使用高尔基-考克斯法对厚脑切片中的神经元进行成像

本实验的总体目标是确定对啮齿类动物大脑内神经元形态的有效处理方法。该方法有助于回答神经科学领域中的一些关键问题，例如啮齿类动物大脑不同区域中神经元的正常形态以及经实验干预后的形态变化。该技术的主要优势在于提高了识别和观察标记神经元的概率，这些神经元完整地位于单个组织学样本内部。

开始高尔基-考克斯染色，将新鲜的小鼠脑组织放入含有17毫升高尔基-考克斯溶液的20毫升玻璃闪烁瓶中。避光，室温孵育25天。孵育期结束后，将脑组织转入40毫升蔗糖防冻剂中进行防冻保护，并在4摄氏度避光孵育24小时。

在蔗糖中孵育后，脑组织可冷冻以长期保存，或立即进行切块处理以备切片，具体操作如视频下一节所示。若需冷冻，请将整个脑组织浸入200毫升已用干冰预冷的异戊烷中。随后将冷冻后的脑组织放入50毫升锥形管中，于-80°C避光保存。

首先，将脑组织从蔗糖溶液中取出，并使用剃刀片对其进行修块以便切片，切去小脑部分，使剩余脑组织的尾端形成一个平整的切面。脑组织必须以精确的角度进行修块，以确保目标神经元完全包含在最终获得的切片中。

例如，我们使用一个与头尾轴完全垂直的冠状面来处理大脑皮层的锥体神经元。接下来，加热琼脂直至完全融化，然后冷却至略高于其熔点的温度。

然后将脑组织放入一个小的一次性称量皿中，尾端朝下。加入熔化的琼脂以完全覆盖脑组织。待琼脂凝固后，修去多余部分，保留脑组织周围约2至4毫升的琼脂。

然后取少量氰基丙烯酸乙酯将脑组织粘附于振动切片机的载物台上，使脑的尾端朝下。向振动切片机的载物区域加入足量的蔗糖防冻剂，以完全浸没脑组织。随后根据待观察的脑区，以400至500微米的切片厚度对脑组织进行切片。

使用小号画笔将脑组织切片放入六孔细胞培养板的孔中，该孔内含有网状底部插件，并已预先加入蔗糖-M-磷酸盐缓冲液。切片过程中需避光。切片完成后，在4摄氏度下避光孵育过夜。

使用带网底的插入物，将脑切片转移至含有5 mL磷酸盐缓冲液中4%多聚甲醛的新孔中。在室温避光条件下，以低速摇床孵育15分钟。通过将切片转移至含有5 mL水的新孔中，清洗两次。

避光，室温下以中等速度洗涤五分钟。随后将切片转移至含有五毫升氢氧化铵的新孔中，室温避光缓慢摇动十五分钟。

将切片转移至含有5 mL水的新孔中，清洗两次。在室温避光条件下，以中等速度在摇床上清洗5分钟。将切片转移至含有5 mL稀释固定液A的新孔中，在室温避光条件下，以低速在摇床上孵育25分钟。

将切片按前述方法用水清洗两遍。用小号画笔将切片转移至载玻片上，然后用镊子和小片滤纸吸去多余的水和琼脂。在进行脱水步骤前，务必确保完全去除所有琼脂。

将切片置于室温下避光自然干燥。适当的干燥时间至关重要，各实验室应根据自身条件确定最佳时间。干燥时间过短可能导致切片在脱水步骤中从载玻片上脱落，而时间过长则可能导致切片出现裂纹。

干燥后，先将载玻片放入透明剂中处理五分钟。将载玻片置于100%乙醇中五分钟。随后依次经过浓度递减的乙醇系列，每级乙醇中各放置两分钟。

经过酒精系列处理后，将切片置于水中5分钟。然后用0.5%的焦油紫水溶液染色7分钟。焦油紫染色后，将切片再放入水中2分钟。

随后将切片依次浸入浓度递增的酒精中，每种浓度处理两分钟。然后用100%乙醇洗涤两次，每次五分钟。再置于透明剂中五分钟。

最后加入无水封片剂，并在切片上加盖盖玻片。将载玻片置于室温避光环境中水平干燥至少五天。为获取包含目标神经元区域的高分辨率图像堆栈，首先在显微镜上选择30X 1.05 NA硅油浸没物镜。

然后在载玻片上滴加三到四滴硅油浸油。将物镜置于载玻片上方，确保物镜与油滴接触。聚焦图像，并在成像软件中调整相机设置，包括曝光和白平衡。

接下来，通过将焦距调至切片顶部，然后在图像采集窗口中选择“图像栈顶部”旁边的“设置”，以设定图像栈的上边界。再将焦距调至切片底部，选择“图像栈底部”旁边的“设置”，以设定下边界。在图像采集窗口中，于“图像间距离”旁输入1 µm，将步进距离设为1 µm。

最后，在图像采集窗口中选择“采集图像堆栈”以获取图像堆栈。重复前述步骤，以覆盖整个目标区域，确保所有图像堆栈在X轴和Y轴方向上至少有10%的重叠。该大脑皮层图像为使用10倍物镜对500微米厚切片采集的多个图像堆栈合并生成的Z轴投影图像。

本图像中的组织采用主要的全新鲜方案进行处理。使用30倍硅油浸没物镜对红色方框指示的区域进行成像，并获取了高分辨率融合Z投影图像序列。红色箭头显示的是从高分辨率30倍图像序列中追踪得到的一个神经元的二维Z投影。

此处采用了经改良的新实验方案，结合焦油紫染色法。该高分辨率图像显示经焦油紫染色的切片结果。此图为获得的神经元示踪图像。

最后，该组织采用了一种改良方案进行处理，即在高尔基-考克斯浸渍后将脑组织冷冻。此处显示的是先前冷冻组织的更高分辨率图像。再次获得了神经元追踪的高质量二维Z轴投影图像。

该技术可在一个月内完成，其中处理和成像步骤在最后一周内完成。 alternatively，脑组织在经过Golgi-Cox浸渍后可进行冷冻保存，以便在后续时间再进行处理与成像。通过该方案，神经科学家可利用所获取的图像进行详细的形态学分析，例如树突复杂性或树突棘密度分析，以确定实验干预如何改变脑内神经元的结构。