用体外激酶法鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1特异磷酸化部位

该体外激酶检测的总体目标是鉴定目标蛋白质中对激酶周期蛋白依赖性激酶 1 具有特异性的磷酸化位点。CDK1 特异性磷酸化位点的鉴定很重要，因为它们提供了有关 CDK1 如何控制细胞周期的机制见解。细胞周期调节对于期全染色体分离至关重要，缺陷会导致染色体畸变和癌症。

该技术的主要优点是依赖于纯化的蛋白质，因此它可以应用于任何模式生物并产生可靠的结果，尤其是与细胞功能研究相结合时。这种方法很重要，因为 CDK1 靶标的已知数量仍然很低，尽管 CDK1 磷酸化了估计 8% 至 13% 的蛋白质。虽然这种方法识别 CDK1 特异性磷酸化位点，但只要纯化的激酶可用，就可以对其进行修改以识别其他激酶的磷酸化位点。

通常，刚接触这种方法的个体会遇到困难，因为必须针对每个蛋白质靶标优化激酶检测的条件，以获得高磷酸化效率。优选 100%使用 IGPS 3.0 软件并访问 Web 服务器，以预测 CENP-F 靶蛋白序列中的 CDK1 特异性磷酸化位点。根据 CDK1 共有序列检查磷酸化位点。

通过制备预培养物开始蛋白表达。按照制造商的说明，将 1 微升表达质粒转化到 50 微升大肠杆菌感受态细胞中。添加质粒后，将细胞在冰上孵育 30 分钟。

然后将细胞在 42 摄氏度下孵育 45 秒。孵育后，将细胞置于冰上 1 分钟，然后向细胞中加入 400 微升 LB，然后在 37 摄氏度下摇动培养物孵育 1 小时。然后将 200 微升培养物铺在 LB 琼脂平板上，补充感兴趣的抗生素，具体取决于构建体。

接下来，将板在 37 摄氏度下孵育 12 至 20 小时，不要摇晃。然后从 LB 琼脂平板中挑选一个菌落，并将菌落接种在 50 mL 补充有所需抗生素组合的 LB 培养基中。在 37 摄氏度下孵育培养物，同时以每分钟 160 至 180 转的速度摇动 12 至 20 小时。

对于每升 LB 培养基，添加抗生素和 10 毫升 40% 重量（按体积计）的无菌过滤葡萄糖溶液。向该培养基中加入 20 毫升致密生长的预培养物。然后在 37 摄氏度下孵育培养物，同时以每分钟 160 至 180 转的速度摇动。

定期检查 600 纳米培养物的吸光度。一旦吸光度达到 0.5 至 0.6，通过添加 0.2 毫摩尔 IPTG 诱导蛋白质表达。然后在 37 摄氏度下摇动培养物孵育 3 小时。

3 小时后，使用水平转子在 4 摄氏度下以 4， 100 倍 G 离心 15 分钟，收获细胞。离心后，排出上清液。对于每升培养物，将细胞沉淀重悬于 20 毫升用于 CENP-F 的 GST 结合缓冲液和 his 6 种用于 karyopherin α 的结合缓冲液中。

然后将细胞储存在零下 80 摄氏度。要纯化 CENP-F，首先用 CENP-F 构建体解冻细胞。然后用 GST 结合缓冲液将体积调节至 20 毫升。

调整体积后，依次加入所有还原剂和蛋白酶抑制剂，以制备用于后续裂解的细胞悬液。接下来，将细胞悬液转移到玻璃烧杯中，并将烧杯浸入冰水浴中。然后对培养物进行超声处理。

超声处理后，向裂解物中加入 250 微摩尔 PMSF，然后检查裂解物，在此阶段应为透明。然后将裂解液在 4 摄氏度下以 12， 000 至 40， 000 倍 G 离心 25 分钟。接下来，通过向一次性色谱柱中加入 2 毫升谷胱甘肽琼脂糖 1 比 1 浆液来制备色谱柱。

为了平衡色谱柱，首先用 25 mL 超纯水洗涤，然后用 25 mL GST 结合缓冲液洗涤。离心结束后，倒出上清液，然后以 0.2 微米的倾倒量过滤上清液。接下来，将裂解物倒在堵塞的柱上以进行结合步骤。

盖上色谱柱盖帽，在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，同时轻轻章动，避免起泡。30 分钟后，将色谱柱转移到架子上，让填料沉淀。然后收集流出物，并用 25 ml GST 结合缓冲液洗涤色谱柱两次。

洗涤完成后，再次塞住色谱柱。然后向柱中加入 400 μL GST 结合缓冲液和 250 μL PS 蛋白酶原液，活性为每毫克 1000 单位。再次加盖色谱柱并轻轻旋转色谱柱，使树脂重悬于缓冲液中，然后在 4 摄氏度下孵育色谱柱 16 至 20 小时。

孵育期结束后，加入 4 mL GST 结合缓冲液，从已蛋白水解裂解的色谱柱中洗脱 CENP-F 片段。接下来，要再次洗脱 GST 标签，请塞上色谱柱。然后向色谱柱中加入 4 mL 含有谷胱甘肽的 GST 洗脱缓冲液。

接下来，将色谱柱孵育 10 分钟，以洗脱结合的 GST 标签。10 分钟后收集洗脱液。然后进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳以分析 PS 蛋白酶和谷胱甘肽洗脱馏分。

接下来，为了浓缩蛋白质样品，将 PS 蛋白酶洗脱液移液到截留分子量为 3 道尔顿的离心过滤器单元的上隔室中。然后在 4 °C 下以 4， 100 倍 G 的增量，以 10 至 15 分钟的增量在水平转子中离心洗脱液，以浓缩样品。每次增加后，通过轻轻上下吹打来混合浓度过滤器中的蛋白质样品，以避免形成浓度梯度。

要通过凝胶过滤纯化 CENP-F，请将凝胶过滤柱连接到快速蛋白质液相色谱系统。接下来，用一柱体积的凝胶过滤缓冲液平衡色谱柱。接下来，将 CENP-F 片段放入微量离心管中，在 4 摄氏度下以 21， 700 倍 G 离心 20 分钟。

离心结束后，将样品注入色谱柱上，然后用凝胶过滤缓冲液洗脱色谱柱并收集 0.6 mL 馏分的 CENP-F 片段。接下来，分析凝胶过滤曲线并运行峰级分的 SDS-PAGE。含有纯 CENP-F 的混合馏分。

然后将纯化的 CENP-F 片段浓缩至 3.3 毫克/毫升。为了确定蛋白质浓度，用超纯水以 1：100 的比例稀释 CENP-F 片段。接下来在光谱光度计中记录 220 到 300 纳米波长的光谱。

接下来，在 0.5 毫升微管中制备 50 微升纯化的 CENP-F 等分试样，然后在液氮中快速冷冻试管并储存在零下 80 摄氏度。对于激酶测定，将 CENP-F 片段与 ATP 和 CDK1 细胞周期蛋白 B 以及其他缓冲液混合在 0.5 毫升微管中。然后制备第二个样品，不含 CDK1 细胞周期蛋白 B 作为阴性对照。

然后将样品在 30 摄氏度的水浴中孵育 1 至 16 小时。为了通过质谱法成功鉴定磷酸化位点，磷酸化效率必须尽可能高，最好是 100%为了提高磷酸化效率，添加更多激酶并将孵育时间增加到 16 小时。然后将等体积的六摩尔盐酸胍溶液加入剩余的激酶测定反应和阴性对照中，并进行质谱分析以鉴定磷酸化位点。

为了获得高质量的质谱数据，纯化的蛋白质样品必须具有高纯度和均一性，这一点也很重要。首先进行 SDS-PAGE 分析，显示与不含 CDK1 的阴性对照相比，磷酸化 CENP-F 在凝胶上的条带明显上移，表明 CENP-F 的 cNLS 是 CDK1 底物。接下来进行质谱分析以分析 CENP-F 磷酸化位点的数量和效率。

完整体外磷酸化 CENP-F 的 ESI 离子阱质谱显示有 5 个峰，表示 4 个磷酸化位点，第 5 个峰是未磷酸化的蛋白质。接下来，该尺寸排阻洗脱曲线显示，在添加野生型 CENP-F 时，karyopherin α 峰的洗脱体积移动到更高的质量数，这在添加 CENP-F 突变体时未观察到。这表明 CENP-F 的模拟磷酸化版本 S3048D 确实削弱了 CENP-F cNLS 与 karyopherin α 的相互作用。

最后完成的 SDS-PAGE 分析表明，具有完整 cNLS 的野生型 CENP-F 片段与 karyopherin α 共洗脱，表明存在强相互作用。然而，CENP-F 和 karyopherin α 的 S3048D 突变体在不同的峰中洗脱。在尝试此过程时，请务必记住根据 CDK1 共有磷酸化序列检查获得的磷酸化位点，并验证鉴定的底物是否与 CDK1 位于同一细胞区室中。

按照此程序，应在细胞或动物模型中进行功能验证，以确认鉴定的磷酸化位点具有生理功能。许多工具可用于功能验证，例如特异性 CDK1 抑制剂和模拟磷酸化突变。由于蛋白质中存在大量 CDK1 底物，许多人类 CDK1 底物仍有待发现，体外激酶测定将成为识别、映射和验证这些位点的重要工具。

鉴定这些磷酸化位点有助于研究 CDK1 如何控制细胞周期的机制。观看此视频后，您应该对如何通过体外激酶测定鉴定 CDK1 特异性磷酸化位点和靶蛋白有很好的了解。