Name: T淋巴细胞有丝分裂原诱导芽生的快速定量辨识免疫调节药物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 了解利用自动化细胞计数器快速定量T淋巴细胞有丝分裂原诱导芽生的方法。该技术可在约四分钟内测量细胞直径变化，准确评估免疫调节药物对T细胞活化的效力，为免疫学和药理学研究提供高效工具。

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感谢Lucile Wrenshall提供酶标仪的使用，感谢Nancy Bigley提供的有益讨论，以及感谢Tom Brown惠赠ICR小鼠。本研究由美国国家过敏与传染病研究所资助项目1R01AI114804及WSU教师发展基金（资助J.A.K.）资助。J.N.G.部分受美国国家普通医学科学研究所资助项目R25GM090122支持。

所有实验均按照怀特州立大学实验动物护理和使用委员会及机构审查委员会批准的方案进行。

注意：人外周血单个核细胞（PBMC）通过Ficoll密度梯度离心法分离5。
1. 脾脏采集
<ol>
	<li>在符合该物种特定需求的饲料、饮水和垫料条件下，将成年雌性ICR小鼠饲养于标准实验室环境中。 
	注：动物在安乐死时的平均年龄为 2.9 个月，平均体重为 30.4 g。</li>
	<li>在分离当天（DOI），单独处死实验动物，确保无其他同种动物在场。应尽一切努力减少小鼠的应激反应。使用 CO2 通过二次颈椎脱位确保死亡。
	<ol>
		<li>将仍置于转运笼中的动物放入 CO2 腔室并以 5 L/min 的流速开始通气。该流速可按推荐的每分钟 10-30% 置换氧气。</li>
		<li>动物失去意识后，提高 CO2 将流速调至15 L/min。观察动物呼吸是否停止，并在舱内再保留2分钟。</li>
		<li>采用颈椎脱位法并施加牵拉力以确保动物死亡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在动物死亡后10分钟内，采用无菌技术取其脾脏。
	<ol>
		<li>在使用前，将两套用于脾脏摘除的剪刀和镊子放入高压灭菌器中进行灭菌。用70%乙醇擦拭解剖台面以进行消毒。</li>
		<li>用70%乙醇擦拭小鼠腹部。使用一套剪刀和镊子，从腹部左侧开始沿体侧剪开毛发和皮肤，然后将皮肤向两侧拉开并翻卷，暴露腹膜。暴露后，在打开腹膜前应用4%氯己定溶液处理。</li>
		<li>使用第二把剪刀和镊子，沿腹部中央做一条2至3厘米的切口。打开腹膜，剪除内脏附着物和多余脂肪后取出脾脏。将脾脏置于杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 原代脾细胞的制备
注意：所有步骤均须在层流生物安全柜中进行，并采用无菌技术操作。
<ol>
	<li>将收获的脾脏置于10 cm培养皿中，用10 ml去离子无菌H2O浸泡5分钟，以裂解表面红细胞。 
	注意：若脾脏在分离过程中受损，可省略此步骤。</li>
	<li>为释放脾细胞，将脾脏置于一对无菌玻璃载玻片之间（磨砂面朝向脾脏），在新的10 cm培养皿上轻轻碾压。加入10 ml含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、50 IU/ml青霉素和50 µg/ml链霉素的RPMI-1640培养基（下文简称完全RPMI）混匀。</li>
	<li>将细胞悬液通过无菌40 µm尼龙细胞滤器过滤至新的10 cm培养皿中，以去除结缔组织和碎片。</li>
	<li>加入20 ml由155 mM NH4Cl、10 mM NaHCO3和0.1 mM EDTA组成、pH 7.4、渗透压约300 mOsm/L的红细胞裂解缓冲液，裂解残留红细胞。 
	注意：渗透压通过冰点或蒸气压渗透压计测定。
	<ol>
		<li>将细胞从10 cm培养皿转移至50 ml圆底离心管中，在250 x g离心10分钟（4 °C）。</li>
		<li>弃上清，加入20 ml红细胞裂解缓冲液，用移液器重悬细胞沉淀。</li>
		<li>室温下轻柔摇动孵育10分钟。</li>
		<li>在250 x g离心10分钟（4 °C）以收集细胞，倾去裂解缓冲液。</li>
		<li>用10 ml完全RPMI重悬细胞，再次离心（250 x g，10分钟，4 °C），弃上清。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将脾细胞重悬于2 ml预热至37 °C的完全RPMI中，用于后续转移至尼龙毛纤维柱。</li>
</ol>
3. T 淋巴细胞的纯化
<ol>
	<li>用5 ml完全RPMI培养基洗涤尼龙毛柱两次。孵育于 37 °C 在5% CO₂环境中2 细胞培养箱中孵育1小时。 
	注意：实验过程中必须始终保持尼龙毛湿润，并使用预热至37°C的完全RPMI培养基 37 °C 所有尼龙毛分离步骤。</li>
	<li>将分离的脾细胞加入尼龙毛柱中，孵育1小时，使B细胞、成纤维细胞及辅助细胞黏附于尼龙毛上。
	<ol>
		<li>将含有脾细胞的2 ml RPMI加入柱中，流经柱体直至达到尼龙棉顶部。</li>
		<li>加入 2 ml 预热至适宜温度的完全 RPMI 培养基 37 °C 在尼龙毛顶部加入培养基，并使培养基穿过尼龙毛，直至液面达到尼龙毛的顶部表面。</li>
		<li>向柱中加入 3 ml 温热的完全 RPMI 培养基，以完全浸没尼龙棉。</li>
		<li>将装填好的层析柱静置孵育 37 °C，5% CO₂2 细胞培养箱中孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用5 ml完全RPMI培养基洗涤柱子两次以洗脱细胞。通过离心对洗脱的细胞进行额外洗涤。
	<ol>
		<li>用完全RPMI培养基将柱子加满至顶部2次，并让溶液流过柱子进入一个50 ml无菌锥形管中。 
		注意：避免触碰或碰撞层析柱，以免震落附着在尼龙棉上的B细胞、辅助细胞和成纤维细胞。</li>
		<li>收集流穿组分，于 250 × g 离心 10 分钟（4 °C)以沉淀细胞。用10 ml完全RPMI洗涤一次。再次离心沉淀细胞（250 × g，10 min， 4 °C）并重悬于 2 ml 完全 RPMI 培养基中。</li>
		<li>使用血细胞计数板测定细胞密度，并用完全RPMI培养基稀释至0.5 x 10⁶ cells/mL。6 cells/ml</li>
		<li>将1或2 ml细胞悬液分别接种至24孔或6孔细胞培养板的每个孔中，并将细胞在 37 °C 含5% CO2. 
		注意：在此阶段，可向每个孔中加入 1 mM 1,4-二硫苏糖醇（DTT）以提高 T 细胞存活率。</li>
		<li>可选：通过流式细胞术确认分离方案的效率。该方案通常可获得约80%的T淋巴细胞23. 
		注意：尼龙毛纯化的细胞中约含有 50% 的 CD4+ 和 23% CD8+ 细胞。为进一步纯化CD4+和CD8+亚群，可使用八种抗体和磁珠进行一步免疫磁珠耗竭法24. 或者，可获得纯度更高的CD4+ 和 CD8+ T细胞群可通过特异性抗体的阳性或阴性筛选进行分离。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. T 淋巴细胞的激活及实验药物处理
<ol>
	<li>在分离后24小时内，通过添加佛波酯（PMA）和离子霉素钙盐，或添加包被抗CD3和抗CD28抗体的磁珠来激活T淋巴细胞23,25,26。在激活时加入实验药物（例如，CsA、FK506、雷帕霉素、TRAM-34和FTY720）。 
	注意：此处PMA浓度范围为2至250 ng/ml，离子霉素浓度保持在250 nM。若可能，应从每种药物的储备液中进行稀释，以确保加入每孔细胞的体积≥1 µl，从而保证实验可重复性。抗CD3/抗CD28包被的磁珠按磁珠与细胞1:1的比例加入。增加每个细胞对应的磁珠数量（即，磁珠与细胞的比例）可增强刺激强度25,26。磁珠在加入细胞前需用完全RPMI培养基洗涤并重悬。请注意，台盼蓝可对磁珠染色。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养12–72小时，随后使用自动细胞计数仪进行分析。</li>
</ol>
5. 自动细胞计数器数据采集
<ol>
	<li>在上样前，需用移液管轻柔混匀细胞，以避免形成团块。这一点对于活化的淋巴细胞尤为重要，因其黏附性增强。
	<ol>
		<li>对于使用抗CD3/CD28磁珠活化的细胞培养物，移液后将样品转移至1.5 ml或2 ml离心管中。将离心管置于磁铁上1-2分钟，使磁珠分离。取含有细胞的上清液用于后续分析。 
		注意：应在1小时内完成静息细胞和活化细胞的分析，以排除培养基中血清可能导致静息细胞预先活化的影响。经PMA/离子霉素刺激12小时后，可检测到细胞体积轻微增大（图2）。在72小时时，与48小时相比未观察到细胞大小的显著增加（数据未显示）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将1 ml细胞悬液转移至样品杯中，并按照仪器说明书操作，使用自动细胞计数仪进行检测。 
	注意：每次实验应至少使用1 ml（最多2 ml）细胞培养物。自动细胞计数仪通过注射器将台盼蓝与细胞悬液混合，随后将细胞-台盼蓝混合液流经成像区域，由软件进行图像采集与分析。软件识别被台盼蓝染色的细胞，为每个细胞绘制圆形轮廓并测定其直径。每份样品采集100张图像，用于确定细胞活力和细胞大小。本实验所用细胞计数仪的检测阈值下限为5 µm。</li>
	<li>将每次运行的数据转移至电子表格中，以便进一步分析。</li>
	<li>定期使用1 ml直径为6 µm和8 µm的聚苯乙烯微球对仪器进行校准。 
	注意：应使用制造商对每批微球实测的实际尺寸，而非标称尺寸。选择6 µm和8 µm微球较为方便，因为这些直径接近静息态和活化态T细胞的预期直径（见图1）。</li>
</ol>
6. 数据与统计学分析
<ol>
	<li>使用适当的统计与绘图软件分析数据。 
	注：每次运行的电子表格包含各直径（范围：5 µm 至 70 µm）的细胞数量。直径大于 17 µm 的颗粒将从分析中剔除，以排除尘埃颗粒和微小气泡，这些颗粒可能被仪器误判为活细胞。</li>
	<li>对于方差不等的数据集，采用韦尔奇 t 检验（Welch's t-test）进行假设检验；当 p &lt; 0.001 时，结果被认为具有统计学显著性。所用公式为： 
	<img alt="双样本 t 检验公式；用于比较样本均值的方程；统计分析工具。" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 1"> 
	 
	其中 <img alt="带下标 1 的均值；分析中的统计符号。" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 2"> 和 <img alt="均值符号 x-bar 带下标 2；公式中的统计表示。" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 3"> 为样本均值，<img alt="静态平衡公式，Σs₁²。" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 4"> 和 <img alt="静态平衡方程 s^2/2，数学概念。" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 5"> 为样本方差，<img alt="折射率公式 n1 sin θ1 = n2 sin θ2，光学定律图示，光折射研究。" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 6"> 和 <img alt="静态平衡公式 ΣF=0 图示；结构受力分析设置；教学用途" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 7"> 为每组数据的样本量。自由度的估计保守地采用每次比较中两个样本量中较小者。柱状图以均值 ± 标准误（SEM）表示。</li>
</ol>
7. 脾脏T淋巴细胞增殖实验
<ol>
	<li>使用基于 MTS 或 MTT 的比色板读数法检测 T 细胞增殖。 
	注：该检测基于 MTS 四唑化合物（Owen 试剂）被代谢活跃细胞中的脱氢酶酶产生的 NADPH 或 NADH 还原为可溶性甲臜产物的原理。</li>
	<li>用血细胞计数板计数纯化的 T 细胞，并以完全 RPMI-1640 培养基重悬，终浓度为 1 × 106 个细胞/ml。 
	注：此步骤可添加 1 mM DTT。</li>
	<li>根据需要，用 PMA 和离子霉素激活细胞，并加入待测药物，轻柔混匀（操作类似于步骤 4）。</li>
	<li>将 100 µl 细胞悬液加入 96 孔细胞培养板的每孔中，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。向其中一个孔中加入不含细胞的 100 µl RPMI-1640 培养基，用于测定背景吸光度。</li>
	<li>向每孔加入 20 µl 基于 MTS 的试剂，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4 小时。</li>
	<li>使用酶标仪在 490 nm 处测定吸光度。吸光度值反映各孔中代谢活跃细胞的数量。 
	注：必要时减去背景值。背景吸光度受培养基类型、血清、外部 pH 值以及 MTS 试剂暴露于光照的时间影响。基于 MTS 的试剂对光敏感，长时间暴露于光线下可能导致背景吸光度升高。</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

本文介绍了一种利用自动细胞计数仪快速检测和定量T细胞母细胞化转化的技术。在我们的实验条件下（250 ng/ml PMA和250 nM离子霉素刺激），T细胞在激活48小时后，细胞表面积增加至原来的两倍，体积增至原来的三倍。该检测方法具有足够的灵敏度，可在激活最初12小时内检测到细胞母细胞化，此时细胞体积仅比静息状态增加1.25倍（图2D）。采用抗CD3和抗CD28抗体包被的磁珠这一更具生理相关性的T细胞激活方式，也引发了显著的母细胞化反应，在激活72小时后细胞体积平均增加2.3倍（图3D）。人外周血单个核细胞经PMA/离子霉素刺激48小时后，体积变化达2.6倍（图4）。ICR小鼠脾脏T细胞的平均直径和体积分别为6.9 µm和1.9 × 10-4 nl。人外周血单个核细胞（来自一名健康供体）的平均直径为7.7 µm，平均体积为2.7 × 10-4 nl。利用本实验方案，我们还测试了不同浓度PMA激活T细胞的能力。这些单细胞水平的结果与在相似PMA浓度下进行的增殖实验结果一致。
测试了多种据报道会影响细胞增殖的化合物：FTY72031,32；免疫抑制剂环孢素A（CsA）、FK506和雷帕霉素27,28；以及TRAM-34，一种钙激活的KCa3.1通道阻断剂33,35。我们发现，在所测试的浓度下，对母细胞化作用抑制效果最强的是CsA和FK506。雷帕霉素对母细胞化也有较弱但具有统计学显著性的抑制作用。而TRAM-34则对母细胞化无影响。
环孢素A（CsA）抑制了母细胞化和细胞增殖，但并未完全抑制（图2B 和 2C），表明自动细胞计数法可良好反映药物对T细胞增殖的抑制效果。当雷帕霉素与环孢素A联合存在时，母细胞化被完全抑制，提示NFAT和mTOR介导的信号通路共同作用，足以完全解释PMA/离子霉素有丝分裂刺激下T细胞的体积增大现象（图3C）。
某些增殖检测方法的动态范围有限（见图2）。增殖检测（例如我们所使用的检测方法，见图2C）所报告的信号包含了凋亡和坏死细胞的贡献。而自动化的细胞直径变化测量则无此限制，因为该测量仅针对活细胞。细胞活力通过台盼蓝染色排除法进行评估：健康的活细胞可排除染料摄入。在基于流式细胞术前向角散射进行的细胞大小测量中，双联体细胞的区分可能存在问题22。而在自动细胞计数仪的测量中，未发现双联体细胞群（图1）。此外，该方法的精确度足以区分100 nM与200 nM环孢素的作用效果（表1），并可在有丝分裂刺激后12小时内检测到母细胞化现象（图2D）。
这种新检测方法特别适用于少量样本。每小时最多可检测15个样本。然而，该检测方法也存在一些局限性，但大多数问题均可通过适当措施加以缓解。尽管该方法能够有效分辨细胞直径的微小差异（&#60;1 µm），但我们所使用的仪器型号的检测下限为5 µm。这一限制可能导致对极小细胞尺寸的高估，因为它实际上排除了所有直径更小的细胞。不过，较新型号的细胞计数仪检测下限已降至约2 µm，有望显著缓解此问题。如果样本中存在过多碎片，仪器会将其误判为活细胞。此外，气泡有时会进入流动池，导致仪器捕获的细胞图像发生畸变。这种畸变似乎不影响活力测定结果，但可能影响所测得的细胞直径。因此，建议实验人员在每轮试验数据被接受用于分析之前，仔细检查所有图像中是否存在气泡。由于软件仅在细胞周围绘制圆形轮廓，非球形细胞的直径测量值可能偏向长轴方向，从而使该检测方法不太适用于非球形细胞。
该检测方法快速，每个样本仅需约4分钟，相比之下，增殖检测则需要数小时。使用设备配套的软件进行数据采集也非常简便。软件可将测量数据导出至电子表格以供分析。此外，该方法为单细胞水平检测，而非群体细胞检测；可同时测量母细胞化和增殖情况，并能同步区分活细胞与死细胞。该方法可用于评估不同小鼠品系产生免疫应答的能力。该检测也可成功用于测定来自人类供体T细胞的母细胞化（图4），并可适用于其他类型的细胞。
已知细胞体积的增加有助于代谢的调控：细胞肿胀可刺激肝细胞中谷氨酰胺诱导的糖原合成和脂质生成36,37。中性粒细胞在迁移过程中表现出35-60%的体积增加，而趋化因子可诱导其发生10-15%的肿胀38-40。本实验方法有望用于研究这些过程。

T 淋巴细胞是哺乳动物适应性免疫的主要细胞。已知它们可响应由抗原呈递细胞表面主要组织相容性复合体（MHC）分子所呈递的特异性抗原肽。当相应的 T 细胞受体（TCR）被激活后，细胞会经历一种称为母细胞化转化（blastogenic transformation）或母细胞化（blastogenesis）的过程而体积增大。该过程在刺激施加后的约 6 小时内即可被检测到1。在母细胞化过程中，单个 T 细胞的体积可增加 2 至 4 倍2-6。淋巴细胞随后开始增殖，这一过程称为克隆扩增，其目的是尽可能多地产生携带抗原特异性 TCR 的细胞克隆。子代细胞继而分化为细胞毒性（CD8+）或辅助性（CD4+）效应 T 淋巴细胞，以发挥其免疫学功能。因此，人或小鼠血液中的初始 T 淋巴细胞处于细胞周期的 G0（静息）期，代谢活性极低。当暴露于抗原或有丝分裂原时，T 细胞重新进入细胞周期，并伴随转录和蛋白质合成的增强7-10。有丝分裂原（如佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）和离子霉素）通过激活蛋白激酶 C（PKC）和 Ca2+依赖性信号通路来刺激淋巴细胞1。使用 PMA/离子霉素激活 T 细胞可绕过 TCR 信号传导步骤。
体外增殖实验被广泛用于评估淋巴细胞功能及其对刺激的反应。通常在T细胞刺激开始后一至三天内获取增殖读数，这些读数反映了数百至数千个细胞的总体状态。通过简单测量这些化合物存在下的细胞增殖速率，即可评估不同有丝分裂原和免疫调节药物在体外的效力。以下将讨论其中一些实验方法及其局限性。
直接进行细胞计数的方法耗时较长，且操作者出错的概率较高。
在DNA合成检测中，³H-胸苷掺入法可测量DNA合成，但其主要局限性在于具有放射毒性。一种非放射性替代方法是BrdU，但其在细胞生长中的线性响应范围有限，且需要抗体处理，从而增加了实验步骤11,12。
在代谢活性检测中，四唑盐类试剂（MTT、MTS、XTT 和 WST-1）以及基于刃天青（resazurin）染料的比色法可反映增殖细胞群体的整体代谢状态。然而，MTT 不溶于培养基，需额外的洗涤步骤，从而引入测定误差；XTT 需要额外组分才能有效还原；基于 MTS、WST-1 和刃天青的检测则易受培养基 pH 值及其组分（如血清、白蛋白或酚红）的影响13-16。这些检测方法并非直接测定活细胞的实际数量，而是估算细胞内多种酶活性的总和。因此，由于细胞数量与染料还原能力之间存在非线性关系，代谢活性检测可能无法准确反映细胞增殖速率12,17。
在测定ATP浓度时，T细胞活化引起的ATP增加与细胞增殖相关。然而，细胞内ATP水平的升高是T细胞活化的初始步骤之一，而实际的细胞增殖则发生在其后的多个步骤之后17,18。
在染料稀释实验中，CFSE 荧光染料通过共价结合细胞内蛋白质对细胞进行染色。该染料的荧光强度随细胞增殖而呈依赖性降低，从而可追踪细胞分裂次数。然而，由于染料对蛋白质的共价标记，可能会影响这些蛋白质的功能。在较高浓度下，该染料对细胞具有毒性。而在较低浓度时，初始荧光强度降低，导致可追踪的细胞分裂次数减少。此外，在使用 CFSE 标记后，最初的 24 至 48 小时内会出现与增殖无关的大约 50% 的初始荧光损失，这限制了该实验的动态范围19,20。
这些检测方法大多反映的是大量细胞的总体状态，且需要使用荧光染料对细胞进行处理。除非通过化学试剂或抗体染色将坏死和凋亡细胞从分析中去除，否则这些细胞也可能对检测结果产生影响。
淋巴细胞转化可通过多种方法进行评估，例如光学显微镜检查或流式细胞术4,21,22在此，我们介绍一种利用自动细胞计数仪快速测量T细胞大小的方法，该仪器可采集实时细胞图像，图像可被存储并用于后续重新分析。除了细胞大小测量外，该设备还可提供精确的细胞数量以及通过台盼蓝染料排除法测定的活细胞百分比。本方案所用设备为市售产品，制造商曾使用三台不同仪器及多种浓度和活力对照对该仪器的精确性进行测试。这些研究结果显示，其变异系数通常低于6%。如本方案所述，该仪器定期使用直径为6 µm和8 µm的聚苯乙烯微球进行校准。利用细胞计数仪根据细胞直径区分静息T细胞与T淋巴母细胞的优势在于操作简便且分析过程自动化。软件可自动在每个细胞周围绘制圆形并计算细胞直径。此外，操作者可直接观察图像，以验证仪器在细胞识别及圆形绘制方面的准确性。就局限性而言，该仪器无法 本身 区分碎片与细胞；因此，操作人员在图像处理过程中必须查看每幅图像。存在引入气泡的可能性，这会减少可用于分析的视野数量；然而，如果定期执行冲洗维护，则这种情况较为罕见。
在本研究中，脾脏T淋巴细胞组分别用离子霉素和不同浓度的佛波酯（PMA）刺激12至48小时。低至2 ng/ml的PMA浓度即可诱导强烈的母细胞化反应和显著的增殖。检测了多种药物对母细胞化的影响，包括免疫抑制剂环孢素A（CsA）、FK506（他克莫司）和雷帕霉素（西罗莫司），以及离子通道阻滞剂TRAM-34和FTY720（芬戈莫德），其结果与已报道的对增殖的影响具有良好一致性。同时测定了人外周血单个核细胞（PBMCs）对PMA/离子霉素的母细胞化反应，以及利用抗CD3和抗CD28抗体包被的磁珠刺激小鼠T细胞的反应。
细胞计数实验可同时但分别定量测定细胞出芽（blastogenesis）和增殖速率（细胞密度），而不同于上述仅观察这些效应组合的方法。本方案提供了一种快速且可靠的评估有丝分裂原和免疫调节剂活性的技术。

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BW12-702F</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 尼龙细胞滤网&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>尼龙毛纤维柱</td><td>Polysciences, Inc.&amp;nbsp;</td><td>21759-1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管&amp;nbsp;</td><td>The Lab Depot</td><td>TLD431697</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>96 孔细胞培养板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>基于 MTS 的检测</td></tr><tr><td>环孢素 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30024</td><td></td></tr><tr><td>FK506</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>104987-11-3</td><td></td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3504</td><td></td></tr><tr><td>TRAM-34</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6700</td><td></td></tr><tr><td>FTY720</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0700</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 小鼠 T 细胞激活剂 CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11456D</td><td></td></tr><tr><td>佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics&amp;nbsp;</td><td>356150010</td><td></td></tr><tr><td>钙离子霉素钙盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>MP Biomedicals&amp;nbsp;</td><td>ICN1670049</td><td>100 倍浓缩液</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（DPBS）&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30378.02</td><td>10 倍浓缩液</td></tr><tr><td>1,4-二硫苏糖醇（DTT）&amp;nbsp;</td><td>Research Products International</td><td>12/3/3483</td><td>还原剂</td></tr><tr><td>8 &amp;micro;m 微粒尺寸标准品&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84192-5ML-F</td><td>实际粒径 &amp;nbsp;8.02 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>6 &amp;micro;m 微粒尺寸标准品&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89756-5ML-F</td><td>实际粒径 6.084 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>适用于 1.5 - 2 ml 管的单管磁力分离架</td><td>V&amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP772F5</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>Forma Scientific&amp;nbsp;</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 多功能微孔板检测仪&amp;nbsp;</td><td>Bio Tek</td><td>BTH1M</td><td></td></tr><tr><td>Vi-CELL 细胞活力分析仪&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>731050</td><td></td></tr></tbody></table>

快速定量t淋巴细胞有丝分裂原诱导的母细胞化以鉴定免疫调节药物

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

淋巴细胞在抗原或有丝分裂原刺激下的增殖是一种易于量化的现象，可用于检测免疫调节（即， 具有免疫抑制或免疫刺激作用的化合物及生物制剂。有丝分裂早期的最早事件之一是细胞增大或母细胞转化，即细胞在分裂前体积增加。这一变化通常可在T淋巴细胞刺激后的最初数小时内检测到。本文介绍一种利用自动细胞计数仪快速定量小鼠脾脏和人外周血单个核细胞（PBMCs）中T淋巴细胞母细胞转化的方法。目前常用的多种增殖检测方法大多操作繁琐，且仅能反映细胞群体的整体效应，而无法体现群体内单个细胞的变化。相比之下，本方法采用的自动细胞计数仪可对细胞直径进行快速、直接且精确的测量，适用于评估不同有丝分裂原及免疫调节药物的作用效果 体外.

我们采用该检测方法比较了淋巴细胞在佛波酯PMA和钙离子载体离子霉素刺激下发生母细胞化的程度。图1A展示了静息状态和药物激活的小鼠脾脏T细胞直径的频率分布。用PMA/离子霉素处理细胞约2天后，直径分布的中位数显著向更大直径方向偏移（例如参见文献4）。相应地，小直径细胞的数量明显减少。为了确认本设备报告的直径数值准确，我们使用直径分别为6 µm和8 µm的聚苯乙烯微球进行了两次校准（见材料表）。图1B和图1C分别显示了激活T细胞与8 µm标准微球、静息T细胞与6 µm标准微球叠加的测量结果。图1D展示了制造商提供的对照微球标称尺寸与我们自动化细胞计数仪测得的中位直径之间的对应关系。结果显示，6 µm微球的测量值略高于标称值，这可能是由于仪器的检测阈值下限为5 µm所致。然而，由细胞计数仪测得的微球直径标准差与制造商提供的标准差相符。基于这些实验结果，我们认为该设备可可靠地用于比较静息状态与有丝分裂原刺激后小鼠T细胞的大小，并且能够准确测量细胞的实际直径。
随后，我们进一步检测了平均直径增加对PMA浓度的依赖性，发现在离子霉素浓度固定为250 nM时，将PMA浓度从2 ng/ml升高至250 ng/ml并未显著改变其效应（图2A）。利用基于MTS的检测方法，我们在50 ng/ml和250 ng/ml PMA条件下测量了T细胞增殖，结果未发现明显差异（图2C），这与我们的细胞直径数据一致。钙调磷酸酶抑制剂环孢素A（300 nM）和FK506（1 nM）均抑制了母细胞化（图2B）和细胞增殖（图2C），但两种情况下的抑制均不完全。在PMA/离子霉素刺激12小时后进行的测量显示，50 ng/ml和250 ng/ml PMA组的细胞直径分别增加了7.2%和6.8%（图2D）。这两个浓度下的细胞尺寸增加无显著差异，这与48小时刺激的结果一致（与图2A比较）。
经PMA/离子霉素刺激48小时后，静息态与活化T细胞的细胞直径数据汇总见表1。静息态ICR小鼠脾脏T细胞的平均表面积和体积分别为151.4 µm2和1.9 × 10-4 nl；活化T细胞的平均表面积和体积分别为300.6 µm2和5.9 × 10-4 nl。所有活化细胞的平均直径增加为40.92%（表1）。
我们还测试了其他已报道具有免疫抑制作用的化合物：CsA、FK506、雷帕霉素（rapamycin）、FTY720 和 TRAM-34。在图3中展示了在静息和活化T细胞中，有或无这些药物处理时的细胞大小测量结果。靶向活化T细胞中钙调磷酸酶依赖性核因子（NFAT）27,28的CsA和FK506抑制效果最强，对母细胞化反应的抑制率接近72%（图3A和3B）。有趣的是，随着PMA浓度升高，CsA和FK506的抑制效力略有下降，尽管在无药物处理时细胞直径并未进一步增加（图2A和2B）。雷帕霉素是一种抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）29,30的免疫抑制剂，其作用中等但具有统计学显著性（图3A、3B和3C）。FTY720是一种鞘氨醇-1-磷酸受体激动剂，可抑制淋巴细胞进入循环系统31，最近发现其还能抑制在T淋巴细胞中高表达的阳离子通道TRPM732。FTY720和雷帕霉素对母细胞化的抑制作用相似，均使细胞直径的平均增幅从52%降低至约34%（图3A和3B）。TRAM-34是钙激活钾通道KCa3.1的阻断剂33。在700 nM浓度下，TRAM-34对小鼠T细胞无效，这与近期一项人T细胞增殖研究结果一致；其效力可能取决于有丝分裂刺激的类型和强度34（图3A和3B）。在我们的膜片钳电生理实验中，700 nM TRAM-34可有效阻断KCa3.1通道（数据未显示）。该比较是在同一实验中多个重复组内，于48小时时点对静息状态和药物处理组细胞进行的。当雷帕霉素与CsA联合使用时，母细胞化反应被完全抑制（图3C）。
使用抗CD3/抗CD28包被的磁珠激活小鼠T细胞72小时后，细胞平均直径增加了27%，而在环孢素A（CsA）存在条件下，该增加幅度降低至5%（图3D）。人单个核细胞经PMA/离子霉素激活48小时后，细胞直径增加了33%；而在CsA存在下激活时，细胞直径增加幅度降至23%（图4）。
<img alt="比较静息状态与激活状态细胞以及CR T细胞与微珠的细胞直径分布图。" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 小鼠脾脏T细胞直径的频率分布图。（A）黑色柱表示静息状态细胞，红色柱表示PMA/离子霉素激活（48小时）的细胞。（B）激活的小鼠脾脏T细胞分布叠加在8 µm粒径校准标准上。（C）静息T细胞分布叠加在6 µm校准标准上。所用细胞与微珠的数量在方框中标注。（D）细胞计数器测得的中位直径与制造商提供的微珠直径的对应关系图。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示不同PMA浓度下平均直径和吸光度变化的图表。" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2： 小鼠T细胞活化对PMA浓度的依赖性。（A）未经处理或经2、50和250 ng/ml PMA处理的T细胞的平均直径（离子霉素浓度固定为250 nM）。（B）静息态和活化态（2、50、250 ng/ml PMA）T细胞在有或无300 nM CsA或1 nM FK506存在下的细胞计数器测量结果。（C）在有或无300 nM CsA存在下，使用250 nM离子霉素及50和250 ng/ml PMA进行MTS增殖检测。显著差异（p &lt; 0.001）以星号标示。n为实验总次数。数据来自3只小鼠分离的细胞。（D）静息态和活化态T细胞（250 ng/ml PMA和250 nM离子霉素）在活化后12小时，在有或无300 nM CsA存在下的细胞直径。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞生长的柱状图分析；条件：活化/静息；变量：CAA、雷帕霉素、TRAM-34。" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3： CsA、FK506、FTY720、雷帕霉素和 TRAM-34 对细胞大小的影响。（A 和 C）在无药物或含药物存在条件下，静息态和经 PMA/离子霉素激活的小鼠 T 细胞的平均直径。药物浓度显示于方框中。（B）将 A 图数据表示为相对于静息 T 细胞直径的百分比增长。淋巴细胞激活使用 250 ng/ml PMA 和 250 nM 离子霉素处理，测量时间点为刺激后 48 小时。（D）在激活后 72 小时，使用细胞计数仪测量无药物或含 300 nM CsA 条件下静息态和抗 CD3/CD28 激活的 T 细胞。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞活力与直径分布；柱状图比较显示不同条件下的尺寸变化。" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4： 有丝分裂原刺激下人外周血单个核细胞（PBMC）的母细胞化反应。（A）黑色柱代表静息状态的PBMC，红色柱代表激活状态的PBMC。（B）在有或无300 nM环孢素A（CsA）存在条件下，静息与激活PBMC的平均直径。细胞使用250 ng/ml PMA和250 nM离子霉素激活，并在激活48小时后进行测量。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>列1</td>
			<td>静息状态</td>
			<td>激活状态</td>
			<td>CsA 100 nM</td>
			<td>CsA 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均直径</td>
			<td>6.94 µm</td>
			<td>9.78 µm</td>
			<td>8.19 µm</td>
			<td>7.92 µm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>直径平均增加量</td>
			<td></td>
			<td>40.92%</td>
			<td>17.88%</td>
			<td>14.09%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均表面积</td>
			<td>151.37 µm²</td>
			<td>300.61 µm²</td>
			<td>210.56 µm²</td>
			<td>197.22 µm²</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>表面积平均增加量</td>
			<td></td>
			<td>98.59%</td>
			<td>39.00%</td>
			<td>30.16%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：细胞平均直径及表面积相对增加的汇总。 测量在使用250 ng/ml PMA和250 nM 离子霉素激活后48小时进行。

T淋巴细胞有丝分裂伴随着母细胞化转化，即细胞在分裂前体积增大。本文介绍一种利用能够测量细胞直径的自动细胞计数仪来定量T淋巴细胞母细胞化的方法。

快速定量T淋巴细胞有丝分裂原诱导的母细胞化以鉴定免疫调节药物

淋巴细胞在抗原或有丝分裂原刺激下的增殖是一种易于量化的现象，可用于检测免疫调节作用（即……）

本实验的总体目标是通过测量T淋巴细胞的母细胞化或母细胞转化，利用自动细胞计数仪评估免疫调节药物的效力。该检测方法利用配备细胞直径测量功能的自动细胞计数仪，快速定量T淋巴细胞的活化程度。该技术的主要优势在于，与常用的T淋巴细胞增殖检测方法不同，它能够对单个细胞进行快速、简便且直接的测量。使用免疫调节药物处理淋巴细胞会增加或降低细胞转化的速率和程度。利用细胞计数法，每份样本约四分钟即可测定该转化程度。在处死动物后十分钟内，用70%乙醇喷洒小鼠腹部，并用剪刀在动物左侧的毛皮和皮肤上做一切口。分开并后拉皮肤以暴露腹膜，然后在切口部位涂抹4%氯己定。使用另一套剪刀和镊子，沿腹部中线做一道2至3厘米的切口，以打开腹膜。然后，去除脾脏周围的内脏附着物和多余脂肪，并将组织转移至含有DPBS的容器中。接着，在一个10厘米的培养皿中加入10毫升完全RPMI 1640培养基，用两片灭菌的磨砂玻璃片轻轻碾压脾脏。将组织悬液通过无菌的40微米尼龙细胞筛过滤至一个新的10厘米培养皿中，以去除结缔组织和碎片，然后将单细胞悬液转移至50毫升锥形管中进行离心。将沉淀重悬于20毫升红细胞裂解缓冲液中。室温下轻轻摇动10分钟后，再次离心收集细胞，并将沉淀重悬于10毫升新鲜培养基中。然后再次离心细胞，并重悬于2毫升37°C完全培养基中。为了纯化T细胞，首先用5毫升完全RPMI培养基洗涤每只脾脏对应的一至两个尼龙毛柱两次，并将尼龙毛柱置于37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养孵箱中孵育1小时。孵育结束时，将2毫升分离得到的脾细胞悬液加至每个柱的顶部，让细胞流经柱体，直至液体到达尼龙毛顶部。接着，向柱顶加入2毫升新鲜的37摄氏度完全培养基，使培养基流经尼龙毛，直至柱顶液体再次到达尼龙毛顶部。现在用3毫升37摄氏度的完全培养基覆盖羊毛，并将柱子放回细胞培养箱中，使B细胞、成纤维细胞和辅助细胞全部贴附到羊毛纤维上。一小时后，在新的50毫升锥形管中，用5毫升新鲜完全培养基洗涤柱子两次，以洗脱未贴壁的T细胞。然后通过离心收集细胞。用十毫升完全培养基洗涤T细胞一次后，将细胞沉淀重悬于两毫升新鲜完全培养基中。随后对细胞进行计数，并用新鲜完全培养基将细胞悬液稀释至每毫升0.5×10⁶个细胞的浓度，根据实验需要接种至六孔或二十四孔细胞培养板中。在分离后24小时内，使用适当的刺激物及感兴趣的实验药物激活经尼龙毛柱分离的T细胞。在12至72小时后，使用1毫升移液器轻轻混匀经激活处理的细胞，以去除任何团块。为通过自动细胞计数仪测量细胞直径，将每个孔中1毫升处理后的细胞转移至各自的样品杯中，并将样品杯放入自动细胞计数仪的样品转盘内。输入样品编号和细胞类型信息以记录样品，并开始运行样品检测。将台盼蓝与细胞悬液混合后，使细胞流过成像区域，直至每个样本收集到约100个细胞图像。软件会在每个检测到的台盼蓝染色和未染色的细胞周围绘制一个圆圈，以确定细胞直径。当所有细胞测量完成后，数据将导出至电子表格，显示每个测量直径对应的总细胞数和活细胞数结果。随后可将数据以直方图形式呈现。在使用佛波酯（PMA）和离子霉素刺激两天后，可观察到频率分布的中位数显著向更大细胞直径方向偏移，同时小直径T细胞的数量相应减少。在固定250纳米浓度离子霉素的条件下，将激活刺激物PMA的浓度从每毫升2纳克提高到250纳克时，其效应无显著变化。T细胞增殖方面也未观察到明显差异。钙调神经磷酸酶抑制剂类药物可部分抑制T细胞母细胞化和增殖。使用靶向活化T细胞核因子的钙调神经磷酸酶抑制性化合物处理T细胞，可使母细胞化反应抑制近72%。雷帕霉素和FTY720对淋巴细胞母细胞化具有中等但统计学上显著的影响。而TRAM34即使在700纳摩尔浓度下也显然不影响小鼠T细胞的增殖。当雷帕霉素与环孢素A联合使用时，淋巴细胞母细胞化被完全抑制。使用抗CD3和抗CD28偶联磁珠活化的小鼠T细胞也观察到类似结果。该方法可用于成功量化多种免疫调节药物的作用效果，相较于传统的增殖检测（其结果还包含凋亡和坏死细胞的贡献），能更准确地评估药物效力。利用该方法，可对多达15个样本进行同步及后续的爆裂形成和增殖速率的定量分析。偶尔会有气泡进入流动池，导致测量结果无法使用，因此在接收每次试验的数据进行分析之前，应检查所有图像中是否存在气泡。该方法的一个局限性在于，如果样品中杂质过多，测量系统可能会将杂质误判为活细胞。经过适当的改进，该检测方法有望被用于研究中性粒细胞和肝细胞的细胞大小变化。

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