基于形态学指标的大规模重建及无偏独立聚类以分类特定神经元群体

本方案的目标是描述重建病毒标记神经元形态的步骤，并对标记的神经元群体进行独立、无偏倚的聚类分析，从而实现对不同神经元亚类中形态学参数的全面表征。我们提出了一种新颖的方法，用于收集和分析神经解剖学数据，以促进对特定神经元群体中形态独特的神经元类型进行更全面的采样和无偏倚分类。该技术的主要优势在于能够实现神经元形态的大规模分析，并采用无偏倚的方法对不同的神经元亚类进行分类。

形态学重建最具挑战性的方面包括：选择出清晰分离的神经元用于重建，确定正确的 z 轴深度，以及对齐树突以在相邻组织切片间连续完成重建。开始重建时，选择一张载玻片，其上含有经立体定位注射表达 EGFP 的改良型狂犬病毒后染色的灵长类 50 微米脑组织切片。将载玻片放入显微镜载物台夹持器中，使用低倍物镜聚焦于感兴趣的单个区域。

确保通过正确调整相机快门位置，使相机图像在实时图像中可见。在目标脑结构内选择一个标记清晰且相对孤立的神经元，以便明确重建树突分支。切换至10倍放大倍数，并将该区域调至清晰对焦。

优先选择细胞体完全位于单一切片内的神经元，以准确估算其面积和圆形度。选定一个染色良好且孤立的神经元后，点击软件中的“新建切片”按钮，将包含该细胞体的主切片添加至切片管理器。输入用于重建的切片数量。

建议先插入两到三个切片。设定切片厚度为 50 微米。选择 2 倍物镜，然后点击顶部工具栏中的轮廓按钮，并从下拉菜单中选择轮廓类型。

使用鼠标沿目标结构的轮廓点击以描摹其轮廓。完成轮廓描摹后，右键单击鼠标，从菜单中选择“闭合轮廓”以闭合该轮廓。接着，在视图仍保持在两倍放大状态下，单击左侧工具栏中所需的标记符号。

然后点击目标结构的中心以放置标记。完成轮廓绘制后，选择40x或60x物镜来描记细胞体的轮廓。接着点击顶部工具栏中的神经元追踪按钮，并从下拉菜单中选择需要追踪的神经元结构，在本例中为细胞体。

通过在细胞体最大范围周围点击点来勾画细胞体轮廓，必要时调整 z 轴深度，使细胞体处于清晰对焦状态，然后单击鼠标右键完成细胞体轮廓的绘制。接下来，在细胞体轮廓中心放置一种不同样式的标记，确保该标记在 z 轴深度方向上大致位于中心位置。

在开始每次追踪之前，必须在起始区域及其相邻区域准确定位正确的 z 轴深度，以确保 z 轴数值的准确性。要开始追踪树突分支，从顶部下拉菜单中选择“dendrite”。

然后从细胞体开始追踪每一条树突。当树突发生分支时，单击鼠标右键，选择“分叉节点”或“三分叉节点”，在该分支点处放置一个节点。在追踪过程中，务必持续调整 z 轴深度，以准确捕捉树突的角度和走向。

在此区域的树突末端，右键单击鼠标，然后从下拉菜单中选择“ending”。当在主区域中完成所有树突分支的追踪后，识别那些可能延伸至相邻区域的树突末端，并在20倍镜图像中将这些末端调整至合适的z轴深度以获得清晰对焦。

在显微镜图像中包含附近的显著解剖标志，例如血管或易于识别的树突形态或束状结构。随后，使用数码相机对计算机屏幕上的实时图像进行拍摄。然后将显微镜物镜切换至2倍，移动载玻片至相邻区域。

然后在软件视图中将先前绘制部分的轮廓与新切片中LGN和TRN的边界对齐。返回20倍物镜，利用解剖标志进行校准。接着，参考先前绘制切片中树突末端的照片，使用箭头工具选中重建结构，移动 tracing 以使树突对齐。

然后右键单击，从下拉菜单中选择“移动”，并相应地移动描图。要旋转描图，请右键单击，从下拉菜单中选择“旋转”，并相应地旋转描图。或者，从顶部工具下拉菜单中选择匹配工具，并选择要匹配的点数。

然后点击重建图像中的末端，并在实时图像中选择相应的延续点，以将树突末端与起始点匹配。当上一节的追踪与新一节中的树突对齐后，像之前一样在切片管理器中添加一个新的切片。或者，直接选择先前创建的相邻切片，并以相同方式调整 z 深度。

通过单击当前部分，在部分管理器中确保已选中相应的新部分。然后，将放大倍数增加至 40x 或 60x 后，使用箭头选择树突。在上一节树突末端处单击鼠标右键，从下拉菜单中选择“添加至末端”。

系统将提示您确认该延续是否位于新片段中。单击“是”。然后使用鼠标作为绘图工具，追踪树突的延续部分。

拍摄末端图像，以备与下一部分进行对齐。随后继续延伸树突追踪，直至完成至少三个连续切片的追踪，或直至无法继续追踪或找到树突为止。使用与神经元重建系统配套的提取程序，打开已完成的重建文件。

从编辑下拉菜单中选择“全选对象”。从顶部分析工具栏中选择“分支结构分析”，然后依次点击各个选项卡，并在每个选项卡中选择所需的分析选项。点击分析窗口中的“确定”按钮以提取所有所需数据，然后通过右键单击输出窗口并选择“导出到Excel”，将数据保存为电子表格格式以进行后续分析。

这张照片显示了一只动物背侧外侧膝状体（LGN）的单个冠状切面。细胞色素氧化酶染色用于显示LGN的分层结构，而GFP染色则标记了病毒注射部位。

箭头指示丘脑网状核神经元中密集的逆向标记区域。切片方向依据图中所示的背侧-腹侧-内侧-外侧方位标确定。比例尺位于左下角。

该图像以红色显示外侧膝状体核（LGN）的轮廓，以栗色显示丘脑网状核（TRN）的轮廓，适用于所有包含病毒注射的切片，黑色轮廓指示注射区域。黄色星号表示注射位点的中心。该图像展示了轮廓及注射位点的三维重建。

这是根据单个聚合的丘脑网状核（TRN）轮廓内聚类分配情况，以不同颜色标记重建的TRN神经元位置的分布图，该聚合轮廓以深红色显示。比例尺代表500微米。该图像显示了TRN的聚合轮廓（黑色）和外侧膝状体核（LGN）的轮廓（灰色），以及五个重建的TRN神经元，其颜色从暖色到冷色表示它们在TRN内从内侧到外侧的位置。

比例尺代表500微米。这些照片显示了相同的五个TRN神经元的细节，颜色匹配的比例尺代表100微米。该分层树状图基于10项独立的形态学指标，展示了160个重建的TRN神经元之间的连接距离，并呈现了聚类分析的整体结果。

图中以蓝色、绿色和红色标示了三组不同的丘脑网状核（TRN）神经元。掌握这些神经元重建技术后，可在一至两小时内完成单个神经元的完整重建。在重建神经元过程中，持续监测并调整z轴深度至关重要。

本文所述方案是对传统且更具偏倚性的神经解剖学分析方法的改进，可使研究人员基于大规模形态学数据探索神经元的新亚类。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过相邻组织切片重建神经元，并提取形态学数据以供进一步分析。