一种用于根和下胚轴发育长期共聚焦成像的简易培养室

该成像系统的总体目标是利用共聚焦荧光显微镜，在亚细胞分辨率下观察植物器官在数天内的发育过程。该方法有助于回答植物形态发生领域的一些关键问题，例如：多细胞生物的细胞在器官形成过程中如何协调其生长和增殖模式？该技术的主要优势在于其设置简单，且不依赖于时间序列成像中常用的特殊设备，如灌注系统。

我们最初是在阅读《新植物学家》（New Phytologist）上 Littlejohn 和 Love 发表的一篇论文时萌生了该方法的想法，该论文描述了全氟十氢萘在叶片组织成像中的优势。首先，使用玻璃切割器从一毫米厚的载玻片上切割出三毫米宽的玻璃条。然后，使用氰基丙烯酸盐胶水或双面胶带，将这些玻璃条固定在另一张新载玻片的宽度方向上，间距约为 45 毫米。

另制作一个相同尺寸的载玻片，用作模具。接着，用透气的PDMS胶制作一个相同高度的垫圈。用少量无水乙醇润湿第二个载玻片，然后将PDMS压平在载玻片上，使其高度与玻璃条齐平。

接下来，用无水乙醇润湿刀片，并切除多余的PDMS。此步骤至关重要，因为用乙醇润湿的工具不会粘附PDMS。然后，将PDMS重新压平至与条带齐平的高度。

然后，在 PDMS 上切割出用于容纳幼苗和琼脂块的空腔。为了获得一致的空腔尺寸，我们使用由透明塑料板自制的专用切割工具，但也可使用剃须刀片替代。接下来，修剪外缘部分，使垫圈厚度约为两毫米。

现在，取一个没有PDMS垫圈的载玻片，将盖玻片架在两片玻璃条上。然后用移液器向盖玻片下方的空间加入约一毫升温热的液态琼脂培养基，直至填满该空间。琼脂中可含有感兴趣的实验化合物。

接下来，通过在离心管中振荡少量全氟化碳液体（PFD），使其与空气达到平衡。待琼脂凝固后，将约 200 微升的 PFD 加入 PDMS 密封垫中，但不要完全充满。将盖玻片从琼脂块上取下，并将其切割成适合 PDMS 凝胶密封垫孔洞的形状。

在琼脂与垫圈壁之间留出2至4毫米的间隙。然后，用与空气平衡的PFD完全填充腔室。为了观察向重力性主根，需在琼脂平板表面使用纤维素膜作为物理屏障。

琼脂平板的硬度也应更低，需使用0.8%的琼脂，而不是1.5%的琼脂。裁剪一块与琼脂块尺寸相近的膜。然后用80%乙醇灭菌，并静置晾干。

干燥后，将膜浸泡在液体培养基中，然后转移至琼脂表面。开始时，小心地将最多三株幼苗放置在琼脂上。幼苗的位置至关重要。

子叶和下胚轴必须悬挂在琼脂边缘之外，漂浮在PFD中。幼苗之间需留出空间，以利于生长。如果幼苗过大而无法完全放入培养室中，可能会发生卷曲。

然后，使用厚度与所选物镜相匹配的盖玻片封闭样品室。轻轻沿边缘按压，使盖玻片与玻璃条接触。再用另一块载玻片轻轻下压盖玻片，使其均匀地落在两条玻璃条上。

然后，使用沿长度方向对半剪开的微孔手术胶带固定盖玻片。接着，让样品静置约半小时，再进行成像。为将拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗装入培养腔做准备，首先用70%乙醇对种子进行灭菌处理。

然后将种子种植在添加了补充成分的培养基上。在4摄氏度条件下对种植的种子进行2至4天的分层处理。随后，将种植的种子转移至22摄氏度环境中，在每日16小时光照周期下垂直培养。

为了观察侧根，将植物培养7至10天，然后转移至成像室。在成像室中以生理速率生长的侧根每半小时记录一次。同时，在相同培养基的标准培养皿上培养侧根作为对照。

在两种实验条件下，单条根的生长速率差异均较大，但变化范围在两种条件下相似。总体而言，生长速率随根长度的增加而增加。在生长的前27小时内，成像室中与培养板上植物的生长速率无明显差异。

两个组的侧根平均长度起始时相同。在成像室中，每隔一小时对共表达质膜标记和微管标记的侧根进行成像。根部位置非常稳定，可实现连续数小时的共聚焦成像。

在整个实验过程中观察到了增殖的视觉指标。在分生组织细胞中，可以识别出有丝分裂前期带、有丝分裂纺锤体和成膜体。在三天内，成像室与培养皿中的侧根生长在前48小时内无显著差异，但在72小时时，平均生长速率下降。

然而，在72小时内，培养室中仍有相当比例的根以与平板上根系相当的速率生长。一旦熟练掌握，若一切顺利，可在15分钟内制作两个样品载片。该成像系统可用于研究药理学处理的影响，但洗脱实验则需要其他更复杂的方法，如灌注系统。

该技术发展后，为研究植物形态发生过程中细胞事件提供了一种廉价且简便的方法，特别是可用于探索细胞边缘以及空间需求在拟南芥侧根器官发生中的作用。