厚脑切片使用高尔基考克斯方法中成像神经元

该程序的总体目标是确定对啮齿动物大脑内神经元形态的有效治疗。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如啮齿动物大脑各个区域内神经元的正常和实验纵形态。该技术的主要优点是增加了识别和可视化完全包含在单个组织学样本中的标记神经元的可能性。

通过将新鲜小鼠大脑放入含有 17 ml Golgi-Cox 溶液的 20 mL 玻璃闪烁瓶中开始 Golgi-Cox 染色。避光并在室温下孵育 25 天。潜伏期过后，Cryo 将大脑放入 40 毫升蔗糖冷冻保护剂中以保护大脑，并在 4 摄氏度的黑暗中孵育 24 小时。

在蔗糖中孵育后，可以冷冻大脑以进行长期储存，或立即阻塞以进行切片，如视频的下一部分所示。如果冻结，将整个大脑浸入 200 毫升已在干冰上预冷的异戊烷中。然后将冷冻的大脑放入 50 毫升锥形管中，并在零下 80 摄氏度的黑暗中储存。

首先，从蔗糖中取出大脑。并使用剃须刀片切断小脑，在大脑剩余的尾端留下一个平坦的边缘，以阻止它进行切片。必须以精确的角度阻断大脑，以确保感兴趣的神经元完全包含在结果切片中。

例如，我们对大脑皮层锥体神经元使用完全垂直于喙尾轴的冠状平面。接下来，加热琼脂直至融化。然后让它冷却，直到它略高于它的熔点。

然后将大脑放入一个小的一次性称重皿中，尾端朝下。加入融化的琼脂以覆盖大脑。琼脂凝固后，修剪多余的部分，在大脑周围留下大约 2 到 4 毫升。

然后使用少量氰基丙烯酸乙酯将大脑粘合到振动切片机的舞台上，其尾端朝下。用足够的蔗糖冷冻保护剂填充振动切片机的舞台区域以覆盖大脑。然后以 400 到 500 微米的切片厚度切开大脑，具体取决于要检查的大脑区域。

使用小画笔，将脑切片放入含有网状底部插入物并预填充蔗糖 M 磷酸盐缓冲液的六孔组织培养板的孔中。切片时避光。切片完成后，将切片在 4 摄氏度的黑暗中孵育过夜。

使用网状底部插件，将脑切片转移到含有 5 毫升多聚甲醛磷酸盐缓冲液的新孔中。在摇杆上，在室温下避光缓慢移动，孵育 15 分钟。将切片转移到装有 5 毫升水的新井中，将它们清洗两次。

避光，在室温下以中等速度洗涤 5 分钟。接下来，将切片转移到含有 5 毫升氢氧化铵的新井中。在室温下避光缓慢摇动 15 分钟。

切片转移到装有 5 毫升水的新井中，将它们清洗两次。在摇床上，在室温下避光中以中等速度移动 5 分钟。将切片转移到含有 5 毫升稀释固定剂的新孔中 A.在室温下在黑暗中缓慢移动的摇床上孵育 25 分钟。

像以前一样在水中洗涤切片两次。用小画笔将切片放在显微镜载玻片上，然后用镊子和小纸巾去除多余的水和琼脂。确保在进行脱水步骤之前去除所有琼脂。

让切片在室温下避光风干。适当的干燥时间至关重要，应为每个实验室确定。时间太短可能会导致切片在脱水步骤中从载玻片上脱落，而时间过长可能会导致切片开裂。

干燥后，首先将玻片放入清除剂中 5 分钟。将玻片放入 100% 乙醇中 5 分钟。然后通过一系列降低的乙醇浓度，每次 2 分钟。

酒精系列结束后，将玻片放入水中 5 分钟。然后在 0.5% 甲酚紫的水中染色 7 分钟。按照甲酚紫染色，将玻片放入水中 2 分钟。

然后通过一系列增加酒精浓度的切片脱水，每次 2 分钟。然后在 100% 乙醇中洗涤两次，每次 5 分钟。放入清除剂中 5 分钟。

最后，加入无水封固剂，并在切片上放置盖玻片。让玻片在室温下在黑暗中水平干燥至少五天。要捕获包含感兴趣神经元的区域的高分辨率图像堆栈，首先在显微镜上选择 30X 1.05 NA 硅油浸物镜。

然后在载玻片上滴三到四滴硅油。将物镜放在载玻片上，确保物镜与油接触。在成像软件中对焦图像并调整相机设置，包括曝光和白平衡。

接下来，通过聚焦到该部分的顶部，然后在图像采集窗口中选择堆栈顶部的设置来设置图像堆栈的上限和下限。然后将焦点聚焦到该部分的底部，并选择堆栈底部旁边的 set。通过在图像采集窗口内图像之间的距离旁边输入 1 微米，将步距设置为 1 微米。

最后，通过在图像采集窗口中选择 acquire image stack 来捕获图像堆栈。重复上述步骤以捕获整个感兴趣区域，确保所有图像堆栈在 X 轴和 Y 轴上至少重叠 10%。这张大脑皮层图像是使用 10 倍物镜从 500 微米厚的切片上获取的图像堆栈的合并 Z 投影。

该图像中的组织是使用主要的 all fresh 方案处理的。使用 30 倍硅油浸物镜对红色方块指示的区域进行成像，并获得了更高分辨率的合并 Z 投影图像堆栈。红色箭头显示了从高分辨率 30X 图像堆栈中追踪的神经元的二维 Z 投影。

这里使用了具有甲酚紫染色的新鲜方案变体。这张更高分辨率的图像显示了甲酚紫染色的切片。这就是获得的神经元追踪。

最后，使用协议变体处理该组织，其中大脑在 Golgi-Cox 浸渍后被冷冻。在这里，以前冻结的组织以更高的分辨率看到。并再次获得神经元追踪的高质量二维 Z 投影。

该技术可以在一个月内完成，处理和成像步骤在最后一周内完成。也可以在 Golgi-Cox 浸渍后冷冻大脑，以便在以后完成处理和成像。按照此程序，神经科学家可以使用捕获的图像进行详细的形态学分析，例如树突复杂性或脊柱密度，以确定实验作如何改变大脑内神经元的结构。