T淋巴细胞有丝分裂原诱导芽生的快速定量辨识免疫调节药物

该程序的总体目标是通过测量 T 淋巴细胞胚芽生成或原始细胞转化，使用自动细胞计数器评估免疫调节药物的效力。该检测提供了一种使用配备测量细胞直径的自动细胞计数仪定量 T 淋巴细胞活化的快速方法。与常见的 T 淋巴细胞增殖测定不同，该技术的主要优点是它允许对单个细胞进行快速、简单和直接的测量。

用免疫调节药物治疗淋巴细胞会增加或减少细胞胚芽细胞生成的速率和程度。使用细胞计数仪检测，每个样品可在大约 4 分钟内测量这种芽细胞生成的范围。在牺牲后十分钟内，用 70% 乙醇喷洒小鼠的腹部，然后用剪刀在动物左侧的皮毛和皮肤上切开。

将皮肤分开并向后拉开，露出腹膜。然后将 4% 的洗必泰涂抹在切口部位。使用第二组剪刀和镊子，沿着中央腹部切开 2 到 3 厘米，以打开腹膜。

然后，去除脾脏周围的内脏附着物和多余的脂肪，并将组织转移到 DPBS 容器中。接下来，将 10 毫升完整的 RPMI 1640 培养基加入 10 厘米的培养皿中，并在两个灭菌的磨砂玻璃载玻片之间压碎脾脏。通过无菌 40 微米尼龙细胞过滤器将组织浆液过滤到新的 10 厘米培养皿中，以去除结缔组织和碎片，并将单细胞悬液转移到 50 毫升锥形管中进行离心。

沉淀重悬于 20 mL 红细胞裂解缓冲液中。在室温下轻轻摇动 10 分钟后，再次离心收集细胞，并将沉淀重悬于 10 mL 新鲜培养基中。然后再次离心细胞，重悬于 2 毫升 37 摄氏度完全培养基中。

要纯化 T 细胞，首先用 5 毫升完全 RPMI 洗涤每个脾脏 1 到 2 根尼龙棉柱两次，然后将柱放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的细胞培养箱中 1 小时。孵育结束时，将 2 mL 分离的脾细胞悬液加载到每根柱的顶部，让细胞通过柱，直到液体到达羊毛的顶部。接下来，向柱顶部添加 2 毫升新鲜的 37 摄氏度完全培养基，让培养基通过尼龙棉，直到柱顶部的液体到达羊毛顶部。

现在用 3 毫升 37 摄氏度完全培养基覆盖羊毛，并将柱放回细胞培养箱中，使所有 B 细胞、成纤维细胞和辅助细胞粘附在羊毛纤维上。一小时后，在新的 50 mL 锥形管中，用 5 mL 新鲜完全培养基洗涤色谱柱 2 次，以洗脱非贴壁 T 细胞。然后通过离心收集细胞。

用 10 mL 完全培养基洗涤 T 细胞 1 次后，将沉淀重悬于 2 mL 新鲜完全培养基中。然后对细胞进行计数，并在新鲜的完全培养基中将悬浮液稀释至 0.5 倍 10 至每毫升 6 个细胞的浓度，以接种到实验合适的 6 孔或 24 孔细胞培养板中。在分离后 24 小时内，用适当的刺激和感兴趣的实验药物激活尼龙棉柱分离的 T 细胞。

12 至 72 小时后，使用 1 毫升移液器轻轻混合活化的处理细胞，以去除任何团块。要使用自动细胞计数仪测量细胞直径，请将每个孔中处理过的细胞 1 毫升转移到单独的样品杯中，然后将样品杯放入自动细胞计数仪的样品转盘中。输入样品 ID 和细胞类型信息以记录样品并开始运行样品。

将台盼蓝与细胞悬液混合后，将细胞通过成像场，直到从每个样品中收集到约 100 张细胞图像。软件在每个检测到的台盼蓝染色和未染色细胞周围画一个圆圈，以确定细胞直径。测量完所有细胞后，数据将导出到电子表格中，该电子表格将结果显示为每个测量直径的总细胞计数和活细胞计数。

然后，可以将数据显示为直方图。用 PMA 和离子霉素刺激两天后，观察到频率分布的中位数向更大的细胞直径显着转变，直径较小的 T 细胞的数量相应地减少。在固定的 250 纳摩尔离子霉素浓度下，通过将激活刺激的浓度从 2 纳克/毫升提高到 250 纳克/毫升，PMA 效应不会显着改变。

观察到的 T 细胞增殖也没有明显的差异。钙调磷酸酶抑制剂药物部分抑制 T 细胞胚芽生成和增殖。使用靶向活化 T 细胞的钙调磷酸酶核因子的免疫抑制化合物进行 T 细胞处理，可抑制近 72% 的胚生反应。

雷帕霉素和 FTY720 对胚芽生成表现出中等但统计学显着的影响。而 TRAM34 显然不会影响小鼠 T 细胞增殖，即使在 700 纳摩尔浓度下也是如此。当雷帕霉素和环孢菌素 A 一起使用时，胚层生成被完全抑制。

在用抗 CD3 和抗 CD28 偶联磁珠激活的小鼠 T 细胞中观察到类似的结果。该测定可用于成功量化各种免疫调节药物的作用，与典型的增殖测定相比，可以更好地评估药物效力，典型的增殖测定还包括来自凋亡和坏死细胞的贡献。使用这种方法，可以测量多达 15 个样品，从而可以同时和随后定量囊胚生成和增殖速率。

有时气泡会进入流通池，使测量无法使用，因此在接受每次试验的数据进行分析之前，应检查所有图像是否有气泡。该程序的一个局限性是，如果样品中的碎片过多，测量可能会将这些碎片视为活细胞。通过适当的修改，该测定有可能适用于研究中性粒细胞和肝细胞的细胞大小变化。