开发微流控装置以研究尖端生长植物细胞在极小空间中的伸长能力

该方法有助于解答植物细胞生物学领域的一些关键问题，例如顶端生长的植物细胞如何穿透细胞物理屏障。该技术的主要优势在于能够获取高分辨率图像，从而在常规显微镜下重建细胞在微米级间隙中的形变过程。为了制备用于观察花粉管和苔藓原丝体生长的装置，首先制备约11克PDMS，并将其注入一个四英寸的模具中。

然后，将模具置于真空腔中脱气 20 分钟。接着，在 65 摄氏度下固化模具 90 分钟。固化完成后，将 PDMS 层从模具上剥离，并使用活检打孔工具在 PDMS 上打开通往通道的进样孔。

接下来，将PDMS和5厘米的玻璃培养皿暴露于空气等离子体中处理50秒。为密封微流控网络，将PDMS层按压到玻璃培养皿上，并在65摄氏度下固化30分钟。为制备用于根毛观察的微装置，需加载并固化两个模具。

打孔制备通道时，使用直径为两毫米的打孔器。将两层材料在空气中等离子体处理50秒后，在体视显微镜下将它们与盖玻片贴合在一起。使用定制的对准工具完成此操作。

将组装好的器件放入烘箱中固化30分钟，以密封微流控网络。固化后，从器件上取下盖玻片，并将其转移至一个5厘米的玻璃培养皿中。使用花粉管微装置前，需在真空腔室中脱气20分钟。

使用细尖微量移液器向柱头入口加入培养基。用相同的培养基加载其他孔。静置数分钟，使通道完全充满。

同时，将一张湿润的纸巾放入培养皿中，以帮助维持局部湿度。现在，从T.fournieri蓝白花中收集花粉粒。使用解剖针将花粉粒转移到柱头上。

接下来，将一段一厘米长的授粉后花柱纵向切开，然后将切开的花柱插入微流控装置的入口。用镊子将切开的花柱插入微流控装置入口时，应注意不要夹得过紧，以免损伤花柱。随后，用胶带将盖子固定在培养皿上，并将培养皿转移至28°C的培养箱中，在黑暗条件下孵育5至6小时。

在超净工作台内操作，首先对转基因拟南芥哥伦比亚（A.thaliana Columbia）种子进行灭菌。将种子在消毒液中浸泡五分钟，然后用高压灭菌水彻底冲洗。

灭菌后，将种子置于 4°C 黑暗条件下保存 48 小时。数天后，使用前对微装置抽气 20 分钟。接着，用细尖移液器将适量的培养基加入装置的孔中，并静置数分钟，使溶液流经所有通道。

此外，在培养皿中放入一些湿润的纸巾以保持湿度。然后，将一颗已准备好的种子放入装置的入口。接着，用胶带将盖子固定，并将培养皿转移至22°C、持续光照的培养箱中。

使用前，将微装置在紫外线下灭菌过夜。次日，对微装置脱气20分钟。脱气完成后，用适当的生长培养基加载微孔。

在通道逐渐充满液体的同时，将微装置周围放置一些经高压灭菌的水以维持湿度。将一小块苔藓原丝体组织转移至微装置的入口。随后，在25摄氏度及连续光照条件下培养该装置。

经过两到三周的生长后，在显微镜下拍摄结果的明场图像。在体内，顶端生长的植物细胞在其生长路径上会遇到一系列物理屏障，例如在花柱传递道中和胚珠微孔处，更不用说根毛在土壤中的生长路径。本研究所展示的微流控体外细胞培养平台可用于研究三类顶端生长植物细胞的生长过程：花粉管、根毛和苔藓原丝体。

通过设备上一微米的间隙进行观察。由于这种尺寸的微小间隙较为脆弱，有时会闭合，尤其是在重复使用后。因此，在进行实验前，验证间隙是否完好非常重要。

在花粉管研究中，采用活细胞成像技术来监测花粉管顶端区域在遇到极小空间时的形态变化，以及营养核和精细胞的响应。该技术建立后，为植物细胞生物学领域的研究人员探索顶端生长型植物细胞（如花粉管、根毛和苔藓原丝体）在极小空间中的伸长能力奠定了基础。