使用硝酸纤维素结合分析细菌组氨酸激酶自身磷酸化的定量分析
2017年1月11日
我们报告并展示了一种优化的硝酸纤维素结合测定法，可用于定量纯化的细菌组氨酸激酶的自磷酸化。与传统的基于 SDS-PAGE 的技术相比，我们的方法具有多项优势，为表征这些重要蛋白质提供了有价值的替代方案。
该方案的总体目标是量化纯化的细菌组氨酸激酶的自磷酸化。这种方法可以帮助回答双分量信号传导领域的关键问题。例如蛋白质-蛋白质相互作用中同源刺激对组氨酸激酶自磷酸化的影响。
该技术的主要优点是它是一种高通量方法，可用于准确检测形成的磷酸组胺的皮摩尔并获得组氨酸激酶的动力学参数。作为一名博士后研究员，我在硝酸纤维素膜上使用过滤来量化蛋白质结合的放射性配体。因此，开发一种类似的技术来定量细菌组氨酸激酶中的组氨酸磷酸化是有意义的。
按照文本方案中的说明，从制备试剂和材料开始此过程。为了设置 96 孔点图装置，切下一块 8 厘米 x 12 厘米的硝酸纤维素膜。将硝酸纤维素放置在点阵图装置中。
确保膜贴合，使设备密封并且所有孔都完全被膜覆盖。要收集滤液，请将设备连接到辅助 sidearm 烧瓶。从阀杆上连接足够的管路，以便舒适地使用仪器，而不会倾斜辅助培养瓶。
然后，将辅助侧臂烧瓶连接到吸气器真空源。通过对设备施加真空来测试设备是否完全密封。如果设备组装正确，所有孔中都会出现强真空。
所有管道连接都可以用 Parafilm 或 Saran 包裹包裹，以确保紧密密封。在开始之前，按照文本方案中的说明，将所有四种反应组分制备为四种 X 储备液。混合等体积的反应缓冲液、组氨酸激酶和双蒸水。
让这些反应组分在室温下短时间平衡。为了引发反应，加入一体积的 γ-32 P ATP 溶液，并通过上下吹打混合。使用计时器跟踪经过的反应时间，并允许反应在所需时间内进行。
熄灭反应。将反应的等分试样加入 325 毫摩尔磷酸中。立即将淬灭的反应置于冰上，直到所有反应都终止。
将预装的 96 孔点阵图仪放入辅助容器中。这个容器应该足够大，以便设备易于拆卸，因为设备和膜在使用后会具有放射性。对 96 孔点图装置施加真空。
一旦设备处于真空状态，小心地将淬灭的反应直接移液到每个孔中的硝酸纤维素膜上。重复此过程，直到所有反应都加载到膜上。由于硝酸纤维素的结合能力大于斑点组氨酸激酶的量，因此可以假设当正确加载时，几乎所有激酶都与膜结合。
根据所使用的设备，注意不要刺穿硝酸纤维素。观察所有反应都与硝酸纤维素接触。一些反应很容易粘在井壁上。
用 100 微升冰冷的 25 毫摩尔磷酸清洗孔。这将允许可能被困在孔中的任何反应体积到达膜，确保所有反应的完全加载。让整个体积流过膜。
在关闭真空吸尘器之前，请小心地拆卸设备。请注意，该装置和硝酸纤维素膜此时均具有放射性。请勿从辅助容器中取出任何设备组件。
用镊子小心地将硝酸纤维素膜从设备转移到大约 200 毫升 25 毫摩尔冰冷磷酸的容器中。盖上盖子，因为清洗液会具有放射性。此时，真空可能会关闭。
将带有清洗膜的容器放在摇杆上。让膜轻轻摇动 20 分钟。20 分钟后，小心地将用过的洗涤液倒入一个大桶中，用于临时储存废物。
向膜中加入 200 毫升冰冷的 25 毫摩尔磷酸。以这种方式洗涤膜至少 3 次，以去除膜上的背景 γ-32 P ATP 信号。第三次洗涤后，用盖革计数器测试用过的洗涤液的辐射。
继续洗涤膜，直到洗涤液中没有信号。充分清洗膜后，让膜短暂风干，通常需要 5 分钟或更短时间。如文本方案中所述，将硝酸纤维素暴露于磷绿后，准备丽春红 S 染色和脱色。
将硝酸纤维素膜短暂浸入丽春红 S 染色溶液中 1 至 2 分钟。脱色前用染色剂润湿整个膜。然后，从膜上倒出多余的丽春红 S。
用双蒸水冲洗膜，直到只有组氨酸激酶的斑点被染色。请注意，仅当所有点都含有可检测量的蛋白质时，此程序才有效。用剪刀剪掉硝酸纤维素膜上的每个点。
没有必要沿着染色点的边缘完美切割。如果膜被充分洗涤，由于切口点大小不同而导致的背景可以忽略不计。重要的是为每个反应切掉整个斑点。
使用镊子小心地将每个点转移到闪烁瓶中。不需要闪烁鸡尾酒，因为磷 32 很容易被 Cherenkov 辐射检测到。接下来，将几种稀释的 γ-32 P ATP 溶液点到 1 厘米 x 1 厘米见方的硝酸纤维素上。
使用镊子，小心地将每个方块转移到无闪烁鸡尾酒的闪烁瓶中。这些样品将用于生成标准曲线，以确定 ATP 溶液每分钟每皮摩尔的计数。此处显示了硝酸纤维素膜的丽春红染色。
所有样品的染色都是均匀的，表明所有样品的上样量相等。硝酸纤维素膜的荧光成像结果显示每个点中放射性标记的磷酸组氨酸的相对水平。第 4 行和第 8 行是阴性对照，表明过量的 ATP 从硝酸纤维素膜中洗涤。
此处显示了组氨酸激酶自磷酸化定量的代表性结果。该数据是通过对从膜上切出的每个点的闪烁计数生成的。此处显示的每分钟每皮摩尔 ATP 计数的标准曲线也是由闪烁计数生成的，用于计算每个样品中存在的磷酸组氨酸的皮摩尔。
按照此程序，可以将其他方法（例如引入假设调节激酶活性的同源刺激或蛋白质）添加到实验中，以回答其他问题，例如这些添加剂对激酶活性的影响。不要忘记，与放射性一起工作可能非常危险。执行此程序时，应始终采取预防措施，例如进行适当的辐射安全培训以及使用个人防护设备和防护罩。
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概览
本文介绍了一种优化的硝酸纤维素结合测定法，用于定量测定纯化的细菌组氨酸激酶的自身磷酸化。该方法比传统的SDS-PAGE技术具有显著优势，使其成为表征这些蛋白质的有价值工具。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 细胞生物学
- 信号转导
背景
- 组氨酸激酶在双组分信号系统中起着至关重要的作用。
- 了解它们的自身磷酸化对阐明信号传导途径至关重要。
- 传统方法可能无法提供低丰度蛋白质所需的灵敏度。
- 本研究旨在改进组氨酸激酶的定量测定。
研究目的
- 开发一种高通量检测自身磷酸化的方法。
- 探索刺激对蛋白质-蛋白质相互作用的影响。
- 获得组氨酸激酶的动力学参数。
使用的方法
- 在硝酸纤维素膜上进行过滤。
- 定量测定蛋白质结合的放射性配体。
- 检测皮摩尔量的磷酸组氨酸。
- 表征组氨酸激酶的自身磷酸化动力学。
主要结果
- 优化的测定法允许准确定量自身磷酸化。
- 高灵敏度能够检测低水平的磷酸组氨酸。
- 该方法提供了组氨酸激酶活性的动力学洞察。
- 它作为传统SDS-PAGE技术的可靠替代方案。
结论
- 硝酸纤维素结合测定法有效用于研究组氨酸激酶。
- 这种方法增强了我们对双组分信号的理解。
- 未来的应用可能包括更广泛的蛋白质相互作用研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of bacterial histidine kinase autophosphorylation is critical for de-risking early discovery in anti-infective and microbiome-targeted R&D. The nitrocellulose binding assay enables high-throughput, sensitive detection of phosphohistidine, supporting robust target validation and mechanistic studies in two-component signaling systems. This capability enhances predictive confidence at the target interrogation and assay development inflection points, directly impacting portfolio triage and prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of histidine kinase activity in response to environmental or chemical stimuli.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the functional role of two-component signaling proteins.
- Facilitates robust target validation through direct measurement of autophosphorylation events.
- Improves predictive confidence for advancing bacterial signaling targets in discovery pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-throughput assay format for evaluating kinase activity across multiple conditions.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for screening compound libraries or protein modulators.
- Enables rapid assay setup and scalability for platform-based screening workflows.
- Supports reliable comparison of kinase activity under different experimental variables.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling quantification of pathway activation states.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation for bacterial signaling targets.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic data on target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This nitrocellulose binding assay fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a reusable platform for hypothesis testing and pathway analysis in bacterial systems.
- Discovery Biology: Quantifies autophosphorylation to clarify pathway activation and target engagement.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for evaluating modulators of kinase activity.
- Analytics: Generates quantitative readouts and standard curves for robust data comparison.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by measuring functional pathway outputs.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable assay for ongoing bacterial signaling research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, high-throughput, and reproducible assay workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of bacterial signaling targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radiolabel handling and kinase assay design.
- Needs access to nitrocellulose filtration apparatus and scintillation counting infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data integrity.
- Adaptable to various bacterial kinase systems with appropriate optimization.
- Radioactivity safety protocols and waste management are essential operational requirements.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Setting up the 96-well Dot Blot Apparatus
2:02
Reaction Initiation and Quenching
2:57
Spotting of Quenched Reactions on Nitrocellulose
4:51
Nitrocellulose Processing
5:48
Preparing Nitrocellulose Membrane for Scintillation Counting
7:31
Results: Quantification of the Autophosphorylation of V. parahaemolyticus H-NOX Associated Histidine Kinase (Vp1876)
8:35
Conclusion
