一种纯化与 体外 一种(p)ppGpp合成酶的活性检测 艰难梭菌

该方法有助于回答有关磷酸转移酶的关键问题，包括酶的底物特异性和反应动力学。该技术的主要优势在于能够快速收集多组高度一致的数据，从而实现对酶活性的统计学上稳健的定量分析。对该方法进行可视化演示至关重要，因为将反应样品点样到薄层色谱板上，并对反应中的放射性物质进行定量，其操作过程远比文字描述更易于通过视觉展示来理解。

除了Astha之外，本实验步骤还将由我实验室的另一位研究生Asia Poudel进行演示。按照文字版实验方案所述，首先开始诱导表达带有组氨酸标签的蛋白。在重力柱中准备一毫升镍-硝基三乙酸树脂，用于纯化该蛋白。

使用前一天，将层析柱用两毫升平衡缓冲液在4°C下平衡过夜。次日，在上样澄清裂解液前，将层析柱从4°C转移至室温，静置约两到三小时。然后用裂解缓冲液重悬沉淀。

将细胞置于冰上进行超声处理，每次10秒，共10次，每次超声间隔30秒。使用微量离心机在4°C、3,080 × g条件下离心30分钟，澄清裂解液。用等体积的裂解缓冲液稀释澄清后的裂解液，然后将制备好的澄清裂解液上样至层析柱中，并收集穿流液。

将澄清的裂解物流出液重新加入柱中，收集第二次流出液。然后用5 mL洗涤缓冲液一洗涤柱子，收集流出液。再用5 mL洗涤缓冲液二再次洗涤柱子，收集流出液。

现在加入两毫升洗脱缓冲液。收集流出液，每份一毫升，共两份。在蛋白质纯化过程中，纯化缓冲液中加入氯化镁（对生产商方案的修改）对酶活性至关重要。

为通过 SDS-PAGE 定性评估蛋白质纯化效果，取所有层析柱组分各 20 微升，在 4% 浓缩胶、10% 分离胶的聚丙烯酰胺凝胶上以 170 伏电压电泳 60 分钟。将凝胶置于室温下，用含 0.1% 考马斯亮蓝的染色液轻柔振荡染色 5 小时。随后在室温下用含 40% 甲醇和 10% 冰乙酸的脱色液振荡脱色过夜。

将洗脱组分使用截留分子量为20千道尔顿的1毫升透析装置，在4摄氏度下以200:1的比例与透析缓冲液进行两次透析，每次过夜。通过在280纳米处测量吸光度并结合计算得到的摩尔消光系数，确定透析后蛋白质样品的浓度。将透析后的蛋白质样品以100微升分装，于-80摄氏度保存，直至使用。

在进行反应之前，通过将PEI纤维素薄层色谱板用去离子水清洗来制备。将板放入玻璃展开槽中，加入约0.5厘米深的重蒸水。待水迁移至板的顶端后，将板从玻璃展开槽中取出，并置于实验台架上过夜晾干。

用软铅笔在干燥的薄层板一端距边缘两厘米处做标记，以指示薄层色谱（TLC）点样位置。对于2微升的样品，点样点之间的间距应不少于一厘米。设计实验时，应始终在每块薄层板上预留一个未使用的点样位置，作为样品定量时的空白对照条带。

为了进行酶活性测定，按照文本方案使用γ-P32标记的ATP配制各个独立反应。在其他组分混合后再加入RSH，因为将RSH加入含有核苷酸的混合物会启动酶活性测定。为控制核酸酶污染导致的ATP水解，需同时组装一个不含蛋白质的10微升反应体系，并平行孵育。

在反应时间为零（T=0）以及实验结束时，分别点样2微升样品，以确保在无蛋白质存在的情况下ATP未发生水解。加入RSH后立即取出2微升样品，点样至已标记的PEI-纤维素板上，作为T=0分钟的样品。将反应体系在37°C下孵育，并在预定的时间点分别取出2微升等分试样。

收集完所有等分试样后，将层析缸中加入1.5摩尔的磷酸二氢钾溶液，液面深度达0.5厘米，进行薄层层析。将板的底边浸入溶剂中，使溶剂在约90分钟内迁移至板的顶端。将板从层析槽中取出，置于实验台干燥架上，室温下晾干过夜。

平板干燥后，用塑料膜包裹平板，以防止放射性物质转移到成像暗盒中，然后进行放射自显影分析。将含有分离反应产物的PEI-纤维素平板在室温下暴露于磷屏成像仪暗盒中4小时。曝光结束后，使用磷屏成像仪对暗盒进行成像。

使用具有图形用户界面的成像软件，首先选择“绘制矩形”，然后用鼠标围绕整条泳道以及该泳道内的ATP和四磷酸鸟苷斑点绘制矩形感兴趣区域（ROI）。利用“选择”、“复制”和“粘贴”命令，在其他泳道中绘制相同的ROI，以确保各泳道中ROI测量的是相同区域内的信号。包含一个未使用泳道的ROI作为空白对照。

使用成像软件的“分析”、“工具”、“感兴趣区域（ROI）管理器”、“添加”命令，选中绘制在PEI-纤维素板上的所有感兴趣区域（ROI）。然后使用“分析”、“设置测量值”、“测量”命令，量化每个感兴趣区域内的信号强度，并将测量结果导出为电子表格。在电子表格中，从实验信号中减去空白ROI的数值。

将数据转换为合成的鸟苷四磷酸百分比至关重要，因为这可以确保在不同日期、使用不同批次的蛋白质或不同批次的γ-P32 ATP所收集的数据集具有一致性，从而能够合并进行统计学分析。该示意图展示了如何利用感兴趣区域来定义一个条带，该条带包含样品中的总放射性信号，以及ATP和鸟苷四磷酸各自的放射性信号感兴趣区域。ATP和鸟苷四磷酸信号以总信号为基准进行归一化处理，而非报告其绝对值，因为加样误差或放射性底物的衰变可能影响样品中的总信号，但并不影响酶活性。

此处展示的是一块真实的薄层色谱（TLC）板，用于检测使用纯化的艰难梭菌 RSH 蛋白进行的反应。不含蛋白质的对照反应可用于量化非催化条件下的 ATP 水解，而空白泳道则有助于准确量化信号。在 ATP 和四磷酸鸟苷斑点中，该酶将放射性磷酸基团从 ATP 底物转移至 GDP 前体，生成具有放射性的四磷酸鸟苷。

这证实了来自艰难梭菌的假定鸟苷四磷酸合酶是一种具有活性的酶。通过在不同时间点取样反应，可以观察其反应进程。此处观察的是每个时间点的原始信号。

ATP 正在减少，而四磷酸鸟苷正在增加。此处显示的是归一化后的数据。由于归一化消除了移液误差，误差线明显更小。

在进行该操作时，需注意避免刮伤薄层色谱板上的固定相，因为这会干扰溶剂的迁移。该技术易于实施，数据分析简单，可快速实现对酶活性的可靠定量。我们已利用该方法证实艰难梭菌能够合成四磷酸鸟苷，此结果此前从未见报道。

请注意，操作放射性物质可能具有极高危险性，在进行本实验时，必须严格遵守所在机构关于放射性物质储存和使用的相关规定。该方法可用于研究四磷酸鸟苷的合成，也可应用于其他磷酸转移反应，包括蛋白激酶活性和环状二鸟苷酸的合成。