基于形态学度量大规模重建和独立，公正聚类分类神经元选择性人群

这个协议描述以下具有修饰的狂犬病毒表达荧光标记物，以及独立的，公正的聚类分析，使不同的神经元亚类之间的形态度量的全面表征逆行感染选择性神经元群体的大规模重建，进行标记。

该协议的目标是描述重建病毒标记神经元形态的步骤，并对标记神经元群进行独立、无偏倚的聚类分析，以实现不同神经元亚类的形态学指标的全面表征。我们概述了一种收集和分析神经解剖学数据的新方法，以促进对选择性神经元群中形态学独特的神经元类型进行更全面的采样和无偏分类。该技术的主要优点是它能够对神经元形态进行大规模分析，并利用无偏倚的方法对不同的神经元亚类进行分类。

形态学重建最具挑战性的方面是选择分离良好的神经元进行重建，分配适当的 z 深度，并对齐乔木以继续跨相邻组织切片重建。通过从立体定向注射表达 EGFP 的改良狂犬病病毒的灵长类动物中选择带有染色 50 微米脑组织切片的载玻片来开始重建。将载玻片放入显微镜载玻片架中，并使用低放大倍率物镜聚焦于感兴趣的单个部分。

通过正确定位摄像机快门，确保摄像机图像在实时图像中可见。在感兴趣的大脑结构中选择一个合理孤立的标记神经元，以实现树突状树枝化的明确重建。切换到 10 倍放大倍率并聚焦该区域。

如果细胞体完全位于单个切片内，则优先选择神经元，以准确估计其面积和圆度。选择染色良好、分离良好的神经元后，单击软件中的新建部分按钮，将包含细胞体的主部分添加到部分管理器中。输入要包含在重建中的截面数。

建议插入 2 到 3 个部分以开始。指定 50 微米的截面厚度。选择两个 x 物镜，然后单击顶部工具栏中的等值线按钮，并从下拉菜单中选择等值线类型。

通过使用鼠标单击沿轮廓的点来跟踪目标结构的轮廓。完成轮廓跟踪后，右键单击鼠标并从菜单中选择 close contour 以闭合轮廓。接下来，在视图仍为 2 x 的情况下，单击左侧工具栏上所需的标记符号。

然后单击目标结构的中心以放置标记。轮廓完成后，选择 40 倍或 60 倍物镜以追踪细胞体的轮廓。然后选择顶部工具栏上的神经元追踪按钮，并从下拉菜单中选择要追踪的神经元结构，在本例中为细胞体。

通过单击单元体最大范围周围的点来追踪单元体，根据需要调整 z 深度以聚焦单元体。并右键单击鼠标以完成单元体轮廓。接下来，在单元格体轮廓的中心放置一个不同的样式标记，确保标记大致位于 z 深度的中心。

在开始每个描摹之前，在 home 部分以及相邻部分建立正确的 z 深度至关重要，这样 z 轴值才能准确。要开始追踪树枝状乔木，请从顶部下拉菜单中选择树枝状。

然后从细胞体开始追踪每个树突。当树突分支时，右键单击鼠标并选择分叉节点或三分叉节点以在此分支点放置节点。请务必在整个描摹过程中调整 z 深度，以准确捕捉树突的角度和方向。

在此部分的树突末尾，右键单击鼠标并选择 ending 从下拉菜单中。当所有树枝状乔木都在整个部分被追踪时，确定那些可能会继续延伸到相邻部分的树突末端。并以 20 倍的显微镜图像中适当的 z 深度聚焦这些图像。

在显微镜图像中包括附近的主要标志，例如血管或易于识别的树突图案或束。接下来，使用手持电脑屏幕上的数码相机拍摄实时图像的照片。然后将显微镜物镜切换到 2 x 并移动到载玻片上的相邻部分。

然后将软件视图中先前追踪的截面的轮廓与新截面中 LGN 和 TRN 的边界对齐。返回到 20 倍并使用地标对齐。然后，借助先前描摹部分的枝晶末端照片，首先使用箭头工具选择重建，移动描摹以对齐树突。

然后右键单击并选择 移动 从下拉菜单中并相应地移动跟踪。要旋转描摹，请右键单击并从下拉菜单中选择 rotate，然后相应地旋转描摹。或者，从顶部工具下拉列表中选择匹配工具，然后选择要匹配的点数。

然后单击重建中的结尾和实时图像中相应的延续点，以将树突结尾与开头匹配。将上一节的描摹与新章节中的树突对齐后，像以前一样将新章节添加到章节管理器中。或者，只需选择之前创建的相邻截面，然后以相同的方式调整 z 深度。

通过单击当前部分，确保在部分管理器中选择了相应的新部分。然后，将放大倍数增加到 40 倍或 60 倍后，使用箭头选择枝晶。右键单击上一节中树突的末尾的鼠标，然后从下拉菜单中选择 Add to endend。

系统将提示询问续集是否位于新部分中。单击 Yes。然后使用鼠标作为绘制工具来跟踪树突的延续。

拍摄结尾的图像，以便与下一部分保持一致。然后在树突状描记中添加延续，直到至少追踪到神经元的三个部分，或者直到无法再跟踪或找到树突。使用与神经元重建系统关联的提取程序，打开完成的重建文件。

从 edit 下拉菜单中，选择 select all objects.从顶部分析工具栏中选择分支结构分析，然后单击每个选项卡并在每个选项卡中选择所需的分析选项。通过单击分析窗口中的 OK 按钮提取所有需要的数据，并通过右键单击输出窗口并选择 export to Excel for further analysis 以电子表格格式保存。

这张照片显示了穿过一只动物背侧 LGN 的单个冠状切片。细胞色素氧化酶染色用于可视化 LGN 层。GFP 染色标记病毒注射部位。

箭头表示密集的、逆行标记的丘脑网状核神经元区域。切片方向根据所示的背腹内侧外侧罗盘。比例尺显示在左下角。

该图像显示了所有包含病毒注射的切片的红色 LGN 和栗色 TRN 的轮廓，如黑色等值线所示。黄色星号表示注射部位的中心。该图显示了轮廓和注射部位的 3D 渲染。

这是一张重建的 TRN 神经元位置图，根据栗色显示的单个聚集 TRN 等值线内的簇分配进行颜色编码。比例尺代表 500 微米。该图像显示了黑色 TRN 和灰色 LGN 的聚集轮廓，其中五个重建的 TRN 神经元根据它们在 TRN 内的内侧侧位置呈暖色到冷色。

比例尺代表 500 微米。这些照片显示了相同的五个 TRN 神经元的细节，颜色匹配的比例尺代表 100 微米。这个分层树状图树基于 10 个独立的形态指标说明了 160 个重建的 TRN 神经元之间的连锁距离，并显示了聚类分析的总体结果。

三个不同的 TRN 神经元簇以蓝色、绿色和红色表示。一旦掌握了这些神经元重建技术，就可以在 1 到 2 小时内完全重建单个神经元。在重建神经元时不断监测和调整 z 深度非常重要。

此处概述的协议是对传统的、更具偏见的神经解剖学分析方法的改进，使研究人员能够根据大规模形态学数据探索神经元的新亚类。观看此视频后，您应该对如何通过相邻组织切片重建神经元并提取形态学数据进行进一步分析有很好的了解。