A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

该成像系统的总体目标是使用共聚焦荧光显微镜以亚细胞分辨率观察植物器官在几天内的发育情况。这种方法可以帮助回答植物形态发生中的关键问题，例如多细胞生物的细胞在器官发生过程中如何协调其生长和增殖模式？这种技术的主要优点是设置简单，并且不依赖于延时成像中经常使用的专业设备，例如 profusion 系统。

当我们在 New Phytologist 上阅读 Littlejohn 和 Love 的出版物时，我们第一次有了这种方法的想法，该出版物描述了全氟十氢萘在叶组织内成像的优势。首先，使用玻璃切割机从 1 毫米厚的载玻片上制作三毫米宽的玻璃条。然后，用氰基丙烯酸酯胶或双面胶带将条带固定在新载玻片的宽度上，相距约 45 毫米。

制作一个具有相同尺寸的额外载玻片作为模具。现在，用透气的 PDMS 胶制作相同高度的垫圈。用少许无水乙醇润湿第二张载玻片，然后将 PDMS 压平在载玻片上至玻璃条的高度。

接下来，用无水乙醇润湿刀片并修剪掉多余的 PDMS。这一点至关重要，因为用乙醇湿润的工具不会粘在 PDMS 上。然后，将 PDMS 重新压平至条带的高度。

然后，在 PDMS 中切一个空腔，用于容纳幼苗和琼脂板。为了产生一致的腔体尺寸，我们使用由 perspecs 制成的定制自制切割机，但可以使用剃须刀片代替。接下来，修剪外边缘，使垫圈厚度约为 2 毫米。

现在，在没有 PDMS 垫圈的载玻片上，将盖玻片放在两个玻璃条上。然后进入盖玻片下方的空间，吸取约 1 毫升足以填充空间的温热液化琼脂培养基。琼脂可以包含感兴趣的实验化合物。

接下来，通过在试管中摇动少量 PFD 来空气平衡一些 PFD。琼脂凝固后，将大约 200 微升 PFD 加载到 PDMS 垫圈中，但不要完全填充。从琼脂平板上取下盖玻片，并将其切成适合 PDMS 凝胶垫圈孔的形状。

在琼脂和垫圈壁之间留出 2 到 4 毫米的间隙。然后，用空气平衡的 PFD 完全填充腔室。为了对引力性原生根进行成像，使用纤维素膜作为琼脂板表面的物理屏障。

琼脂板也必须更柔软，使用 0.8% 琼脂而不是 1.5% 琼脂。切下一块与琼脂块尺寸大致相同的膜。然后，用 80% 乙醇消毒并风干。

干燥后，将膜浸泡在液体生长培养基中，然后将其转移到琼脂表面。首先，小心地将最多三棵幼苗放在琼脂上。他们的定位至关重要。

子叶和下胚轴必须悬挂在琼脂边缘上，漂浮在 PFD 中。必须在幼苗之间留出空间以允许生长。如果幼苗太大而无法放入腔室，则可以卷曲。

然后，使用厚度与所选物镜相匹配的盖玻片关闭腔室。沿着边缘轻轻按压，使玻璃条接触。使用另一张载玻片轻轻按压盖玻片，使其均匀地放在两个玻璃条上。

然后，使用纵向切成两半的微孔手术胶带固定盖玻片。现在，让标本静置约半小时后再成像。为了准备用于腔室的拟南芥幼苗，首先用 70% 乙醇对种子进行消毒。

然后将它们种植在补充的培养基上。将种植的种子在 4 摄氏度下分层两到四天。然后，将种植的种子转移到 22 摄氏度，并在每天 16 小时的光照周期下垂直生长。

为了对侧根进行成像，将植物生长 7 到 10 天，然后将它们转移到成像室中。在成像室中每半小时记录一次以生理速率生长的侧根。侧根也在同一培养基中的标准培养皿上生长以进行比较。

在两种设置中，单个根的生长速率变化很大，但在任一条件下的范围都相似。总体而言，生长速度随长度的增加而增加。在生长的前 27 小时内，成像室或平板上植物的生长速度无法区分。

两组开始时的平均侧根长度相同。在成像室中每隔一小时对共表达质膜标志物和微管标志物的侧根进行成像。牙根的位置高度稳定，可以进行数小时的共聚焦成像。

在整个实验过程中观察到增殖的视觉指标。在分生组织细胞中，前期带、有丝分裂纺锤体和蛤蜊质体都可以被识别出来。在前 48 小时内，与培养皿相比，在 3 天内，成像室中的侧根生长没有显着差异，但到 72 小时时，平均生长速率下降。

然而，在 72 小时内，腔室中很大一部分根的生长速度仍然与平板上的根相当。一旦掌握，如果一切顺利，可以在 15 分钟内制作两张幻灯片。可以使用这种成像系统来研究药物治疗的效果，尽管洗脱实验需要其他更复杂的方法，如灌注系统。

发展之后，这项技术提供了一种廉价而简单的方法来跟踪支撑植物形态发生的细胞事件，特别是探索细胞边缘的作用，即拟南芥侧根中空间需求共享器官发生的作用。