Name: 用体外激酶法鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1特异磷酸化部位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 学习利用体外激酶法鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1特异磷酸化部位，以揭示Cdk1在细胞周期调控中的分子机制。该方法适用于多种模式生物，为癌症生物学研究提供可靠工具。

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感谢加州大学伯克利分校霍华德·休斯医学研究所的大卫·金（David King）博士提供质谱分析和有益的建议。感谢中国科学院上海生命科学研究院朱雪莲（Xuelian Zhu）博士提供全长CENP-F质粒。最后，感谢宾汉顿大学的苏珊·贝恩（Susan Bane）博士、布莱恩·卡拉汉（Brian Callahan）博士和克里斯托夫·格鲁维尔（Christof Grewer）博士提供仪器设备的使用权限。本研究由纽约州立大学研究基金会和纽约州立大学宾汉顿分校化学系资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

我们的 体外 激酶活性检测是一种非常强大的方法，可用于鉴定作为细胞周期主控因子的激酶Cdk1的分子靶标，该激酶调控多种重要的细胞过程。该方法可确定纯化的蛋白质是否为Cdk1的底物，并能够鉴定特异性的磷酸化位点。这有助于深入研究Cdk1通过磷酸化作用调控细胞过程的分子机制。
成功通过质谱鉴定磷酸化位点最关键的因 素是激酶反应中磷酸化的效率。各个磷酸化位点的磷酸化效率应尽可能高，最好达到100%。可通过增加Cdk1/cyclin B的用量并将孵育时间延长至16小时来实现。在计算所需Cdk1/cyclin B的量时，应考虑底物蛋白的摩尔浓度以及磷酸化位点的数量，当目标蛋白中含有多个磷酸化位点时，这一点尤为重要。还需注意， commercially available Cdk1/cyclin B的活性可能因批次不同而存在差异，且该激酶的活性可能迅速丧失。如果 体外 若磷酸化不成功，建议检测激酶的活性。作为故障排除的阳性对照， 体外 可以使用CENP-F（残基2,987-3,065）的磷酸化。作为阴性对照，应进行不添加Cdk1/细胞周期蛋...

激酶是一类将磷酸基团从ATP转移至底物上的酶，可调控多种细胞过程。这种磷酸化修饰具有可逆性，反应迅速，可引入两个负电荷，并储存自由能，是细胞中最常见的翻译后修饰之一。Cdk1（也称为细胞分裂周期蛋白2同源物（cdc2））是所有真核生物细胞周期的主控调节因子1,2,3,4,5，据估计可磷酸化蛋白质组中8-13%的蛋白6,7。
尽管近期的蛋白质组学研究已鉴定出蛋白质中的许多磷酸化位点，但在大多数情况下，负责这些修饰的激酶仍未知。目前已知的Cdk1底物数量较少，尤其是在人类细胞中7。鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点具有重要意义，因为它能够推动机制性研究，阐明Cdk1如何调控细胞周期。细胞周期的调控对于精确的染色体分离和细胞分裂至关重要，多种细胞过程需协同进行以支持这一重要的生理功能。这些过程包括在有丝分裂开始前停止转录和翻译，以及细胞结构和组织发生显著的重组，例如核膜解体、染色体凝缩和有丝分裂纺锤体的组装。这些过程的失调或错误可导致癌症、出生缺陷或有丝分裂性细胞死亡。目前已开发出Cdk1的特异性抑制剂（如RO-3306）8，这些抑制剂为功能研究提供了有力工具，其中一些抑制剂已进入癌症治疗的临床试验阶段（详见9的综述）。
此处，我们描述了一种 体外 一种激酶活性检测方法，可用于鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点。在该实验中，使用商业化的人源Cdk1/细胞周期蛋白B复合物对纯化的靶蛋白进行磷酸化 体外底物的磷酸化会增加其分子量并添加两个负电荷；因此，成功的磷酸化可通过SDS-PAGE中蛋白质条带的上移来确认。随后通过质谱分析鉴定Cdk1特异性磷酸化位点 体外 磷酸化蛋白。为了辅助实验设计，我们还综述了可用于从蛋白质序列预测Cdk1特异性磷酸化位点的计算工具和参考文献。此外，我们描述了可获得高纯度且均一的蛋白样品的纯化方案，适用于激酶活性检测。最后，所鉴定出的磷酸化位点必须通过功能研究加以验证，本文介绍了一种简单的结合实验用于此目的。综合而言，这是一种非常强大的方法，能够鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点，并推动对Cdk1如何调控细胞周期的机制研究。7,10,11由于该方法依赖于纯化的蛋白质，因此可应用于任何模式生物，并能获得可靠的结果。然而，对于所获得的磷酸化位点的功能验证 体外 建议采用这种方法，因为细胞具有其他调控机制，例如翻译后修饰、相互作用伴侣蛋白或细胞定位，这些机制可能使磷酸化位点对Cdk1的识别变得可及或不可及。
Cdk1 识别一个由（Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg）组成的共有序列磷酸化位点，其中 X 为任意氨基酸残基，丝氨酸或苏氨酸是磷酸化的位点。对于识别而言，+1 位置的脯氨酸尤为重要。此外，+2 或 +3 位置更倾向于存在碱性残基，大多数 Cdk1 特异性的磷酸化位点在 +3 位置含有一个 Lys 或 Arg6,12。
Cdk1的激活受到严格调控，并引发有丝分裂的启动1,2,3,4,5。总体而言，周期蛋白依赖性激酶的活性依赖于其与不同周期蛋白（在人类中包括周期蛋白A、B、C、D和E）的结合，这些周期蛋白在细胞周期中呈振荡性表达13。Cdk1在细胞周期中的表达水平保持恒定，其活性调控主要依赖于与调节亚基周期蛋白A和周期蛋白B的结合5,13,14,15，以及翻译后修饰。Cdk1/周期蛋白B复合物的形成为激酶的激活所必需5,14,15,16,17,18。在G2期，周期蛋白B在细胞质中被翻译并转运至细胞核，在那里与Cdk1结合5,14,15,16,17,18；然而，Cdk1/周期蛋白B复合物在Thr14和Tyr15位点被人类Cdk1抑制性激酶Myt1（膜结合的酪氨酸和苏氨酸特异性cdc2抑制激酶）和Wee1分别磷酸化，从而维持其失活状态19,20,21。在G2晚期，细胞分裂周期25磷酸酶（cdc25）对Thr14和Tyr15进行去磷酸化，从而激活Cdk1/周期蛋白B复合物的激酶活性，并触发有丝分裂的启动12,14,18,20,22,23。Thr161位点的磷酸化也是Cdk1/周期蛋白B激活所必需的，该过程由Cdk7（Cdk激活激酶，CAK）介导18。在后期，周期蛋白B的降解使Cdk1失活，从而允许细胞退出有丝分裂24,25。因此，Cdk1/周期蛋白B的激活是一个复杂的过程。本文所介绍的实验方案使用的是 commercially available Cdk1/周期蛋白B。在昆虫细胞中进行该复合物的重组表达时，其可在体内被内源性激酶激活in vivo14,20，并在纯化后仍保持活性。所获得的具有活性的重组人源Cdk1/周期蛋白B适用于体外激酶活性检测 in vitro kinase assays。
本文描述了一种用于鉴定人着丝粒蛋白F（CENP-F）中Cdk1特异性磷酸化位点的实验方案。10CENP-F 是一种着丝粒蛋白，在间期的大部分时间（G1 期和 S 期）位于细胞核内，并在 G2 期被转运至细胞质26,27,28 以Cdk1依赖性的方式10,11核定位由一个两部分组成的cNLS赋予26cNLS 由核转运因子 importin α 识别，在 importin β 和 RanGDP 的协同作用下，介导 cNLS 货物蛋白进入细胞核29G2期的核输出通过一种未知的输出途径实现10一旦CENP-F定位于细胞质中，它会被招募至核膜，并进而招募马达蛋白复合物动力蛋白（dynein）。30,31该通路以动力蛋白依赖的方式在有丝分裂纺锤体组装初期调控细胞核相对于中心体的位置，这对于有丝分裂进入的正确时序以及脑发育中的一个基本过程具有重要意义30,31,32从G2期开始，CENP-F也会组装到动粒中，在染色体的准确分离过程中发挥重要作用27,28,33,34,35这些通路的一个关键调控步骤是CENP-F在G2期依赖Cdk1的核输出10,11我们在此描述了一种用于鉴定CENP-F蛋白cNLS区域中Cdk1特异性磷酸化位点的实验方案。这些位点的磷酸化模拟突变会减缓CENP-F的核输入，表明Cdk1/细胞周期蛋白B通过磷酸化CENP-F的cNLS直接调控其细胞内定位。10.
总体而言，这 体外 激酶实验可用于鉴定激酶Cdk1的特异性底物。纯化的靶蛋白被磷酸化 体外 通过市售的Cdk1/细胞周期蛋白B复合物进行磷酸化，随后通过质谱法鉴定磷酸化位点。Cdk1特异性磷酸化位点的鉴定有助于揭示Cdk1调控细胞周期的分子机制。

<table><tbody><tr><td>2800 mL 带挡板的 Fernbach 培养瓶</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>盐酸苄脒</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶过滤器</td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/细胞周期蛋白 B 重组蛋白，人源，20,000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/细胞周期蛋白 B（替代来源）</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/细胞周期蛋白 B（替代来源）</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/细胞周期蛋白 B + 10× PK 缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F（残基 2987 &amp;ndash; 3065）pGEX6P1 质粒</td><td>可应要求提供。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机：Heraeus Multifuge X3R，带制冷功能，配备 TX-1000 摆动转子</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>离心过滤装置：Amicon Ultra-15 离心过滤管，截留分子量 3 kDa，Ultracel-PL 膜</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L-甲硫氨酸</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td>125650010</td><td></td></tr><tr><td>一次性脱盐移液枪头：Zip tips</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>一次性层析柱，Econo-Pac 1.5 × 12 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Rosetta 2(DE3)pLysS 菌株</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>电喷雾电离傅里叶变换离子</td><td>Bruker Amazon</td><td>Apex III</td><td></td></tr><tr><td>回旋共振质谱仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电喷雾电离离子阱质谱仪</td><td>Bruker Amazon</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>固定角转子：Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>FPLC 系统：&amp;Auml;kta Pure FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>凝胶过滤柱：Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽琼脂糖</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>还原型谷胱甘肽</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>培养摇床：Multitron 摇床</td><td>Infors</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>异丙基 &amp;beta;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>karyopherin &amp;alpha; pet-28a pres 质粒</td><td>可应要求提供。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（Luria Bertani 培养基）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机 5418R，带制冷功能</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（0.5 mL）</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL）</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>镍亲和凝胶：His-Select 镍亲和凝胶</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 质粒</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS 蛋白酶：PreScission 蛋白酶</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Phos-tag 丙烯酰胺</td><td>Wako Pure Chem. Ind.</td><td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>还原型谷胱甘肽</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>圆底离心管（Oakridge 管）</td><td>Fisher Scientific</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>定点突变试剂盒：QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>定点突变试剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪：Branson S-250D 超声破碎仪</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC 透析膜（截留分子量 6–8 kDa）</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>摆动转子 TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

通过特异性鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1的磷酸化位点 体外 激酶活性检测

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cdk1）是所有真核生物细胞周期的主要调控因子，可磷酸化约8%至13%的蛋白质组；然而，目前鉴定出的Cdk1靶点数量仍然较少，尤其是在人类细胞中。鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点具有重要意义，因为这些位点能够提供关于Cdk1如何调控细胞周期的机制性见解。细胞周期的调控对于染色体的准确分离至关重要，这一复杂过程中的缺陷会导致染色体异常和癌症。
此处，我们描述一种 体外 用于鉴定Cdk1特异性磷酸化位点的激酶实验。在该实验中，纯化的蛋白质被磷酸化 体外 通过市售的人源Cdk1/细胞周期蛋白B进行磷酸化。磷酸化成功与否通过SDS-PAGE确认，随后通过质谱鉴定磷酸化位点。我们还描述了可获得高纯度且均一的蛋白样品的纯化方案，适用于激酶活性检测；并介绍了用于功能验证所鉴定磷酸化位点的结合实验，该实验检测经典核定位信号（cNLS）与其核转运受体karyopherin α之间的相互作用。为辅助实验设计，我们综述了从蛋白质序列预测Cdk1特异性磷酸化位点的方法。这些方案共同构成了一种强有力的方法，可鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点，并推动对Cdk1如何调控细胞周期的机制研究。由于该方法依赖于纯化的蛋白质，因此可应用于任何模式生物，尤其与细胞功能研究相结合时，能够获得可靠的结果。

我们最近使用了一种 体外 激酶活性检测图1) 以鉴定含有经典核定位信号（cNLS）的 CENP-F 片段中 Cdk1 特异性的磷酸化位点10该信号在大部分间期过程中介导CENP-F的核内定位。在G2期，CENP-F以Cdk1依赖的方式从细胞核转运至细胞质。为了深入理解Cdk1调控CENP-F细胞定位的分子机制，我们利用iGPS服务器分析了CENP-F的序列，以预测Cdk1特异性的磷酸化位点36,37在CENP-F的cNLS区域内，预测存在三个Cdk1特异性的磷酸化位点，分别位于第3,042、3,045和3,048位氨基酸残基表1）。还预测到另一个Cdk1特异性磷酸化位点位于第3,007位残基（表1)10因此，我们推测C...

细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cdk1）在细胞周期的G2期被激活，并调控多种细胞通路。本文介绍了一种 体外 使用Cdk1进行激酶活性检测，可鉴定Cdk1特异性的磷酸化位点，从而确定该重要激酶的细胞内作用靶点。

细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cdk1）是所有真核生物细胞周期的主要调控因子，可磷酸化约8%至13%的蛋白质组；

本体外激酶实验的总体目标是鉴定目的蛋白中特异性由细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1）介导的磷酸化位点。鉴定CDK1特异性的磷酸化位点至关重要，因为这些位点可提供关于CDK1如何调控细胞周期的机制性见解。细胞周期的调控对于完整的染色体分离至关重要，其缺陷会导致染色体异常并引发癌症。该技术的主要优势在于其依赖于纯化的蛋白质，因此可应用于任何模式生物，并产生可靠的结果，尤其是与细胞内的功能研究相结合时。该方法具有重要意义，因为尽管CDK1可磷酸化约8%至13%的蛋白质组，目前已知的CDK1靶点数量仍然较少。尽管该方法用于鉴定CDK1特异性的磷酸化位点，但只要获得纯化的激酶，该方法也可经修改后用于鉴定其他激酶的磷酸化位点。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为激酶反应的条件需要针对每个靶蛋白进行优化，以获得高效的磷酸化效率。理想情况下，磷酸化效率应达到100%。使用IGPS 3.0软件并访问其网络服务器，以预测CENP-F靶蛋白序列中CDK1特异性的磷酸化位点。将预测出的磷酸化位点与CDK1的共识序列进行比对验证。通过制备预培养物开始蛋白表达。根据制造商说明书，将一微升表达质粒转入五十微升大肠杆菌感受态细胞中。加入质粒后，将细胞置于冰上孵育三十分钟。然后将细胞在 42 摄氏度下孵育 45 秒。孵育结束后，将细胞置于冰上 1 分钟，然后向细胞中加入 400 µL LB 培养基，随后在 37 摄氏度下振荡培养 1 小时。然后取 200 µL 培养物接种至含有相应抗生素的 LB 琼脂平板上，具体抗生素种类根据构建质粒而定。接下来，将平板在37摄氏度下孵育12至20小时，期间不进行振荡。然后从LB琼脂平板上挑取一个菌落，将其接种于50毫升含有所需抗生素组合的LB培养基中。将培养物在37摄氏度下以每分钟160至180转的速度振荡培养12至20小时。每升 LB 培养基中加入抗生素和 10 毫升 40%（质量/体积）的无菌过滤葡萄糖溶液。向该培养基中加入 20 毫升高密度预培养菌液，然后在 37 °C、160 至 180 转/分钟振荡条件下培养。定期检测培养物在 600 纳米处的吸光度。当吸光度达到 0.5 至 0.6 时，加入 0.2 毫摩尔的 IPTG 以诱导蛋白表达。随后将培养物在 37 摄氏度下振荡培养三小时。离心收集细胞：将培养物在4℃条件下以4,100 × g离心15分钟（使用水平转子），离心结束后弃去上清液。每升培养物用20毫升GST结合缓冲液重悬CENP-F的细胞沉淀，或用20毫升his六结合缓冲液重悬karyopherin alpha的细胞沉淀。然后将细胞储存在负80摄氏度。为纯化CENP-F，首先解冻含有CENP-F质粒的细胞，然后用GST结合缓冲液将体积调至20毫升。调整体积后，依次加入所有还原剂和蛋白酶抑制

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