微流控装置在极小空间中研究尖端生长植物细胞的伸长能力

这种方法可以帮助回答植物细胞生物学领域的关键问题，例如尖端生长的植物细胞如何穿透细胞物理屏障。该技术的主要优点是能够获取高分辨率图像，在传统显微镜下以微米级间隙重建细胞的变形过程。要制作用于检查生长中的花粉管和苔藓质子的装置，首先制作大约 11 克的 PDMS，然后将其装入 4 英寸的模具中。

然后，在真空室中对模具脱气 20 分钟。接下来，在 65 摄氏度下固化模具 90 分钟。固化后，从模具上剥离 PDMS 层，并使用活检打孔工具打开 PDMS 内通道的检修孔。

接下来，将 PDMS 和 5 厘米的玻璃培养皿暴露在空气等离子体中 50 秒。为了密封微流体网络，将 PDMS 层压在玻璃皿上，并在 65 摄氏度下固化 30 分钟。为了制造专为根毛检查而设计的微型设备，需要加载两个模具并固化。

冲出通道孔时，请使用 2 毫米的冲头。将两层暴露于空气等离子体中 50 秒后，在立体显微镜下将它们（包括盖玻片）连接在一起。使用定制的对准器工具来完成此作。

将组件在烘箱中固化 30 分钟，以密封微流体网络。固化后，从装置中取出盖玻片，并将其转移到 5 厘米的玻璃皿中。在使用花粉管微型设备之前，请在真空室中脱气 20 分钟。

使用细尖微量移液器将生长培养基添加到雌蕊入口中。用相同的培养基加载其他孔。等待几分钟，让通道填满。

同时，将湿纸巾放入培养皿中，以帮助保持局部湿度。现在，从 T.fournieri 蓝色和白色的花朵中收集花粉粒。使用解剖针将谷物转移到柱头上。

接下来，纵向切割一厘米长的授粉样式，然后将切割样式插入微流控装置的入口。当用镊子将切割样式插入微流体装置的入口时，重要的是不要将样式握得太紧，因为它可能会损坏样式。然后，用胶带将盖子固定在培养皿上，并将培养皿转移到 28 摄氏度的培养箱中，必须在黑暗中放置 5 到 6 小时。

在层流罩下工作，首先对转基因 A.thaliana Columbia 种子进行消毒。将它们浸泡在清洁溶液中 5 分钟。然后，用高压灭菌的水彻底冲洗种子。

消毒后，将种子在 4 摄氏度的黑暗中存放 48 小时。几天后，在使用前对微型设备进行脱气 20 分钟。接下来，使用细头移液器将适当的生长培养基加载到设备的孔中，并等待几分钟，让溶液通过所有通道。

此外，将一些湿纸巾装在盘子上以保持湿度。现在，将准备好的种子转移到设备的入口中。然后，用胶带固定盖子，并将培养皿转移到 22 摄氏度的恒温箱中，并有常亮光。

使用前，请在紫外线下对微型设备消毒过夜。第二天，对微型设备进行脱气 20 分钟。脱气后，向微孔中加入适当的生长培养基。

当通道逐渐充满时，用一些高压灭菌的水包围微型设备以保持湿度。将一小块苔藓质子组织转移到微型设备的入口处。现在，在 25 摄氏度的连续光照下培养设备。

生长 2 到 3 周后，在显微镜下拍摄结果的明场图像。尖端生长的植物细胞在体内的生长路径上会遇到一系列物理障碍，例如在传输道和小孔处，更不用说根毛在土壤中的路径了。所提出的微流体体外细胞培养平台能够检查三种类型的植物细胞、花粉管、根毛和苔藓质子中的尖端生长过程。

通过设备中 1 微米的间隙完成查看。因为这种尺寸的微缝很脆弱，有时它们会闭合，尤其是在重复使用后。因此，在进行实验之前验证间隙是否完好无损非常重要。

对于花粉管研究，活细胞成像用于监测花粉管顶端区域的形态变化，以及营养细胞核和精子细胞在遇到极小空间时的变化。该技术发展后，为植物细胞生物学领域的研究人员在极小的空间内探索尖端生长的植物细胞（如花粉管、根毛和苔藓质子）的伸长能力铺平了道路。