Name: 长期共焦成像根和下胚轴发育的简单室 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学习使用共聚焦荧光显微镜对拟南芥根和下胚轴进行长期活细胞成像的简单方法。该技术利用全氟十氢萘和简易成像室，可在亚细胞分辨率下连续观察植物器官发育数天，为研究植物形态发生中的细胞协调机制提供经济高效的实验手段。

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我们感谢不列颠哥伦比亚大学的 Geoffrey Wasteneys 教授提供了表达 RFP-TUB6 的种子，以及一位匿名审稿人提供的有益修改意见。我们感谢 Hugh Dickinson 教授提醒我们使用纤维素膜作为机械支撑，感谢 John Baker 提供摄影支持。本研究得到了英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）研究基金 BB/G013993/1 和 BB/D004055/1 对 I.M. 的资助，以及 BBSRC 博士生培训奖和克拉伦登奖学金对 C.K. 的资助。

1. 制备反应室
<ol>
	<li>使用玻璃切割器，从1 mm厚的显微镜载玻片的一端切下3 mm宽的玻璃条。使用氰基丙烯酸酯快干胶或双面胶带，将这些玻璃条以约45 mm的间距粘贴在另一张载玻片的宽度方向上（图1A）。每个培养室需要一张载玻片，另需额外的载玻片用于浇注琼脂平板（一张载玻片可制备2–3个琼脂平板）。载玻片可重复使用。</li>
	<li>在玻璃条之间，用透气的聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane)）胶体制作一个与玻璃条等高的垫圈。将一团聚二甲基硅氧烷胶体置于载玻片上（图1B），用少量100%无水乙醇润湿另一张载玻片，然后用该载玻片压平聚二甲基硅氧烷胶体团，直至其高度与玻璃条齐平（图1C）。
	<ol>
		<li>如有必要，用剃刀刀片修剪多余的聚二甲基硅氧烷胶体，并重复压平操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用合适的切割工具或经无水乙醇润湿的剃刀刀片，去除聚二甲基硅氧烷胶体的内部部分，形成用于后续放置幼苗和琼脂平板的空腔（图1D）。</li>
	<li>用剃刀刀片小心修整凝胶，使垫圈最终的壁厚约为2 mm（图1E）。气体透过聚二甲基硅氧烷屏障的渗透性在厚度超过50 µm时与厚度无关11。</li>
</ol>
2. 制备琼脂固化的培养基平板
<ol>
	<li>在载玻片上带有两条玻璃条的位置，放置盖玻片（22 mm × 50 mm），使其两端分别搭在两条玻璃条上。</li>
	<li>将含有1%（w/v）蔗糖和1.5%（w/v）琼脂的熔融半强度Murashige和Skoog培养基（½ MS）用移液器注入盖玻片下方形成的空隙中，直至完全充满（总体积约1 mL），静置至琼脂凝固（约5分钟）。 
	注意：可通过在倒制琼脂块前将适当浓度的药理学化合物加入液体培养基中，从而将化合物引入琼脂块。该方法已成功用于地塞米松12、异噁唑苯、2,6-二氯苯腈（DCB）、oryzalin和Latrunculin B。</li>
</ol>
3. 完成腔室装置的设置
<ol>
	<li>通过在离心管中振荡少量 PFD 使 PFD 与空气平衡7。向凝胶垫圈的孔中加入少量（约 200 µL）与空气平衡的 PFD，但不要完全充满腔室。此 PFD 有助于在将琼脂块放入腔室时避免其下方截留气泡。</li>
	<li>从琼脂块上取下盖玻片（如上文步骤 2.2 所述），并使用刀片切下一小块所需大小和形状的琼脂块。然后将其放入凝胶垫圈的孔中（图 1F）。琼脂块与垫圈四周应保持 2–4 mm 的间隙。</li>
	<li>用与空气平衡的 PFD 完全充满腔室。</li>
	<li>将一株或多株 A. thaliana 幼苗（用于 2–3 天成像时最多 3 株幼苗）放置于琼脂块上，使子叶和下胚轴悬垂于边缘，并漂浮在 PFD 中（图 1G）。</li>
	<li>为获得幼苗，先用 70% 乙醇对种子进行表面灭菌，然后将其接种于添加 1% 蔗糖和 0.8% 琼脂的 ½ MS 培养基上，于 4 °C 下春化处理 2–4 天，随后将培养皿垂直放置，在 22 °C、16 小时光照/8 小时黑暗条件下培养。若需观察侧根，应在转移至成像腔室前培养 7–10 天。</li>
	<li>为封闭腔室，选用与物镜光学参数匹配的盖玻片，用玻璃载玻片的边缘轻轻按压盖玻片，直至其两端均落在两侧玻璃条上（图 1H）。</li>
	<li>如需要，可在两端使用沿长度方向对半剪开的 1.25 cm 宽微孔手术胶带条固定盖玻片（图 1I）。成像前让样品静置约 30 分钟，以减少成像过程中的样品移动。</li>
	<li>使用正置显微镜进行成像，以维持稳定的生长基质。建议使用 20X/0.7NA 或 63X/1.2NA CS2 物镜。</li>
</ol>

<ol><li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Meth. 11, 22(2015).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high+throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).</li>
<li>Baranenko, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/245021280_Solubility_of_oxygen_and_carbon_dioxide_in_water">Solubility of oxygen and carbon dioxide in water.</a> Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).</li>
<li>Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Cellular+Dynamics+in+Growing+Arabidopsis+Roots+with+Light+Sheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy.</a> Plos One. 6, (2011).</li>
<li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).</li>
<li>Littlejohn, G. R., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+imaging+Arabidopsis+leaves+using+perfluorodecalin+as+an+infiltrative+imaging+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Littlejohn, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update%3A+improvements+in+imaging+perfluorocarbon-mounted+plant+leaves+with+implications+for+studies+of+plant+pathology%2C+physiology%2C+development+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology.</a> Front Plant Sci. 5, 140(2014).</li>
<li>Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378381204002717">Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons.</a> Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).</li>
<li>Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Fluid+Fluorocarbons+to+Study+Freezing+in+Plant+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues.</a> Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).</li>
<li>Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0376738814009466">Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes.</a> J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).</li>
<li>Kirchhelle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Specification+of+Geometric+Edges+by+a+Plant+Rab+GTPase+Is+an+Essential+Cell-Patterning+Principle+During+Organogenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis.</a> Dev Cell. 36, 386-400 (2016).</li>
<li>Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+division+and+elongation+underlying+the+developmental+acceleration+of+root+growth+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).</li>
<li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+combinatorial+analysis+of+membrane+compartments+in+intact+plants+with+a+multicolor+marker+set%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set.</a> Plant J. 59, 169-178 (2009).</li>
<li>Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CLASP-modulated+cell+edge+barrier+mechanism+drives+cell-wide+cortical+microtubule+organization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis.</a> Nat Commun. 2, 430(2011).</li>
<li>Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototropism+and+Gravitropism+in+Lateral+Roots+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis.</a> Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).</li>
<li>Gendreau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+basis+of+hypocotyl+growth+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).</li>
<li>von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+of+Plant+Roots+Growing+on+the+Surface+of+a+Gel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel.</a> J. Vis. Exp. (119), e55044(2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种对发育中的侧根进行高分辨率共聚焦成像的简单策略，可连续成像两天至最多三天。在长达48小时的成像期间，未观察到成像系统对侧根发育产生任何不利影响。48小时后，侧根的平均生长速度开始减缓，尽管仍有相当一部分根（37%）的生长速率与在培养板上生长的根的平均速率相当。因此，通过成像足够数量的根，可以排除那些在48小时后生长减缓的根。目前尚未对成像室在超过72小时以上的使用情况进行系统性测试，但如果需要更长的成像时间，建议采用其他替代策略。只要提供适当的环境条件，成像室可连续放置在显微镜载物台上，也可移至植物生长设施中培养，并定期送回显微镜进行成像。该方法可实现多个成像室的并行成像。
此处所述培养室的一个优势在于侧根位置固定，可使用高分辨率水浸物镜进行成像。空间稳定性在很大程度上取决于支撑琼脂块中所用琼脂的浓度。最初测试了从0.8%到2%的一系列不同浓度，结果表明，该范围内的高浓度琼脂虽能稳定固定根系位置，但根的生长速度更快减缓，且部分根表现出机械应力的迹象，包括细胞伸长受抑制。相比之下，低浓度琼脂无法提供所需支撑，根在成像过程中会在x、y和z方向发生漂移。1.5%的琼脂浓度为最佳选择，可在不产生不良机械效应的前提下固定样品位置。在此条件下，根系在初始约30分钟内稳定后，可在数小时内保持稳定，从而支持过夜数据采集。在采集4D数据期间，z轴扫描范围通常额外增加5–10 µm，但这主要是为了适应侧根的平面外生长，而非补偿z轴漂移或晃动。尽管标准浓度的琼脂对穿透具有一定阻力，向重力性生长的根最终仍会穿透琼脂。然而，通过轻微改造成像室，可使根的生长维持与盖玻片平行，从而实现对较老的侧根和主根的成像。此外，该基本成像室也可轻松改装用于下胚轴的观察。在此系统中，下胚轴更易自由漂浮，因此成像时z轴扫描范围通常增加至约20 µm。本研究全程使用正置显微镜，便于控制基质特性。该成像室或可适配倒置显微镜系统，但需评估刚性盖玻片对穿插器官随时间变化的影响。
Littlejohn 及其同事指出，PFD 本身不易溶解生物分子，因此不能直接用于递送药理学化合物7。这一问题通过在琼脂块所依托的凝固生长培养基薄层中提供此类化合物得以解决。尽管灌流系统仍将是洗脱实验的首选方法，但该成像室已成功用于地塞米松12及其他化合物的施加。需要说明的是，在本文撰写期间，von Wagenheim 及其同事18报道了一种用于光片显微镜下观察侧根发育的成像室。

为了研究植物发育过程中涉及的细胞及亚细胞活动，人们对高分辨率、长时间的延时成像技术的需求日益增长。此类成像实验中的一个关键挑战是维持生理条件的稳定，包括充分的气体交换以及水分和养分的持续供应1,2,3。为了利用高数值孔径物镜实现最佳光学分辨率，样品应尽可能贴近盖玻片，并与之平行放置。在成像过程中，样品在x、y和z方向上的移动应尽可能最小化。
尽管幼苗通常被置于水或水溶液中进行短期成像，但水对CO2和O2的溶解能力较低（在20 °C、0.1 MPa条件下分别为1.54 mg/mL和0.04 mg/mL）4，因此不适合长时间的延时成像实验。维持恒定氧气和营养水平的灌流系统是解决该问题的一种方案，目前已开发出适用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）1,2,3和光片显微镜（LSM）5的此类系统。RootChip2和RootArray3等系统专为根系发育过程的延时成像而设计，其通过在定制的多样本装置中萌发种子来实现。这些装置可最大程度减少机械干扰，并支持多个幼苗的并行分析，但并未针对亚细胞结构的成像进行优化。Calder及其同事设计了一种更为复杂的基于灌流的成像室，适用于亚细胞结构的成像，其中样品由网格固定，以便使用高倍浸没物镜1。
本文介绍了一种解决该问题的替代性简单方案，该方案不依赖灌注系统，而是利用全氟十氢萘（PFD）——一种 recently 广泛用作成像封片介质的全氟碳化合物。 拟南芥 成像6,7,8在这些应用中，PFD 具有高溶解 CO 的能力2 和 O2 （1.9 g/mL，用于O2 在PFD中相较于水中的0.04 mg/mL）9，可使浸没的组织进行气体交换。此外，PFD 无荧光性，其折射率为 1.313，与水的折射率（1.333）相近，且比空气（1.000）更接近细胞质的折射率（约 1.4）6据报道，全氟碳化合物对多种植物及植物组织的生理影响极小6，萝卜种子在浸入PFD后能 readily 发芽，并在供水条件下表现出至少两天的正常生长和发育10. 类似观察结果也见于萌发的 拟南芥 种子6基于受激拉曼散射直接成像PFD的分布 拟南芥 浸润后叶片组织的结果表明，Littlejohn 及其同事得出结论：PFD 可能不会被活细胞吸收8PFD 之前主要被用于成像地上组织，由于其表面张力低，可轻易渗透气隙，从而显著增加成像深度。6在此，采用PFD进行发育中侧根的长期共聚焦成像。该配置中，将一株或多株幼苗置于以琼脂固化的培养基平板上，并浸入PFD中。PFD可实现成像室内的气体交换，防止缺氧。由于PFD具有高挥发性，因此通过聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane)）胶垫进行密封，该胶垫同时具有高气体通透性（1.5 × 10-12 pmol m-1 s-1 Pa-1 用于 CO2)11营养物质和水分由添加琼脂凝固的培养基块提供。同时，琼脂块可轻柔地将根压向盖玻片，从而固定其在成像室中的相对位置，便于使用高分辨率的水浸物镜进行观察。此外，可通过琼脂块施加多种药理学处理，包括地塞米松（dexamethasone）、oryzalin 和异噁唑苯（isoxaben）。成像室可利用标准显微载玻片和极少的设备大量组装。该成像室最初开发并用于研究侧根发育，但也可适用于其他幼苗器官的成像，如主根尖端和下胚轴。

<table><tbody><tr><td>全氟十氢萘</td><td>F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td><td>FLUTEC PP6</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷生胶&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td><td>商品编号 # 132700</td><td>Carolina Observation Gel</td></tr><tr><td>凹面载玻片</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth,&amp;nbsp;UK</td><td>10118-600</td><td>凹面直径为13 mm，深度为0.2–0.4 mm。任何类型的凹面载玻片可能均适用</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td>Loctite</td><td>604753</td><td>任何适用于玻璃的“瞬间胶”可能均适用</td></tr><tr><td>纤维素赛璐玢膜</td><td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td><td></td><td>325P 纤维素薄膜；直径80 mm圆片</td></tr></tbody></table>

一种用于根和下胚轴发育长期共聚焦成像的简易培养室

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

植物发育的多个方面（例如侧根形态建成）发生在数天的时间尺度上。为了研究其背后的细胞和亚细胞过程，需要采用能够维持生理条件的高分辨率延时显微成像策略。植物组织必须获得充足的营养和水分供应，并持续进行气体交换；然而，当组织被浸没并固定在盖玻片下时，极易发生缺氧。一种已被成功应用的策略是使用灌流系统，以持续提供氧气和营养物质。然而，这类装置可能结构复杂、操作繁琐，并需要专用设备。本文介绍了一种替代方案，即使用全氟十氢萘作为浸没介质的简易成像系统。该系统搭建简便，所需设备极少，可轻松安装在显微镜载物台上，支持多个成像室并行设置与观察。在此系统中，前两天侧根的生长速率与琼脂平板上的标准条件无显著差异，且侧根生长在之后至少一天内仍以较慢速率持续进行。植物组织通过琼脂块获得营养供应，该琼脂块也可用于施加多种药理学化合物。该系统最初建立用于监测侧根发育，但可轻易调整用于成像其他植物器官，如下胚轴和主根。

在成像室中，侧根以生理速率生长。
在成像室中生长的植物侧根长度以每小时为间隔进行测量（图2A，左图，视频1，n = 23），并与在含有相同琼脂固化培养基的标准培养皿中生长的侧根生长速率进行比较（图2A，右图，视频2，n = 23）。侧根之间的生长速率可能存在显著差异，其中根的长度是一个决定性因素，原因在于较长的根具有不断延伸的生长区和增殖区13。因此，在成像室和琼脂平板上均选择了一系列具有不同初始长度（范围从50 µm到1150 µm）的侧根。实验开始时，每组侧根的平均长度相近（成像室和培养皿分别为439 µm和442 µm）。在27小时的分析时间段内，成像室和培养皿中的侧根生长均近似呈线性，培养皿上的平均生长速率为52 µm/h（R2 = 0.997），成像室中的平均生长速率为51 µm/h（R2 = 0.993）（图2B）。在培养皿和成像室中，单个侧根的生长速率均表现出高度变异性（图2C），成像室中生长速率范围为17 µm/h至82 µm/h，培养皿中为13 µm/h至87 µm/h。尽管生长速率通常随根长度增加而提高，但相似长度的根之间仍存在显著差异，且成像室与培养皿之间的变异程度相似。
在成像室中，侧根大量增殖，可使用高数值孔径物镜进行成像。
通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）10以每小时一次的频率对共表达质膜标记NPSN12-YFP14和微管标记UBQ1::mRFP-TUBULIN BETA6（RFP-TUB6）15的侧根进行成像，以记录成像室中细胞增殖期间的微管行为（图2D，影片3）。在这些成像室中，侧根在x、y和z轴上的位置高度稳定，从而能够在数小时内连续获取时间序列共聚焦图像堆栈。分生组织细胞持续增殖，表现为前前期带的形成（图2D，绿色箭头）、有丝分裂纺锤体（图2D，白色箭头）以及成膜体（图2D，蓝色箭头）。与培养在培养皿中的幼苗类似，成像室中完全伸长的根细胞开始形成根毛（图2A、图2D，箭头末端），进一步表明在成像室中根的发育进程正常。为了获得较宽的视野，图2D中的图像使用20x/0.7 NA物镜获取。同时，也可使用高数值孔径的63x/1.2 NA水浸物镜对侧根进行高分辨率成像（图2E）。
在成像室中，侧根的生长可持续长达三天。
为了探究成像室能够以生理速率支持侧根生长的时间长度，分别在成像室（n = 27）和培养皿（n = 33）中测量了侧根长度，时间点为0 h、24 h、48 h和72 h。所选的根在0 h时长度均短于200 µm，成像室中侧根的平均长度为117 µm，培养皿中为121 µm。由于较短的根平均生长速度较慢（图2C），它们较少生长至琼脂块边缘，因而更易于成像。在前48 h内，成像室与培养皿中所有侧根的平均生长速度无显著差异（图3A）。然而，在48 h至72 h期间，平均生长速度显著降低（图3A）。尽管成像室中侧根的生长速率在48 h后总体呈现下降趋势，但个体间的生长速率仍具有高度变异性（图3B、3C），这表明在完整的72 h生长周期内，存在一个可观的侧根子集，其在培养皿和成像室中的生长速率相当。在培养皿中生长的33条侧根中，有23条（69.7%）在72 h时达到的长度位于平均长度一个标准差范围内（介于927至3,163 µm之间，图3B，红色）。在成像室中的27条侧根中，有10条（37.0%）达到该区间内的长度（图3B，红色）。
成像室可轻松适用于较老的侧根、主根和下胚轴。
原始成像室设计的一个局限性在于，尽管刚性琼脂块提供了一定的机械阻力，但向重力性生长的根最终会穿透琼脂块，导致图像质量下降（图 4B以及超出高数值孔径物镜工作距离的生长，即使使用工作距离相对较长（0.3 mm）的63X/1.3 NA CS2物镜也是如此。幼小的侧根缺乏含有平衡石的柱细胞，因此无法进行向重力性生长。17 因此它们最初在成像室的盖玻片上平行生长（图 2E）。随着侧根的伸长以及柱细胞和平衡石的形成，侧根表现出逐渐增强的正向重力性，而主根从萌发开始就表现出强烈的重力反应。这使得主根可用于成像的时间仅限于几个小时之内，同时也严重限制了能够连续成像48小时或更长时间的侧根的初始长度。为克服这一限制，对培养室进行了改进，使其通过一层位于琼脂块表面的纤维素制赛璐玢膜作为穿透屏障，使根的生长保持与盖玻片平行。图4A）。最初使用1.5%琼脂块的尝试导致在前24小时内根生长受到抑制，可能是由于机械应力所致。随后测试了较低浓度的琼脂块，发现在含有0.8%琼脂和纤维素膜的培养室中，幼嫩侧根的生长速率在前48小时内与传统培养室中的生长速率无显著差异。在0–24小时期间，纤维素膜培养室与传统培养室中的平均根生长速率 242 µm 和 262 µm 分别为（p = 0.78，Student's t检验），持续24-48小时 330 µm 和 355 µm1 分别为（p = 0.67，Student's t-检验）；n = 12 和 n = 11。该设计有效防止了侧根向盖玻片外、琼脂中生长，同时允许对主根进行长达48小时的成像观察图 4C).
为了测试成像室是否可适用于根以外的其他器官，选择了拟南芥（Arabidopsis）下胚轴。下胚轴明显比根更粗，因此在传统成像室中，最上层的细胞会被挤压在盖玻片下，导致变形。因此，开发了一种使用中心带有椭圆形凹槽的凹面载玻片的替代设计（图4D）。在此配置中，将一块1 mm厚的琼脂（制备方法同上文2.2）放置于载玻片凹槽内，使其一端突出几毫米进入凹槽（图4D）。下胚轴置于载玻片凹槽上方，而根则置于水平部分上方。这样可确保幼苗通过根部固定在空间中，同时下胚轴不会被压扁。尽管成像室与培养皿中的生长速率未进行系统量化比较，但在成像室中的下胚轴仍表现出沿下胚轴向上迁移的纵向生长波，这一现象已有明确描述（图4E、4F）16。
<img alt="SuperFrost 载玻片上的种子萌发，显微镜图像；生长阶段 A-I 按顺序显示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：成像室的组装。所有细节均在正文中描述。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="根生长分析；延时图像、图表、荧光显微镜、生长速率比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：在成像室中生理条件下侧根的生长。（A）在成像室（左）和培养皿（右）中拟南芥侧根在25小时内的发育情况（持续光照，水平培养，同步成像）。比例尺 = 200 µm。（B）显示（A）中所示侧根在27小时内长度变化的曲线图（每1小时测量一次）。单个根的长度以灰色线条表示（培养皿和成像室中n = 23），平均长度以红色圆圈表示。误差线 = 1个标准差（SD）。红线为平均长度的线性拟合。（C）显示（B）中所有侧根的平均生长速率相对于其初始长度的曲线图。（D）表达NPSN12-YFP和RFP-TUB6的侧根在连续时间点获取的3D共聚焦图像堆栈的最大强度投影。插图：方框区域的放大图。绿色箭头：前期带；白色箭头：有丝分裂纺锤体；蓝色箭头：成膜体；箭头末端：根毛。（E）使用63X/1.2 NA物镜并以奈奎斯特采样（像素尺寸77 nm x 77 nm）从（D）所示转基因株系的幼嫩侧根获取的高分辨率图像的最大强度投影，时间为0 h和16 h；星号标记了各时间点的相同细胞；箭头指示在0 h至16 h之间发生分裂的细胞。比例尺 = 50 µm（A-C）；20 µm（E）。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="侧根生长分析，图表，柱状图，显微镜，成像室与培养皿对比，时间序列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：成像室中侧根的长期发育情况。（A）在成像室与培养皿中，连续三个24小时时间间隔内的平均绝对根生长量图示。n.s. 表示 p >0.05；*** 表示 p <0.001（学生t检验）。n = 33（培养皿）和 n = 27（成像室）。（B）显示在（A）中使用的所有根在连续时间点的侧根长度图示。红色：最终长度在培养皿上所有侧根平均值±1个标准差范围内的所有侧根（介于927至3163 µm之间）。（C）在72小时内连续时间点获取的侧根中质膜标记物NPSN12-YFP的代表性三维共聚焦图像的最大强度投影。比例尺 = 100 µm。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="根系生长分析；示意图、显微图像、纵向生长曲线图；细胞动态" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图4成像室可适用于其他植物器官。 (A-C) 用于主根的成像培养皿适配A成像室设计示意图。此设计与标准设计相同（图1) 有两个修改之处：MS 培养基平板中含有 0.8% 琼脂而非 1.5% 琼脂，且在琼脂与植物之间放置一层纤维素膜（红色），以防止植物长入琼脂中。B) 7天龄幼苗主根中质膜标记物NPSN12-YFP的代表性三维共聚焦图像堆栈在常规成像腔室中于0 h和48 h拍摄的XY（上图）和XZ（下图）最大强度投影。请注意，由于向重力性反应，根部向琼脂中生长。C) 七天龄幼苗主根中质膜标记蛋白NPSN12-YFP的代表性三维共聚焦图像堆栈的XY（上）和XZ（下）最大强度投影，分别在成像室中含纤维素膜条件下0 h和48 h拍摄。使用前，纤维素膜经80%乙醇灭菌，并浸泡于液体½ MS培养基中。注意根的向重力性生长被抑制，无法伸入琼脂内。D-F) 下胚轴成像用培养皿的改造。D) 下胚轴成像室设计示意图。在载玻片上两个黄色玻璃条之间制造一个灰色的聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane)）橡胶垫圈，形成凹腔。将一块厚度均匀的1.5%琼脂块（米色）放置在载玻片上，部分伸入凹腔内。成像室中充满PFD（蓝色）。将幼苗置于琼脂块上，使下胚轴位于凹腔内琼脂块的下斜区域，而根部置于琼脂块的水平部分。最后用盖玻片密封成像室。E) 对两日龄幼苗下胚轴中质膜标记蛋白NPSN12-YFP，在48小时内连续时间点采集的代表性三维共聚焦图像堆栈进行最大强度投影。F) 子叶下轴（如 E 中所示沿轴在 0 h 的相对位置）中单个细胞沿基部至顶端轴方向两个连续时间段内的纵向生长（E）。注意此前已描述的生长波沿下胚轴向上迁移的现象16. 比例尺 = 100 µm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶培养基上的植物根系生长；显微镜图像；研究根系发育过程。" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Movie 1"> 
视频 1： <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_1.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
<img alt="幼苗根系生长、显微图像、植物学研究、植物发育分析、细胞结构" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Movie 2"> 
视频 2： <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_2.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
<img alt="植物根部细胞结构的荧光显微镜图像，突出显示生长模式和细胞分裂。" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Movie 3"> 
视频 3： <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_3.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

本文介绍了一种简单的方法，利用高数值孔径物镜和全氟十氢化萘作为浸没介质，对根和下胚轴发育进行长达3天的高分辨率共聚焦延时成像。

植物发育的多个方面，例如侧根形态建成，发生在数天的时间尺度上。为研究其潜在的细胞和……

本成像系统的主要目标是利用共聚焦荧光显微镜，在亚细胞分辨率下对植物器官在数天内的发育过程进行观察。该方法有助于回答植物形态发生领域中的关键科学问题，例如：多细胞生物的细胞在器官形成过程中如何协调其生长与增殖模式？该技术的主要优势在于操作简便，无需依赖时间推移成像中常用的专业设备（如灌注系统）。我们最初是在阅读《新植物学家》（New Phytologist）上 Littlejohn 和 Love 发表的一篇论文时萌生了该方法的想法，该论文描述了全氟十氢萘在叶片组织成像中的优势。首先，使用玻璃切割器从一毫米厚的载玻片上切割出三毫米宽的玻璃条。然后，使用氰基丙烯酸盐胶水或双面胶带，将这些玻璃条固定在一张新的载玻片上，沿其宽度方向间隔约 45 毫米。另取一张尺寸相同的载玻片作为模具。用透气的PDMS胶体制作一个相同高度的垫圈。将第二张载玻片用少量无水乙醇润湿，然后将PDMS压在载玻片上，使其高度与玻璃条齐平。接着，用无水乙醇润湿刀片，并切除多余的 PDMS。此步骤至关重要，因为经乙醇润湿的工具不会粘附 PDMS。然后，将 PDMS 重新压平至与条带齐平的高度。然后，在PDMS中切割出用于容纳幼苗和琼脂块的腔体。为了获得一致的腔体尺寸，我们使用由透明塑料板自制的专用切割工具，但也可使用剃须刀片替代。接下来，修剪外缘部分，使垫圈厚度约为两毫米。现在，取一个没有PDMS垫圈的载玻片，将盖玻片架在两侧的玻璃条上。然后用移液枪向盖玻片下方的空间加入约1毫升温热的液态琼脂培养基，使其充满该空间。琼脂中可含有感兴趣的实验化合物。接下来，通过在离心管中振荡少量PFD使其与空气平衡。待琼脂凝固后，将约200微升PFD加入PDMS垫圈中，但不要完全充满。从琼脂块上取下盖玻片，并将其裁剪成适合PDMS凝胶垫圈孔洞的形状。在琼脂与垫圈壁之间留出 2 至 4 毫米的间隙。然后，用经空气平衡的 PFD 完全填充腔室。为了观察向重力性主根，可在琼脂板表面使用纤维素膜作为物理屏障。琼脂平板的硬度也需降低，使用0.8%琼脂而非1.5%琼脂。剪取一块与琼脂块尺寸相近的膜材料，用80%乙醇灭菌后，静置晾干。干燥后，将膜浸泡在液体培养基中，然后转移至琼脂表面。开始时，小心地将最多三株幼苗放置在琼脂上。幼苗的位置至关重要。子叶和下胚轴必须悬挂在琼脂边缘之外，漂浮在PFD中。幼苗之间必须留出空间，以利于生长。如果幼苗过大而无法完全放入培养 chamber 中，可能会出现卷曲现象。然后，使用与所选物镜匹配厚度的盖玻片封闭样品室。沿边缘轻轻按压，使盖玻片与玻璃条接触。再用另一块载玻片轻轻压下盖玻片，使其均匀地平放在两条玻璃条上。然后，使用沿长度方向对半剪开的微孔手术胶带固定盖玻片。现在，在成像前让样品静置约半小时。为将拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗装入培养腔做准备时，首先用70%乙醇对种子进行表面消毒。然后将种子种植在添加了补充成分的培养基上。在4摄氏度条件下对种植的种子进行2至4天的分层处理。随后，将种植的种子转移至22摄氏度环境中，在每日16小时光照周期下垂直培养。为了观察侧根，将植物培养7至10天，然后转移至成像室。在成像室中以生理速率生长的侧根每隔半小时记录一次。同时，在相同培养基的标准培养皿上培养侧根作为对照。两种实验条件下单条根的生长速率差异均较大，但变化范围在两种条件下相似。总体而言，生长速率随根长度增加而加快。在生长前27小时内，成像室中与培养皿中植物的生长速率无明显差异。两个组的侧根平均长度起始时相同。共表达质膜标记和微管标记的侧根在成像室中每隔一小时进行一次成像。根的位置非常稳定，可实现连续数小时的共聚焦成像。在整个实验过程中均观察到增殖的可视性指标。在分生组织细胞中，可以识别出前期带、有丝分裂纺锤体和成膜体。在三天内，成像室中的侧根生长与培养皿中的生长在前48小时内无显著差异，但在72小时时平均生长速率下降。然而，在72小时内，培养室中仍有相当比例的根以与平板上根系相近的速率生长。一旦熟练掌握，若一切顺利，可在15分钟内制备两个样品。该成像系统可用于研究药物处理的影响，但洗脱实验则需要其他更复杂的方法，如灌注系统。该技术在开发后，为研究植物形态发生过程中细胞事件提供了一种廉价且简便的方法，特别是用于探索细胞边缘以及空间需求在拟南芥侧根器官发生中的作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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