艰难梭菌(p) pppp 合成酶的纯化及体外活性测定

本文介绍了一种纯化带组氨酸标记的热释蛋白酶的方法, 并利用放射性标记底物和产物的薄层色谱法测定了体外的酶活性。酶活性测定广泛适用于任何激酶、核苷酸循环酶或磷转移反应, 其机理包括三磷酸核苷酸水解。

此方法可以帮助回答有关磷转移酶的关键问题，包括酶基质特异性和反应动力学。该技术的主要优点是，它允许快速收集多个数据集，这些数据集非常一致，从而能够对酶活性进行统计上可靠的定量。这种方法的视觉演示至关重要，因为发现TLC板块上的反应和量化反应中的放射性物种比解释要容易得多。

除了阿莎，演示程序将是亚洲普德尔，另一个研究生从我的实验室。开始这个协议与可读过度表达组蛋白标记的蛋白质，如文本协议中所述。在重力柱中准备一毫升镍硝酸树脂以净化蛋白质。

使用前一天，在四摄氏度下用两毫升的平衡缓冲液将柱子在四摄氏度下过夜。第二天，在装载澄清的 lysate 之前，将柱子从 4 摄氏度带到室温，并让它站立大约两到三个小时。然后在解液缓冲液中重新填充颗粒。

在冰上对细胞进行10次10秒的间隔，在脉冲之间暂停30秒。使用微离心在4摄氏度下以3080倍g的离心法澄清酸盐，在4摄氏度下30分钟。用等量的解解缓冲液准备澄清的解解液，然后将预制的、澄清的解解体应用到列中并收集流经。

重新应用已澄清的 lysate 流到列并收集辅助流。然后用五毫升的洗涤缓冲液洗涤柱，然后收集流经。再次用五毫升的洗涤缓冲液 2 洗涤柱重新清洗柱，然后收集流经。

现在应用两毫升的洗脱缓冲液。以两个分数收集流经，每个分数为一毫升。在蛋白质纯化过程中，将氯化镁加入纯化缓冲液（对制造商协议）的修改对于酶活性至关重要。

要通过SDS-PAGE对蛋白质纯化进行定性评估，在4%堆叠上运行所有柱分数的20微升等分，10%运行聚丙烯酰胺凝胶，在170伏特下运行60分钟。在室温下用 0.1% 的 Coomassie 蓝色染色凝胶 5 小时，在台式摇杆上轻轻摇动。然后在室温下将凝胶在40%甲醇-10%的冰川醋酸中过夜，在台面摇杆上摇动。

使用一毫升透析装置，在4摄氏度下过夜，用20千多顿分子量截止，将洗洗的分数2对透析缓冲液以200:1的比例进行透析。通过测量280纳米的吸光度并使用计算的摩尔消光系数，确定透析蛋白样品的浓度。将透析蛋白样品的100微升等分储存在零下80摄氏度，直到使用。

在执行反应之前，通过用去离子水清洗来准备PEI纤维素薄层色谱板。将板放在玻璃室中，用双蒸馏水，深度约为 0.5 厘米。让水迁移到盘子顶部后，将板从玻璃室中拿出来，放在台式机架上晾干过夜。

用一支软铅笔将干板从一边标记两厘米，以指示样品将应用于 TLC 的地点。对于双微升样品，请将样品分开不少于一厘米。规划实验时，始终在每个板上保留一个未使用的点，作为样品定量的空白通道。

要进行酶活性测定，请使用伽马P32 ATP准备单个反应，如文本协议中所述。在其他成分混合后添加 RSH，因为将 RSH 添加到含核苷酸的混合中将启动酶活性测定。为了控制ATP水解对污染核酸酶活性的影响，组装一种不含蛋白质的10微升反应，并同时孵育。

在 T 等于零和实验结束时发现两微升样品，以确保 ATP 在缺乏蛋白质的情况下不会水解。添加 RSH 后，立即取出两个微升，并将其点到标有的 PEI 纤维素板上，因为 T 等于零分钟样品。在37摄氏度下孵育反应，在所需时间点去除两微升等分。

收集所有等分，在色谱室中填充1.5摩尔单基磷酸钾，以0.5厘米的深度进行薄层色谱。将板的下边缘浸入溶剂中，让溶剂在大约 90 分钟内迁移到板的顶部。从色谱罐中卸下板，放在台式干燥架上，通宵晾干。

板材干燥后，用塑料薄膜包裹板，避免放射性物质转移到成像盒中，并通过自摄影进行分析。在室温下暴露含有对磷基盒分离反应的PEI纤维素板4小时。曝光后，在荧光粉图像上成像盒式磁带。

使用具有图形用户界面的成像软件，首先选择"绘制矩形"来绘制感兴趣的区域或 ROIS，然后使用鼠标在一条整条车道周围绘制矩形 PI，以及该车道中包含的 ATP 和瓜诺辛四磷酸盐点。使用"选择、复制和粘贴"命令在其他通道中绘制相同的 PI，以确保 RO 在每个通道中的相同区域内测量信号。包括未使用的车道中用作空白的 PI。

使用分析、工具、ROI 管理器、添加成像软件的命令，选择 PEI 纤维素板上绘制的所有 ROI。现在使用"分析、设置测量"命令量化每个 ROI 中的信号强度，并导出测量值作为点差。在电子表格中，从实验信号中减去空白 ROI 值。

将数据转换为瓜诺辛-四磷酸盐合成百分比至关重要，因为它可确保不同日期收集的具有不同批次蛋白质或不同伽马 P32 ATP 的数据集是一致的，并且可以汇集以进行统计严谨。这幅漫画演示了如何使用感兴趣的区域来定义包含样品中总放射性信号的车道，以及感兴趣的元素放射性 ATP 和瓜诺辛四磷酸盐区域。ATP 和瓜诺辛四磷酸盐信号被规范化为总信号，而不是报告绝对值，因为放射性基质的移液误差或衰变会影响样品中的总信号，但不影响酶活性。

此处显示的是使用纯化 C.diffile RSH 进行的反应的实际 TLC 板。不含蛋白质的控制反应允许定量未分层的ATP水解，而空白通道允许精确的信号定量。在ATP和瓜诺辛-四磷酸盐点中，该酶将放射性磷酸盐从ATP基质转移到GDP前体，产生放射性瓜诺辛四磷酸盐。

这证实，从C.difficile的假设瓜诺辛四磷酸盐合成是一种活性酶。通过每隔一段时间对反应进行采样，可以观察到进展。在这里，在每个时间点都观察到原始信号。

ATP 正在减少，瓜诺辛四磷酸盐正在增加。此处显示的是规范化数据。错误条要小得多，因为规范化导致任何移液错误。

尝试此程序时，必须小心不要刮伤 TLC 板上的树脂，因为这可能干扰溶剂迁移。这是一种非常易访问的技术，具有直接的数据分析，可以快速提供强大的酶活性定量。我们已经用它来证实，梭菌化合物瓜诺辛四磷酸盐，这是从来没有报道过。

不要忘记，使用放射性操作可能极其危险，在执行此过程时，您必须遵守机构关于放射性物质的存储和使用的规则。该方法可以提供对瓜诺辛四磷酸盐合成的洞察，但它也可以应用于其他磷转移反应，包括蛋白质激酶活性和环状二甘酸酯合成。