	<li>使用剪线钳在纳米连接器底部剪除未使用的导线。</li>
	<li>使用电压表检测每个引脚是否与其他所有引脚在电气上相互隔离。确认隔离无误后，在每个焊点周围涂上一层薄薄的指甲油，以进一步绝缘各引脚。</li>
	<li>使用双组分环氧树脂，加固纳米适配器与公-公连接器上的双侧2 x 7和2 x 1引脚。 
	注意：该单一适配器将分为两个部分，分别匹配之前制作的头件两半的引脚排列。必须确保适配器每一半的内侧部分没有多余的环氧树脂溢出至公-公连接器的塑料边缘，否则会导致头件的两个部分无法同时插入。切勿让环氧树脂流入适配器引脚部分的底面，否则也会妨碍正常连接。可使用两个头件半部作为模具，确保连接器引脚正确对齐。</li>
	<li>用环氧树脂固定适配器的两个部分，并将纳米连接器的基部也进行环氧加固，以提高其耐用性。务必用环氧树脂覆盖所有焊点。让适配器静置过夜使其完全固化。</li>
	<li>可通过Open-Ephys图形用户界面（GUI）中的阻抗测量来验证通道映射是否正确。完成后的适配器重量约为1.3 g（图1F）。</li>
</ol>
3. 手术
<ol>
	<li>准备无菌手术区域。
	<ol>
		<li>佩戴无菌手套及其他必要的个人防护装备。将器械在高压灭菌器中灭菌。使用1.0 mM二氧化氯溶液对立体定位仪进行消毒，将溶液喷洒在仪器表面，静置5分钟后用无菌水冲洗。</li>
		<li>对可植入的头件部件进行灭菌时，将各组件喷洒1.0 mM二氧化氯溶液，静置5分钟后用无菌水冲洗。将已灭菌的植入硬件放入无菌培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录小鼠术前体重，随后将其置于200 ml的诱导室中，使用100%氧气携带1.5–2.0%异氟烷进行麻醉。通入诱导室的气体流速约为500 ml/min。</li>
	<li>通过旋转诱导室确认小鼠翻正反射消失。将小鼠从诱导室中取出，放入立体定位仪的鼻罩中，暂不使用耳杆完全固定头部。在继续监测麻醉深度（通过脚趾夹捏评估）的同时，观察其生命体征。</li>
	<li>使用闭环温控系统（如直肠探头与加热垫系统）维持小鼠核心体温在37 °C。使用弯头剪刀或剃毛器去除颅骨顶部的毛发前，先用眼用软膏覆盖小鼠眼睛。用聚维酮碘对头部进行消毒，并待其完全干燥后再继续操作。</li>
	<li>通过腹腔注射给予镇痛药、抗生素及补液。对于25 g的小鼠，剂量为：头孢唑林0.5 mg、美洛昔康0.125 mg、生理盐水0.5 ml，以及布托啡诺2.5 μg，每4–6小时按需给药一次。</li>
	<li>在头部中线皮下注射250 µl 0.25%布比卡因，并在小鼠双侧颧弓处各皮下注射100 µl 0.25%布比卡因。</li>
	<li>将小鼠固定于立体定位仪上并暴露颅骨。
	<ol>
		<li>使用立体定位仪的耳杆固定小鼠头部。通过确认脚趾夹捏反射消失，确保小鼠处于手术麻醉水平。使用11号一次性手术刀在颅骨中线处做1.5–2.0 cm的切口，切口起始于两眼之间，向后延伸至枕部。</li>
		<li>使用微型止血钳向两侧牵拉皮肤以暴露颅骨。将异氟烷浓度从2.0%下调至可维持手术麻醉深度的最低浓度，但不得低于1.0%（在100%氧气中）。术前镇痛可减少维持麻醉深度所需的吸入麻醉药量，有助于加快恢复并改善存活率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调平颅骨并钻孔。
	<ol>
		<li>识别前囟（Bregma），并将立体定位坐标在前囟处归零，使其成为坐标系的原点。为在内侧/外侧轴上调平颅骨，将连接于立体定位操纵臂的调平探针从前囟向左右两侧各移动1.50 mm，确认探针接触颅骨左右两侧时背侧/腹侧深度差小于0.05 mm。 
		注：使用分辨率为10 µm的背腹向操纵臂配合数字坐标显示器可简化调平过程。以前囟为中心在前后轴上调平采用相同方法，前囟与后囟（Lambda）之间的腹侧距离差也应小于0.05 mm。
		<ol>
			<li>调整颅骨直至两个方向均完成调平，使横断面与地面平行。这可确保获得与小鼠脑图谱中一致的真实立体定位坐标。20</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用直径0.5 mm的微型钻头，在立体定位钻机上从Bregma前3.30 mm至后4.50 mm处，以1.30 mm为间隔，在中线两侧1.00 mm处钻孔。对于电极外侧2.30 mm的列，从中线两侧从前囟前2.00 mm至后4.50 mm处，以1.30 mm为间隔钻孔（图2）。数字立体定位操纵臂10 µm的分辨率可简化此类高精度钻孔操作。 
		注：为确保头件引脚正确植入，小鼠颅骨必须在立体定位仪中牢固固定。若钻孔过程中颅骨发生移动，可能导致头件与钻孔错位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>植入头件。
	<ol>
		<li>使用直镊为胸部肌电图（EMG）导线制作皮下隧道。在背部皮肤与肌肉之间为左右两侧EMG导线分别开辟约2.5 cm的通道。先将胸部和颈部EMG导线插入直镊创建的腔隙中，再使用弯镊调整脑电图（EEG）模块，使引脚对准先前钻好的孔位。</li>
		<li>对头件施加轻微压力，并轻轻晃动使引脚插入颅骨。引脚直径为0.46 mm。使用绝缘指甲油后，引脚可在钻孔中紧密固定。头件正确插入后将保持稳定。调整EMG导线至最终位置。对另一侧头件重复相同操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用牙科水泥固定头件。
	<ol>
		<li>当两个头件均就位后，按1:1比例混合甲基丙烯酸甲酯及其交联剂。将混合物涂抹于暴露的颅骨表面、涂有指甲油的电极引脚部分以及EMG导线的近端部分，但避免覆盖头件的雌性接口。</li>
		<li>确保水泥不沾染毛发，避免形成小鼠可抓握的水泥凸起。给予足够时间使水泥完全干燥，随后将小鼠从立体定位仪中取出。小鼠需承载的总重量（包括两个头件半体及固定水泥）约为1.2 g。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将动物置于清洁的恢复区域。
	<ol>
		<li>使用加热垫维持核心体温。持续监测小鼠直至其恢复所有姿势反射，表明已从麻醉中苏醒。建议长期恢复期间进行单独饲养。</li>
		<li>建议术后至少连续3天每日监测，并根据需要给予干预性镇痛。术后应给予10–14天恢复期，之后再开始进行有线适应期。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使动物适应拴系
<ol>
	<li>使用小鼠头部固定装置将适配器连接到小鼠（图1G-H）。当小鼠被固定后，用弯止血钳夹住已用胶固定到位的头件对角，缓慢将适配器插针插入两侧植入的头件中。</li>
	<li>将32通道放大器连接至适配器（图1H）。务必使适配器与放大器上的标识朝向一致，以确保两者方向统一，防止通道映射错误。将放大器连接至RHD2000标准串行外设接口（SPI）电缆。该电缆将连接至信号采集系统以进行信号记录。</li>
	<li>将小鼠置于一个装有悬臂臂的记录室内，将SPI接口电缆连接至悬臂臂，并调节悬臂臂张力以平衡拴系电缆的重量。在记录前一周，每天让小鼠在该环境中自由活动一小时以适应环境。</li>
	<li>断开小鼠连接时，只需拔下连接小鼠的电缆和适配器，同时使用平头不锈钢微型刮铲辅助将适配器从小鼠身上分离。</li>
</ol>
5. 信号提取系统设置/信号记录
<ol>
	<li>将组装好的适配器插入已植入小鼠的头件中。将头级放大器连接到适配器，并将标准SPI接口电缆连接至放大器和数据采集板。确保SPI电缆连接至张力适当的悬臂，以尽量减少小鼠头部所承受的额外重量。</li>
	<li>使用导电网或铝箔构建局部法拉第笼，将其包围在头级放大器周围，并将该局部法拉第笼接地。</li>
	<li>在每次记录开始前，通过在图形用户界面（GUI）中选择30 kS/sec的采样率，并使用界面模块测量电极阻抗。单个电极针的阻抗值需小于或等于10 kΩ，以确认电极接触良好；若阻抗过高，则该电极的数据将被舍弃。</li>
	<li>进行记录时，在GUI中建立Rhythm FPGA、带通滤波器和LFP查看器的信号链。建议选择1.00 kS/s的采样率，带宽为0.1–7,500 Hz，并取消选中DSP。将带通滤波器设置为0.1–250 Hz，并通过打开LFP查看器显示各通道。选择250和400 µV的通道幅度并采用“draw”方法可最佳地可视化数据。</li>
	<li>使用GUI开始记录。为每次记录创建一个新文件夹，并将文件保存路径设置为此文件夹。只需点击“record”即可开始记录。默认情况下，连接器的所有32个通道均会被记录，但可在记录开始前，通过点击Rhythm FPGA模块右侧取消选择不需要的通道。</li>
	<li>将数据导入Matlab进行分析。有多种开源工具箱可用于辅助数据分析。</li>
</ol>

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<li>Berger, R. D., Akselrodv, S., Gordon, D., Cohen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Algorithm+for+Spectral+Analysis+of+Heart+Rate+Variability%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">An Efficient Algorithm for Spectral Analysis of Heart Rate Variability.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 33 (9), 900-904 (1986).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

描述了在小鼠中正确建立26通道高密度脑电图（EEG）蒙太奇所需的低成本构建方法及手术步骤。在该系统中，确保硬膜外电极的良好接触对于获取高质量EEG信号至关重要。本方案通过两个步骤解决此问题：修剪电极针以匹配大脑轮廓，以及在用丙烯酸树脂加固前完成头件的植入。构建过程中需注意避免将电极针剪得过短。在植入头件时，必须在最终进行丙烯酸树脂加固前检查电极针的位置。一种确认电极接触是否良好的方法是通过阻抗测试。通常，5–10 kΩ的阻抗值表明电极已正确置于硬膜外位置。

关键词：高密度脑电图，EEG，小鼠，硬膜外电极，电极阻抗，神经生理学，电生理记录，脑监测.26&#160; 阻抗测量结果表明，植入后至少4个月内，电极阻抗值在5-10 kΩ范围内保持稳定，证明了头件的耐用性。另一个关键步骤是将肌电图（EMG）针脚与2 x 7脑电图（EEG）模块后方最末端的两排针脚对齐。这对于适配器连接至关重要，因为EMG与EEG针脚若未对齐，将导致无法连接适配器或造成适配器针脚弯曲。
该采集系统的一个主要优势是能够轻松修改电极阵列的形状，以优化不同的实验需求。可根据特定实验快速创建最合适的定制化电极排布。针对特定实验的定制化设计，有望将脑电图（EEG）与套管结合，实现定向药物递送，从而开展药理学、脑电生理学和行为学的联合研究27。遵循上述方案中描述的方法，可方便地将头戴装置、适配器和手术流程适配于多种研究。该采集系统的第二个主要优势是成本低廉。目前，该系统可在最多4根独立电缆上记录128个输入通道，允许同时对4只小鼠进行记录，或根据需要使用更高密度网格对大鼠进行记录。如需扩展，仅需增加额外的电缆和适配器即可。
这种高密度脑电图（EEG）采集方法克服了现有其他小鼠高密度EEG采集技术的缺点。本文所述系统使用简单材料即可方便构建，采用开源且成本低廉、性能稳定的硬件与软件，可在同一只动物身上进行长达数月的重复测量，允许实验过程中自由活动，并且无需在记录时对小鼠实施麻醉。该系统的局限性在于，截至目前仅在体重20 g及以上、年龄超过12周的小鼠中得到验证；体型更小或更年幼的小鼠可能在头件植入过程中遇到困难。该方法的另一局限性在于头件制作完成后无法精确控制电极植入深度。然而，传统螺钉式EEG电极同样存在这一局限，因为无法精确获知死亡前螺钉相对于皮层表面的植入深度。该方法的常见问题排查通常涉及在小鼠连接线缆时，正确屏蔽来自小鼠的干扰信号，以获得无噪声的记录信号。
高密度脑电图（EEG）阵列对于现代脑电图解读中日益普遍的复杂时空分析至关重要。尽管此处展示了视觉诱发电位的空间分布，但利用该系统获取的数据还可通过电生理源成像技术和神经元连接性测量方法进行分析。与传统的螺钉式电极接触相比，这些电极针的接触面积减少了60%至70%，从而实现了更精确的信号定位，如图4所示。在基因修饰小鼠、药物干预后的小鼠或具有内在病理特征（如癫痫等发作性疾病）的动物中应用高密度分析技术，有助于阐明产生特定皮层振荡的机制，定位事件相关电位（ERPs）和诱发电位（EPs）的来源，并揭示大规模神经网络的特性。通过更贴近人类神经系统，该方法将提升小型动物在人类神经生理学和神经病理学研究中的模型价值，从而更便捷地将啮齿类动物模型中的科学发现转化为人类科学研究与临床应用的成果。

神经元活动可以通过细胞外记录的方式，以不同精细程度进行检测，从微观层面（单个动作电位）到中观层面（局部场电位），再到宏观层面（脑电图）。这些脑电波信号通常在频域中进行经典分析，以表征行为状态、神经生理或电生理状态。这种分析可基于单个生物电信号进行4，但稀疏密度的脑电图记录无法解析神经元活动的空间成分。现代脑电图分析依赖于多个电极，以生成皮层活动时空分布的详细图谱，从而将这些活动与特定的心理状态和生理过程相关联5-7。其中，两种较为常见的、需要高密度脑电图蒙太奇的分析类别是电生理源成像和神经网络连接性测量8-11。
电生理源成像涉及功能活跃脑区的定位。电极阵列的地形图可以可视化事件相关电位（ERPs）和诱发电位（EPs）期间大脑内电活动的电流源密度。电生理源定位常用于癫痫研究以及功率分布分析12-15。由于脑电图（EEG）具有高时间分辨率，EEG研究可实现对ERPs和EPs的实时评估，以及时间上精确的事后分析3,11,12。
将认知状态和功能与脑电图上观察到的振荡相互作用相关联，是各种神经网络连接性测量方法的最终目标。大量研究表明，不同脑区之间振荡的同步化和相位锁定与特定的觉醒状态、注意力及行为活动相关6,13,14,16-19。要证实脑区之间的此类信号关联，需要采用高密度电极阵列，以实现对网络连接性的有效评估。
源定位和脑电图（EEG）信号的网络分析最初源于人类研究，但探究这些信号的神经基础必然需要借助动物模型，因为相关研究需要采用在人类中无法实施的侵入性技术。1-3,7 为了在啮齿类动物模型中重现此类分析，需要一种能够采集啮齿类动物大脑高密度脑电信号的方法。尽管已有研究团队为小鼠构建了高密度微电极阵列，但这些方法对于缺乏纳米加工设备的研究人员而言难以获取，或因稳定性不足而无法支持长期重复实验，或仅限于在麻醉小鼠中使用。本文展示了一种低成本、可用于构建慢性高密度经颅电极阵列的替代方案。
本文所述的信号采集方法不仅限于脑电图（EEG），还包括肌电图（EMG）信号。采集EMG信号可作为定义行为状态的补充手段，尤其适用于睡眠研究。该方法介于昂贵的超高密度颅内电极阵列与传统螺钉电极所能实现的有限导联数之间，后者导联数量不足，难以满足高级分析方法的需求。该头戴式电极装置设计简单，成本低廉，适用于高通量研究。在啮齿类动物模型中，将此采集系统与多种遗传学或药理学操控技术结合使用，有助于揭示皮层振荡产生的机制、由真实基因型差异导致的行为分歧、事件相关电位（ERPs）和诱发电位（EPs）的源定位，以及大规模神经网络间的通信机制。

<table><tbody><tr><td>32 通道 RHD2132 放大器头级</td><td>Intan Technologies</td><td>C3314</td><td></td></tr><tr><td>采集板</td><td>Open Ephys</td><td>v2.2</td><td></td></tr><tr><td>100 针插座连接器</td><td>Digi-Key</td><td>ED85100-ND</td><td>头件</td></tr><tr><td>丙酮（1 L）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179973-1L</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片（100 片装）</td><td>McMaster Carr</td><td>3962A4</td><td></td></tr><tr><td>剪线钳</td><td>MSC Industrial</td><td>321786</td><td></td></tr><tr><td>双组分环氧树脂</td><td>McMaster Carr</td><td>7605A18</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯涂层银线（25 英尺）</td><td>A-M Systems</td><td>787000</td><td>肌电图导线</td></tr><tr><td>CircuitWriter 笔</td><td>MCM Electronics</td><td>200-175</td><td>电极尖端银涂层涂覆工具</td></tr><tr><td>36 针双排微型公头连接器</td><td>Omnetics Connector Corporation</td><td>A79028-001</td><td>头件至放大器转接器</td></tr><tr><td>双排插针连接器 2 x 50</td><td>Digi-Key</td><td>ED83100-ND</td><td>头件至放大器转接器</td></tr><tr><td>Clidox 基液与活化剂</td><td>Pharmacal</td><td>95120F &amp; 96120F</td><td>消毒剂</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Priamal Enterprises Ltd</td><td>66794-019-10</td><td></td></tr><tr><td>氧气</td><td>Airgas</td><td>OX USP300</td><td></td></tr><tr><td>闭环温度控制器</td><td>CWE Inc.&amp;nbsp;</td><td>08-130000</td><td></td></tr><tr><td>弯头剪刀</td><td>FST</td><td>14085-09</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 盐酸布比卡因</td><td>Hospira</td><td>0409-1159-02</td><td>局部麻醉剂</td></tr><tr><td>美洛昔康 5 mg/ml</td><td>Henry Schein</td><td>6451602845</td><td>镇痛/抗炎药</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td>Hospira</td><td>0409-4888-20</td><td>输液</td></tr><tr><td>头孢唑林</td><td>Hospira</td><td>0409-0806-01</td><td>抗菌剂</td></tr><tr><td>11 号一次性手术刀（20 片装）</td><td>Feather</td><td>2975#11</td><td></td></tr><tr><td>微型止血钳</td><td>FST</td><td>18052-3</td><td></td></tr><tr><td>棉签（1000 支装）</td><td>MSC Industrial</td><td>8749574</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 微型钻头</td><td>FST</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>立体定位钻</td><td>Kopf</td><td>Model 1471</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-5136</td><td></td></tr><tr><td>甲基丙烯酸甲酯</td><td>A-M Systems</td><td>525000</td><td>头件固定用胶</td></tr><tr><td>甲基丙烯酸甲酯交联剂</td><td>A-M Systems</td><td>526000</td><td></td></tr><tr><td>弯头止血钳</td><td>FST</td><td>13003-10</td><td>辅助转接器连接</td></tr><tr><td>RHD2000 标准 SPI 接口电缆（3 英尺）</td><td>Intan Technologies</td><td>C3203</td><td></td></tr><tr><td>悬臂支架</td><td>Instech</td><td>MCLA</td><td></td></tr><tr><td>微型刮勺（12 支装）</td><td>Fischer Scientific</td><td>S50822</td><td></td></tr><tr><td>数字控温焊台</td><td>MCM Electronics</td><td>21-10115</td><td></td></tr><tr><td>松香芯焊锡 60/40 锡/铅</td><td>MCM Electronics</td><td>21-1045</td><td></td></tr><tr><td>含硬化剂的 Color Craze 指甲油（硝化纤维素基）</td><td>L.A. Colors</td><td>CNP508</td><td></td></tr><tr><td>带数字显示控制台的小动物立体定位仪</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td></td></tr></tbody></table>

使用低成本开源资源在啮齿类动物模型中进行高密度脑电图采集

High-density Electroencephalographic Acquisition in a Rodent Model Using Low-cost and Open-source Resources

需要高空间分辨率的高级脑电图分析技术，包括电生理源成像和脑网络连接性测量，正被应用于神经科学领域日益广泛的研究问题中。在啮齿类动物模型中开展此类分析需要比传统螺钉电极更高的电极密度。尽管目前已存在用于啮齿类动物的高密度脑电图电极布局方案，但这些方案对大多数研究人员而言可及性有限，或难以在长期、多次重复实验中保持稳定性，或仅限于在麻醉状态下的啮齿类动物中使用1-3。本研究探讨了一种低成本、可构建耐用且高通道数的经颅电极阵列的方法，该阵列由可双侧植入的头部组件构成，旨在实现对小鼠或大鼠进行高级脑电图分析。

本文介绍了用于制作头部装置及外科植入的步骤，这些步骤对于获得高信噪比、低阻抗的脑电图和肌电图信号至关重要。尽管该方法在大鼠和小鼠中均适用，但本论文重点介绍在更小的小鼠颅骨上实施的更具挑战性的操作。自由活动的小鼠仅在记录期间通过一个通用适配器连接记录电缆。下文描述了该电极系统的一种版本，包含26个脑电图通道和4个肌电图通道。

在植入高密度 EEG 头戴装置的自由活动小鼠中记录的示例数据如图3所示。各个 EEG 波形对应于图2中所示的通道映射方案。图3还展示了颈段和胸段 EMG 的示例。请注意，胸段 EMG 记录中还包含源自小鼠心脏的电活动，当计算两条胸段 EMG 导线（T）之间的差分信号时，该心脏电活动会变得明显。通过此记录，还可通过测量心电图 QRS 波峰之间的时间来计算小鼠的心率23-24。类似地，可通过计算每次呼吸时胸腔扩张和收缩引起的 QRS 波峰的时相性变异，来测量小鼠的呼吸频率25。因此，该装置可用于获取小鼠多导睡眠图。此外，该装置还能够实现视觉诱发电位的皮层定位映射（图4）。当仅向小鼠左眼给予一个持续 10 毫秒的光脉冲时，可在对侧（而非同侧）初级视觉皮层记录到典型的反应，随后在对侧次级视觉皮层出现延迟反应。图4中嵌入的视频展示了整个皮层表面随时间变化的电位分布，以及对侧 V1 和 V2 区域活动的图表。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td></td>
			<td>0.4</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.7</td>
			<td></td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-0.6</td>
			<td></td>
			<td>0.9</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1.9</td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>1.1</td>
			<td>1.1</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-3.2</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4.5</td>
			<td>3</td>
			<td>0.7</td>
			<td>0.7</td>
			<td>0.7</td>
			<td>0.7</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML</td>
			<td></td>
			<td>-2.3</td>
			<td>-1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：引脚修剪长度。 本图显示了头件每个引脚所需的修剪长度（单位：mm）。引脚修剪长度数据来源于小鼠脑图谱。修剪引脚后，头件可与脑表面轮廓相匹配。20 肌电图（EMG）引脚被完全剪除，因为用于记录EMG信号的导线已焊接在引脚残端上。
<img alt="显示用于小鼠研究的多导联头端连接器组件的神经科学实验装置示意图。" src="/files/ftp_upload/54908/54908fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1： 头件组件、中间构建步骤及记录时的正确连接方式。 本图展示了用于制作头件的原始材料。从一个100针插座连接器开始，将其切割制成较小的2×7和2×1组件。请注意，在2×1组件中保留了原始2×50连接器的边缘，这有助于头件的一致性构建，并允许一个适配器连接多只植入电极的小鼠。图 1B 和 1C 展示了将头件与放大器连接所需的适配器制作材料。图 1B 显示的是适配器的头件端，同样经过裁剪以连接头件。请注意，此处的2×1组件也保留了原始组件的边缘，以确保适配器与头件之间的正确连接。图 1C 展示了适配器连接放大器的一端。图 1D 展示了用环氧树脂固定的2×7和2×1组件，以及用于信号记录的准备好的肌电图（EMG）导线。图 1E 展示了一个已完成的头件。图 1F 展示了一个已完成的适配器。图 1G 展示了头件与适配器之间的正确连接状态。最后，图 1H 显示了一只已植入头件并连接适配器和放大器的小鼠。放大器芯片通过接口电缆连接至数据采集板（图中未显示）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54908/54908fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于神经科学研究的脑图谱示意图，旁边放置一枚硬币作为比例参照，显示电极阵列设置。" src="/files/ftp_upload/54908/54908fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：电极布局及完整组装的头戴装置。本图展示了电极在小鼠脑内的放置位置。各电极的位置基于前囟（Bregma）的立体定位坐标确定，具体坐标可在实验方案的第 4.8 步中找到。电极颜色对应其下方的脑区：白色 = 额叶联合皮层（FrA），橙色 = 初级运动皮层（M1），粉色 = 次级运动皮层（M2），深绿色 = 初级体感皮层前肢区（S1FL），绿色 = 初级体感皮层异颗粒区（S1DZ），浅绿色 = 初级体感皮层桶状区（S1BF），黄色 = 内侧顶叶联合皮层（MPtA），深蓝色 = 初级视觉皮层（V1），浅蓝色 = 次级视觉皮层内内侧区（V2MM），黑色 = 压后皮层异颗粒区（RSD）。20 图中同时显示了公共参考/接地电极。该参考方案可最大程度减少原始信号中的呼吸伪迹。每个电极旁的数字提供了整个阵列的通道分布图。图像改编自 Allen 小鼠脑图谱。21,22 图 2B 展示了与一角硬币比例相当的完整头戴装置。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54908/54908fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑电波形图；使用脑电图进行脑活动分析；信号测量。" src="/files/ftp_upload/54908/54908fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： 电极布局记录的脑电图（EEG）和肌电图（EMG）示例波形。 电极波形对应于图1A所示的通道映射。颈部肌电图（C）可用于评估颈肌张力（+）。肌电信号中还包含心脏QRS电冲动（*）。图中显示的标尺分别为200 µV（波形幅度）和1秒（波形时程）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54908/54908fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有电压标尺、光强度图和电压-时间曲线的电生理学色谱图。" src="/files/ftp_upload/54908/54908fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：视觉诱发电位的空间分布。 仅对左眼施加单侧闪光刺激后诱发电位的空间分布。上方图示为高密度脑电图（EEG）导联布局，每个圆圈代表一个电极。颜色随时间变化对应于各个电极记录的电压随时间的变化。在时间 = 0 毫秒时施加一个持续 10 毫秒的光脉冲，如中间图所示。下方图形展示了对侧 V1 和 V2 脑电图电极的平均诱发电位轨迹（n = 108 次诱发电位试验）。光脉冲发生在 0 毫秒处。请注意，相应的诱发电位反应首先出现在对侧 V1（黑色轨迹），随后在对侧 V2 出现潜伏期较长的诱发电位反应（红色轨迹）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54908/Figure_4.mov" target="_blank">（右键单击以下载）</a>

本文提供了在小鼠中低成本构建和外科植入慢性经颅高密度脑电图蒙太奇的详细说明，同时描述了信号记录、提取和处理技术。

需要高空间分辨率的高级脑电图分析技术，包括电生理源成像和网络特征测量……

本方法学的总体目标是展示一种低成本的替代方案，用于构建和记录慢性高密度经颅电极阵列。该方法有助于回答神经科学领域的一些关键问题，例如神经元网络的大规模组织特性，以及感觉诱发反应的空间和时间特征。该技术的主要优势在于成本低、可重复性强，且易于根据具体实验需求进行定制化调整。尽管该方法可为脑电图数据的复杂分析提供见解，但其应用特别适用于麻醉学、癫痫以及睡眠神经生物学的研究。制作头戴装置时，首先用一层极薄的指甲油将2×50针砖的针脚进行绝缘处理。然后，用镊子将每第八排针的插座端从砖体中推出，从而移除这些针排。待指甲油完全干燥后，用一小块布蘸丙酮将针尖上的涂层去除。然后使用剃刀刀片或剪线钳修整包埋块，制备成 2×7 针阵列的砖状结构。其中两块将用作经颅 EEG 电极。接下来，从一个 2×50 砖块的两端分别制备两个 1×2 针脚砖块，使用相同的方法记录肌电（EMG）信号。每个 1×2 砖块应保留 2×50 砖块的一侧外侧光滑面。为完成整个阵列的两个半部分，需将一个 1×2 砖块的针脚孔和针脚与一个 2×7 砖块最后排的针脚对齐。然后，使用双组分环氧树脂将它们的光滑表面粘合，并在必要时用更多环氧树脂加固连接处。让两部分在室温下固化过夜。要制作两条胸部肌电图导线，首先取一段3 cm长的绝缘银线。从一端去除1厘米绝缘层，并用镊子将裸露的导线绕成两个线圈。然后从另一端去除25毫米绝缘层。接着，制作另外两根类似的颈部肌电图导线，从一根1.5厘米长的导线开始。从每个头饰半片上，移除最前排的侧向针，因为该针不会接触到相关组织。为了连接导线，将一乘二砖块的针从其尖端处截短至3 mm。然后将颈部肌电图导线焊接到前部针上，将胸部肌电图导线焊接到后部针上。在继续操作前，使用万用表的通断测试模式，确保每个引脚均处于电学隔离状态。将表笔连接至不同的引脚组合，若某对引脚存在电学连接，万用表将发出 audible beep（ audible beep 为设备提示音，此处保留原文描述）。待完全干燥后，弯曲肌电图（EMG）导线，使其与前后轴（AP轴）平行，并尽量减少侧向位移。然后用指甲油覆盖焊点。接着，借助脑图谱并使用导线剪调整针脚长度。找出从前囟向腹侧距离最大的针脚。不要修剪此引脚，而是以该引脚为基准修剪所有其他引脚。为完成耳机部件，使用涂敷笔将银溶液覆盖所有引脚的尖端。准备适配器时，从一个36位双排公头纳米连接器开始。首先，将连接线修剪至统一的2 cm长度。然后，剥去每根导线末端2.5 mm的绝缘层。最后，将细导线的金属丝部分上锡并绞合在一起，并剪去已上锡导线上残留的绝缘层。接下来，使用一个双排50针的排针插座制作一个与头件相匹配的公对公连接器。与之前相同，准备两个双排7针和两个双排1针的排针。然后，将nano连接器的一根接地线焊接到位于前囟前方0.6 mm、外侧1 mm处的引脚上。该引脚用作参考电极，在使用 RHD 2132 放大器芯片时也作为接地引脚。接下来，将已镀锡的纳米连接器导线焊接到与接地引脚相同的侧面。由于每根导线对应特定的通道，需参考放大器前置放大头级的通道映射图，并进行通道匹配。将所有导线焊接至对应的引脚后，剪去任何未使用的导线。然后使用电压表检查，确保每个引脚与其他引脚之间均处于电气隔离状态。确认电气隔离无误后，在每个焊点周围涂上一层薄薄的指甲油，以进一步绝缘各个引脚。然后，使用双组分环氧树脂，将匹配的纳米适配器加固到公-公模块的双侧针阵列上。适配器内侧部分不得有过多环氧树脂，否则会阻碍头戴部件同时插入。为提高耐用性，需用环氧树脂固定纳米连接器的底部。务必用环氧树脂覆盖所有焊点。环氧树脂干燥后，通过阻抗测量确认通道映射。小鼠固定稳妥并以颅骨前囟作为立体定位坐标系的原点后，调整颅骨在内外侧轴和前后轴方向上保持水平。然后，使用直径为0.5 mm的微型钻头，在距中线1 mm、前后相距1.3 mm的位置上钻孔，起始于前囟前3.3 mm处，终止于前囟后4.5 mm处，双侧各制备两排孔。接下来，在中线两侧钻孔，孔间距为1.3 mm，起始于前囟前2 mm处，终止于前囟后4.5 mm处。现在植入头件。使用直镊子为胸部肌电图（EMG）导线制作导线通道。从小鼠背部皮下约2.5 cm深处穿行通道，并将EMG导线置入该腔隙中。接下来，使用弯头镊子移动脑电图（EEG）插块，使插针与颅骨钻孔对齐。施加轻微压力并轻轻晃动插针，使其插入颅骨。插针正确插入后，脑电图装置将保持稳定。接下来，将肌电图导线调整至最终位置。固定后，配制甲基丙烯酸甲酯与其交联剂的1:1混合液。然后，用牙科水泥覆盖暴露的颅骨、针电极的指甲油涂抹部分以及肌电图导线的近端部分。切勿覆盖头件的雌性接口，也不要将任何胶水沾到动物的毛发上。待胶水干燥后，固定手术即告完成。将小鼠从立体定位仪上取下，在监测其生命体征的同时让其恢复。手术后两周，完全恢复的小鼠可通过适配器连接记录电缆进行适应性训练。小鼠适应后即可用于实验。将小鼠通过适配器、放大器和标准接口电缆连接到数据采集板后，打开 Open E-Fizz 记录软件。在此处，通过将模块拖入信号链中，创建一个节奏 FPGA 与局部场电位（LFP）查看器的信号链。接着，获取每秒 30.0 千采样的电极阻抗值。然后选择所需的记录采样率。如有需要，也可将滤波器拖入信号链中。接下来，选择数据的保存路径和所需的采样率，然后单击LFP查看器窗口并按下播放按钮。现在，使用绘图方法来可视化脑电图（EEG），通过调整信号幅度、扫描速度以及所用滤波器的设置来调节显示视图。完成所有参数设置后，开始进行记录。数据采集自一只自由活动的小鼠，该小鼠植入了高密度脑电图头戴装置。胸部肌电图记录中包含源自心脏的嵌入式电活动。颈部肌电图包含有关肌张力的信息。各个脑电图波形对应于通道映射方案。通过该记录，可通过测量心电图QRS波峰之间的时间来计算小鼠的心率。同样，可通过计算每次呼吸时胸腔扩张和收缩引起的QRS波峰的相位变化，来测量小鼠的呼吸频率。因此，该装置可用于获取小鼠多导睡眠图。该装置能够实现视觉诱发电位的皮层定位。当仅向左眼给予一个持续十毫秒的光脉冲时，可在对侧初级视觉皮层记录到典型的反应，随后在对侧次级视觉皮层出现延迟反应。这一现象在对侧V1和V2区全皮层表面随时间变化的电位分布中清晰可见。观看本视频后，您应能充分理解如何为啮齿类动物模型构建高密度微电极阵列，并对植入后的阵列进行信号记录。一旦掌握，若操作得当，该技术的构建与植入步骤可在两小时内完成。实施此过程时，重要的是要注意在不穿透硬脑膜的前提下，实现适当的硬膜外电极接触。在植入头件过程中仔细修剪引脚并保持专注，将最大程度地确保电极接触良好。祝你好运！

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高密度的脑电图采集在啮齿动物模型使用低成本的开源资源

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诱导重复性弥散性创伤性脑损伤小鼠模型中的创伤后癫痫

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低成本脑电图记录系统结合毫米级线圈用于活体小鼠脑部经颅刺激 体内

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一种经济高效且微创的自由活动小鼠多部位慢性脑电图记录方案

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使用低成本开源资源在啮齿类动物模型中进行高密度脑电图采集

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