Name: 基于形态学度量大规模重建和独立，公正聚类分类神经元选择性人群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 学习利用改良狂犬病毒标记神经元并进行大规模形态学重建与无偏聚类分析的方法。该技术可实现神经元亚型的公正分类，为神经解剖学研究提供可靠的数据采集与分析框架。

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我们感谢Ed Callaway博士和Marty Usrey博士允许我们使用先前研究中制备的组织，感谢Libby Fairless和Shiyuan Liu在神经元重建方面的帮助。本工作由美国国立卫生研究院（NEI：EY018683）和Whitehall基金会资助。

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<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Research. 171, 11-28 (1979).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

神经解剖学研究一直是神经科学的支柱，近年来人们对连接组学及结构-功能关系的兴趣重新激发了对特定神经元群体进行精细形态学表征的热情。传统上，神经解剖学研究依赖于专家级神经解剖学家对神经元进行定性分类，将其划分为形态上不同的神经元类别。随着神经元重建技术和形态数据提取方法的进步，现在可以采用更复杂且定量的数据分析方法，以无偏倚的方式对形态上不同的神经元类别进行分类。本研究逐步介绍了以下方法：1）利用病毒介导的逆行标记方法选择性地标记数百个单个神经元；2）系统地重建数百个单个神经元，以形成特定神经元群体内全面且具有代表性的样本；3）进行独立的聚类分析并结合统计评估，基于形态学指标确定特定神经元群体内的最优聚类。通过将不同的聚类方法应用于已有的丘脑网状核（TRN）神经元数据集，验证了这些分析方法的有效性。我们基于三种独立的评估方法证明，TRN神经元最优地聚类为三个形态上 distinct 的亚群。
本研究所述方案的一个主要优势在于其灵活性。缺失G蛋白的狂犬病毒在注入目标结构后，已证明可有效驱动数百个逆向标记神经元中的EGFP表达。相同的狂犬病毒株在多种物种中同样有效，包括猕猴<sup cl...

神经解剖学是神经科学的基础之一1，近年来对&#34;连接组学&#34;的兴趣重新激发了人们理解神经元群体形态多样性以及特定神经元之间连接关系的热情2。随着新技术的发展，包括基于遗传学和病毒介导的环路示踪方法在内的神经元标记与重建技术已显著改进3,4，使得对神经元群体进行更全面的形态学研究成为可能5。除了单个神经元标记技术的进步，还涌现出一系列定量数据分析方法，能够基于形态学数据对神经元进行独立且无偏倚的分类，将其划分为不同的亚群5,6。这些无偏倚方法相较于传统定性分类方法是一大进步，后者在过去一个多世纪中一直是该领域的标准。本研究旨在逐步阐述一种综合方法：针对特定神经元群体，采用病毒介导的标记技术，对其中大量神经元进行系统性重建，并基于独立聚类分析和统计评估进行定量数据分析。通过整合这些方法，我们提出了一种新颖的神经解剖学数据采集与分析策略，以促进对特定神经元群体中形态独特神经元类型的全面取样和无偏倚分类。
作为这些方法的一个示例，我们描述了对猕猴丘脑网状核（TRN）单个区域中大量神经元群体的分析。这些数据来自之前的一项研究7。文中概述了通过手术注射编码EGFP的改良狂犬病毒，以特异性标记投射至丘脑背外侧膝状体核（dLGN）的TRN神经元的方法4,8（见特定材料/设备列表第2行）。这种改良的狂犬病毒缺失编码关键衣壳蛋白的基因，从而阻断了病毒的跨突触传播。当病毒进入注射部位的轴突末梢后，其行为类似于传统的逆行示踪剂，但具有一个重要的优势：可在被感染神经元的完整树突分支中驱动EGFP的表达5,9,10。因此，这种G基因缺失型狂犬病毒可在注射并经逆行运输后，用于特异性感染和标记任意神经元群体。
为了对特定神经元群体进行综合分析，重要的是要从该群体内广泛分布的神经元中进行取样。由于病毒介导的标记技术可实现完整的细胞内标记， &#34;高尔基体样&#34; 在病毒注射位点处，许多神经元的轴突被填充，从而可以在脑结构的整个范围内重建大量神经元样本。此外，由于改良的狂犬病毒在感染和标记大量神经元方面效果显著，每只动物可实现数百个神经元的重建。在整个丘脑网状核视觉区采样160个神经元的操作流程11 为获得投射至背外侧膝状体（dLGN）的丘脑网状核（TRN）神经元的全面样本，本文概述了相关流程。描述了使用神经元重建系统（包括显微镜、相机和重建软件）对单个神经元进行重建的过程。同时介绍了确定单个神经元在脑结构内位置（本例中为TRN内）的方法，以及利用体积轮廓重建技术验证病毒注射位点在结构内（本例中为dLGN内）的位置与体积的方法。本文还概述了导出形态学数据并基于每个神经元测量的形态学参数进行独立聚类分析的步骤。聚类方法存在局限性，且存在多种不同的聚类算法。因此，文中阐述了这些可选方案以及若干常用算法的优势。聚类分析本身无法提供对聚类独特性的统计学验证，故本文进一步概述了验证最优聚类结果以及簇内与簇间形态学数据关系的附加步骤。最后，描述了针对TRN数据集的统计学方法，以确认TRN神经元可根据10项独立的形态学参数被划分为三个独特的聚类群。
因此，通过概述对特定神经元群体的选择性标记、形态数据重建与分析步骤，我们描述了量化同一群体内神经元之间形态学差异的方法。通过对猕猴丘脑网状核视觉区中不同神经元类型的先前发现进行独立的统计学评估，进一步验证了这些结果。我们希望，这些技术可广泛应用于神经解剖学数据集，并有助于建立全脑范围内神经元群体多样性的定量分类体系。

<table><tbody><tr><td>SAD&amp;Delta;G-EGFP</td><td>E.M. Callaway 实验室，索尔克研究所</td><td></td><td>由 F. Osakada 博士制备。经索尔克研究所病毒核心实验室提供缺失 G 蛋白的狂犬病病毒</td></tr><tr><td>记录电极：铂/铱或钨</td><td>FHC</td><td>UEPSGGSE1N2M</td><td>访问网站（www.fh-co.com）了解其他订购规格</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummod Scientific</td><td>3-000-204，110 V</td><td>替代方案：picospritzer、Hamilton 注射器</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5905-50TAB</td><td>3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐，片剂，每片含10 mg底物。注意：致癌物——废弃前必须漂白处理</td></tr><tr><td>细胞色素C</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2037-100MG</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322-5G</td><td></td></tr><tr><td>兔抗GFP</td><td>Life Technologies/Thermo Fisher</td><td>#A-11122&amp;nbsp;</td><td>一抗</td></tr><tr><td>生物素标记的山羊抗兔</td><td>Vector Laboratories</td><td>#BA-1000</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Neurolucida 系统&amp;nbsp;</td><td>MicroBrightField</td><td></td><td>用于神经元追踪与分析的软件。http://www.mbfbioscience.com/neurolucida</td></tr><tr><td>Neurolucida Explorer</td><td>MicroBrightField</td><td></td><td>数据导出软件</td></tr><tr><td>Microfire 相机&amp;nbsp;</td><td>奥普特罗尼克斯</td><td></td><td>200万像素真彩显微镜相机。http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf</td></tr><tr><td>尼康E800显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td></td><td>生物研究显微镜。http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>基于矩阵的计算数学软件。http://www.mathworks.com</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>微软</td><td></td><td>电子表格程序</td></tr></tbody></table>

基于形态学指标的大规模重建及无偏独立聚类以分类特定神经元群体

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

本方案概述了结合大规模神经元重建与独立且无偏倚的聚类分析方法，以对特定神经元群体中观察到的形态学特征进行全面系统的研究。这些技术的结合构成了一种收集和分析神经解剖学数据的新方法。这些技术共同实现了对特定神经元群体的大规模、因而更全面的采样，并建立了无偏倚的定量方法，用于描述群体中形态学上独特的神经元类别。
该方案概述了使用改造的狂犬病毒选择性标记神经元的方法。将缺失G蛋白的狂犬病毒通过立体定位注射至目标脑区后，其可作为逆行示踪剂，并作为载体将EGFP递送至神经元并实现表达。利用该技术可感染大量神经元，使其在整个树突中表达GFP，从而产生 &#34;高尔基体样&#34; 单个神经元的完整填充。因此，病毒介导的逆向示踪方法通过实现完整的细胞内填充，改进了传统的染料基逆向示踪技术。
为了获得具有代表性的神经元样本，需在所研究的脑区各个区域中选择单个分离良好的神经元进行重建。本方案概述了对跨越多个组织切片的标记神经元的胞体及完整树突分支模式进行重建的操作步骤。提取每个神经元在脑结构中的位置等形态学数据，用于后续分析。采用标准编程函数，基于形态学指标进行独立的聚类分析及聚类评估。为验证这些分析方法的有效性，对在猕猴丘脑网状核（TRN）中重建的160个神经元所进行的聚类分析进行了统计学评估。原始聚类分析及本研究中的统计评估结果均表明，TRN神经元可分为三个亚群，每个亚群具有独特的形态学特征。

我们先前已证明，在向dLGN注射改良的狂犬病毒后，对特定神经元群体进行大规模重建是可行的5最近，同一组织被用于重建丘脑网状核视觉区的160个神经元（Bragg 等，正在审稿中； 图2A-B) 按照上述详细的方法步骤进行。在丘脑网状核（TRN）研究中，基于10项形态学指标的独立聚类分析，鉴定出三类独特的TRN神经元集群：胞体面积、胞体圆度、相对于TRN中心的内外侧位置、TRN内的背腹侧位置、树突树的数量、树突到节点的平均距离、3级树突的平均长度rd 以及高级树突，平均角度为1st 一级树突数量、总树突分支的平均相位角以及总树突分支的角度偏差。TRN神经元在这三个聚类中分布相当。图2C）。对三个聚类中所有10项形态学指标进行独立的统计学比较，结果显示，除原始聚类分析中包含的两项形态学指标外，其余各项指标在聚类间的差异均具有统计学显著性。因此，基于聚类分析生成的层次聚类树状图（图2C根据形态学指...

本方案描述了通过表达荧光标记物的改良型狂犬病毒进行逆向感染标记后，对特定神经元群体进行的大规模重构，以及独立且无偏倚的聚类分析，从而实现对不同神经元亚类之间形态学参数的全面表征。

本方案概述了结合使用独立且无偏倚聚类分析的大规模神经元重建，以构建……

本方案的目标是描述重建病毒标记神经元形态的步骤，并对标记的神经元群体进行独立、无偏倚的聚类分析，从而实现对不同神经元亚类中形态学参数的全面表征。我们提出了一种新颖的方法，用于收集和分析神经解剖学数据，以促进对特定神经元群体中形态独特的神经元类型进行更全面的采样和无偏倚分类。该技术的主要优势在于能够实现神经元形态的大规模分析，并采用无偏倚的方法对不同的神经元亚类进行分类。形态学重建最具挑战性的方面包括：选择出清晰分离的神经元用于重建，确定正确的 z 轴深度，以及对齐树突以在相邻组织切片间连续完成重建。开始重建时，选择一张载玻片，其上含有经立体定位注射表达 EGFP 的改良型狂犬病毒后染色的灵长类 50 微米脑组织切片。将载玻片放入显微镜载物台夹持器中，使用低倍物镜聚焦于感兴趣的单个区域。确保通过正确调整相机快门位置，使相机图像在实时图像中可见。在目标脑结构内选择一个标记清晰且相对孤立的神经元，以便明确重建树突分支。切换至10倍放大倍数，并将该区域调至清晰对焦。优先选择细胞体完全位于单一切片内的神经元，以准确估算其面积和圆形度。选定一个染色良好且孤立的神经元后，点击软件中的“新建切片”按钮，将包含该细胞体的主切片添加至切片管理器。输入用于重建的切片数量。建议先插入两到三个切片。设定切片厚度为 50 微米。选择 2 倍物镜，然后点击顶部工具栏中的轮廓按钮，并从下拉菜单中选择轮廓类型。使用鼠标沿目标结构的轮廓点击以描摹其轮廓。完成轮廓描摹后，右键单击鼠标，从菜单中选择“闭合轮廓”以闭合该轮廓。接着，在视图仍保持在两倍放大状态下，单击左侧工具栏中所需的标记符号。然后点击目标结构的中心以放置标记。完成轮廓绘制后，选择40x或60x物镜来描记细胞体的轮廓。接着点击顶部工具栏中的神经元追踪按钮，并从下拉菜单中选择需要追踪的神经元结构，在本例中为细胞体。通过在细胞体最大范围周围点击点来勾画细胞体轮廓，必要时调整 z 轴深度，使细胞体处于清晰对焦状态，然后单击鼠标右键完成细胞体轮廓的绘制。接下来，在细胞体轮廓中心放置一种不同样式的标记，确保该标记在 z 轴深度方向上大致位于中心位置。在开始每次追踪之前，必须在起始区域及其相邻区域准确定位正确的 z 轴深度，以确保 z 轴数值的准确性。要开始追踪树突分支，从顶部下拉菜单中选择“dendrite”。然后从细胞体开始追踪每一条树突。当树突发生分支时，单击鼠标右键，选择“分叉节点”或“三分叉节点”，在该分支点处放置一个节点。在追踪过程中，务必持续调整 z 轴深度，以准确捕捉树突的角度和走向。在此区域的树突末端，右键单击鼠标，然后从下拉菜单中选择“ending”。当在主区域中完成所有树突分支的追踪后，识别那些可能延伸至相邻区域的树突末端，并在20倍镜图像中将这些末端调整至合适的z轴深度以获得清晰对焦。在显微镜图像中包含附近的显著解剖标志，例如血管或易于识别的树突形态或束状结构。随后，使用数码相机对计算机屏幕上的实时图像进行拍摄。然后将显微镜物镜切换至2倍，移动载玻片至相邻区域。然后在软件视图中将先前绘制部分的轮廓与新切片中LGN和TRN的边界对齐。返回20倍物镜，利用解剖标志进行校准。接着，参考先前绘制切片中树突末端的照片，使用箭头工具选中重建结构，移动 tracing 以使树突对齐。然后右键单击，从下拉菜单中选择“移动”，并相应地移动描图。要旋转描图，请右键单击，从下拉菜单中选择“旋转”，并相应地旋转描图。或者，从顶部工具下拉菜单中选择匹配工具，并选择要匹配的点数。然后点击重建图像中的末端，并在实时图像中选择相应的延续点，以将树突末端与起始点匹配。当上一节的追踪与新一节中的树突对齐后，像之前一样在切片管理器中添加一个新的切片。或者，直接选择先前创建的相邻切片，并以相同方式调整 z 深度。通过单击当前部分，在部分管理器中确保已选中相应的新部分。然后，将放大倍数增加至 40x 或 60x 后，使用箭头选择树突。在上一节树突末端处单击鼠标右键，从下拉菜单中选择“添加至末端”。系统将提示您确认该延续是否位于新片段中。单击“是”。然后使用鼠标作为绘图工具，追踪树突的延续部分。拍摄末端图像，以备与下一部分进行对齐。随后继续延伸树突追踪，直至完成至少三个连续切片的追踪，或直至无法继续追踪或找到树突为止。使用与神经元重建系统配套的提取程序，打开已完成的重建文件。从编辑下拉菜单中选择“全选对象”。从顶部分析工具栏中选择“分支结构分析”，然后依次点击各个选项卡，并在每个选项卡中选择所需的分析选项。点击分析窗口中的“确定”按钮以提取所有所需数据，然后通过右键单击输出窗口并选择“导出到Excel”，将数据保存为电子表格格式以进行后续分析。这张照片显示了一只动物背侧外侧膝状体（LGN）的单个冠状切面。细胞色素氧化酶染色用于显示LGN的分层结构，而GFP染色则标记了病毒注射部位。箭头指示丘脑网状核神经元中密集的逆向标记区域。切片方向依据图中所示的背侧-腹侧-内侧-外侧方位标确定。比例尺位于左下角。该图像以红色显示外侧膝状体核（LGN）的轮廓，以栗色显示丘脑网状核（TRN）的轮廓，适用于所有包含病毒注射的切片，黑色轮廓指示注射区域。黄色星号表示注射位点的中心。该图像展示了轮廓及注射位点的三维重建。这是根据单个聚合的丘脑网状核（TRN）轮廓内聚类分配情况，以不同颜色标记重建的TRN神经元位置的分布图，该聚合轮廓以深红色显示。比例尺代表500微米。该图像显示了TRN的聚合轮廓（黑色）和外侧膝状体核（LGN）的轮廓（灰色），以及五个重建的TRN神经元，其颜色从暖色到冷色表示它们在TRN内从内侧到外侧的位置。比例尺代表500微米。这些照片显示了相同的五个TRN神经元的细节，颜色匹配的比例尺代表100微米。该分层树状图基于10项独立的形态学指标，展示了160个重建的TRN神经元之间的连接距离，并呈现了聚类分析的整体结果。图中以蓝色、绿色和红色标示了三组不同的丘脑网状核（TRN）神经元。掌握这些神经元重建技术后，可在一至两小时内完成单个神经元的完整重建。在重建神经元过程中，持续监测并调整z轴深度至关重要。本文所述方案是对传统且更具偏倚性的神经解剖学分析方法的改进，可使研究人员基于大规模形态学数据探索神经元的新亚类。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过相邻组织切片重建神经元，并提取形态学数据以供进一步分析。

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