Name: 小鼠大脑皮层细胞组织的大尺度三维成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学习小鼠大脑皮层的大尺度三维成像技术，通过组织透明化、荧光标记和共聚焦显微镜观察神经元空间分布。该方法可揭示新皮层细胞类型的三维组织结构，为神经科学研究提供重要工具。

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我们感谢宫脇敦史（Atsushi Miyawaki）和浜博史（Hiroshi Hama）在AbScale实验方面提供的建议，横山查尔斯（Charles Yokoyama）对手稿的编辑，以及大岛绘理子（Eriko Ohshima）和岸野美由纪（Miyuki Kishino）在技术上的协助。本研究由理化学研究所（RIKEN）向T.H.提供的研究经费，以及日本文部科学省（MEXT）向T.H.（创新领域“&#34;Mesoscopic Neurocircuitry&#34;；22115004）和S.S.（25890023）提供的科学研究补助金资助。

所有实验程序均经理化学研究所和光动物实验委员会及理化学研究所基因重组实验安全委员会批准，并依照理化学研究所脑科学研究所动物设施的机构指南进行。
1. 成像室的制备
<ol>
	<li>成像室19
	<ol>
		<li>使用硅橡胶片制备厚度约为 5 mm 的成像室，并配备不同厚度的底板。同时准备有或无玻璃底的培养皿（图 1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切片间隔片
	<ol>
		<li>使用厚度为 0.5 mm 的硅橡胶片制备用于固定样品的间隔片（图 1C）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 示踪剂注射
注意：将注射注入脑桥（2.1）或上丘（2.2）。注射至脑桥可标记包括视觉区和运动区在内的广泛脑区中的皮层下投射神经元，而注射至上丘则仅标记视觉区中的皮层下投射神经元。对照实验中，使用生理盐水代替荧光标记的霍乱毒素B亚基。为维持无菌条件，应使用灭菌器械，并佩戴经乙醇清洁的塑料手套。
<ol>
	<li>向成年小鼠脑桥注射。
	<ol>
		<li>用26G Hamilton注射器吸取1 µL荧光标记的霍乱毒素B亚基（25 µg/µL，溶于PBS中）。</li>
		<li>将注射泵安装到注射器上。</li>
		<li>将注射器和泵安装在立体定位仪上的操纵器工具架上。将操纵器从垂直轴向后倾斜12°。</li>
		<li>通过腹腔注射戊巴比妥钠（60 mg/kg体重）或吸入异氟烷（2–3%），对一只成年雄性或雌性小鼠（C57BL/6J或Tlx3-cre/Ai9）进行麻醉。当用镊子夹住小鼠尾巴无反应时，表明小鼠已完全麻醉，此时开始下一步操作。</li>
		<li>将小鼠固定在立体定位仪上。</li>
		<li>使用剃刀片小心去除头部毛发以防止感染，并剪开约10 mm的头皮，使前囟（bregma）和后囟（lambda）清晰可见。用移液器注射0.1 mL 1%利多卡因。通过调节立体定位仪上咬合板的垂直位置来调整头部角度，使前囟与后囟处于相同的Z轴水平。</li>
		<li>通过在立体定位仪上滑动操纵器来调整其位置，使注射器尖端接近前囟，并记录此时操纵器的位置。通过移动操纵器上的工具架将注射器回撤。</li>
		<li>将操纵器向后移动5.4 mm，向外侧移动0.4 mm。推进注射器，使其尖端接近颅骨穿刺点。回撤注射器并标记穿刺点。</li>
		<li>在标记位置处钻一个直径约为1 mm的孔。</li>
		<li>将注射器尖端插入孔中，使其深度比在前囟处测量的深度再深入6.9 mm。</li>
		<li>使用泵以0.2 µL/min的速度注入1 µL示踪剂。</li>
		<li>将注射器从脑组织中取出。</li>
		<li>如有必要，用微纤维止血胶原碎片和速干胶覆盖暴露的脑组织。</li>
		<li>用移液器滴加生理盐水冲洗暴露的脑组织以防止感染，然后缝合头皮。</li>
		<li>将小鼠从立体定位仪上取下，放入30 ˚C的培养箱中恢复麻醉状态，通常需要1小时。在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得离开无人看护。待小鼠完全恢复后，将其放回与其他动物共同饲养的笼中。</li>
		<li>维持小鼠存活3–7天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向成年小鼠上丘注射。
	<ol>
		<li>准备一支尖端直径为30–50 µm的玻璃移液管。</li>
		<li>通过塑料管将玻璃移液管连接至Hamilton注射器（图2A）。</li>
		<li>用石蜡油填充玻璃移液管、塑料管和Hamilton注射器。</li>
		<li>将注射泵安装到注射器上。</li>
		<li>将玻璃移液管安装在操纵器上，并将操纵器从垂直轴向后倾斜60°（图2B）。</li>
		<li>执行步骤2.1.4–2.1.9。操纵器的位置应位于后囟后方1.4 mm、外侧0.5 mm处。</li>
		<li>在颅骨上放置一小片塑料石蜡膜，然后在其上滴加约1 µL示踪剂溶液。迅速推进玻璃移液管，并至少吸入0.5 µL示踪剂溶液。</li>
		<li>插入玻璃移液管，使其尖端深度距脑表面3.0 mm。</li>
		<li>使用泵以0.2 µL/min的速度注入0.5 µL示踪剂。</li>
		<li>将玻璃移液管从脑组织中取出。</li>
		<li>执行步骤2.1.13–2.1.16。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 固定与修块
<ol>
	<li>腹腔注射戊巴比妥钠（60 mg/kg 体重）至小鼠（C57BL/6J 或 Tlx3-cre/Ai9，按步骤2所述进行示踪剂注射或不注射。用镊子夹住小鼠尾巴，待其无任何反应时，表明小鼠已完全麻醉。</li>
	<li>以灌流法人道处死小鼠&#160;小鼠经心脏灌注20 用0.9%生理盐水。</li>
	<li>固定小鼠20 通过灌注含有4%多聚甲醛（PFA）的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.5）固定。</li>
	<li>使用剪刀剪开头皮，以暴露颅骨，具体操作如前所述20.
	<ol>
		<li>用剪刀剪开暴露的颅骨中线，然后用镊子移除颅骨。</li>
		<li>若需标记前囟和后囟的位置，首先移除颅骨的一侧半球。将细钨针插入脑组织中保留在脑上的颅骨的前囟和后囟位置，然后移除剩余的颅骨。 
		注意：脑组织可在 4 ˚C 条件下保存于 PBS 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了对抑制性神经元进行抗体染色，将脑组织样本切成切片。
	<ol>
		<li>将脑组织样本置于振动切片机上。</li>
		<li>在室温下用 PBS 切割厚度不超过 500 µm 的切片，并进行至第 5 步（AbSca）le 方法）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果无需进行抗体染色，使用剃刀将脑组织样本修整为厚度不超过3 mm的组织块图3）并进入第4步（SeeDB方法）。 
	注意：切片或修整后的脑组织可保存在4 °C的PBS中。当无需进行抗体染色时，优先选用SeeDB方法，因其所需时间较AbSca短。l方法。</li>
</ol>
4. 无需抗体染色的透明化方法（SeeDB 法）
<ol>
	<li>使用刮勺将样品转移至含有20 mL 0.5% α-甘油和20% (w/v) 果糖的50 mL塑料管中，在室温下轻轻振荡孵育4小时。</li>
	<li>使用刮勺将样品转移至含有20 mL 0.5% α-甘油和40% (w/v) 果糖的50 mL塑料管中，在室温下轻轻振荡孵育4小时。</li>
	<li>使用刮勺将样品转移至含有20 mL 0.5% α-甘油和60% (w/v) 果糖的50 mL塑料管中，在室温下轻轻振荡孵育4小时。</li>
	<li>使用刮勺将样品转移至含有20 mL 0.5% α-甘油和80% (w/v) 果糖的50 mL塑料管中，在室温下轻轻振荡孵育12小时。</li>
	<li>使用刮勺将样品转移至含有20 mL 0.5% α-甘油和100% (w/v) 果糖的50 mL塑料管中，在室温下轻轻振荡孵育12小时。</li>
	<li>使用刮勺将样品转移至含有20 mL 0.5% α-甘油和80.2% (w/w) 果糖的50 mL塑料管中，在室温下轻轻振荡孵育24小时。 
	注意：操作样品时需格外小心，尽量减少形变。不得超出指定时间孵育，否则样品可能迅速变得不透明。</li>
	<li>将样品包埋于装有80.2%果糖溶液的成像腔室中（图1B）。如有需要，可在周围放置小块橡胶粘合剂以固定样品。若腔室过深，可在放置样品前先在腔室内加入底板。</li>
	<li>将带有玻璃盖的培养皿置于成像腔室上，并在培养皿中加入水，使用水浸长工作距离物镜通过共聚焦或双光子显微镜进行成像。激发波长和发射滤光片参数见表1。如有需要，可使用电动载物台。</li>
</ol>
5. 抗体染色透明化（AbScale 方法）
<ol>
	<li>按照所述方法制备试剂 表2.</li>
	<li>使用刮勺将切片转移至含有 4 mL ScaleS0 溶液的 5 mL 塑料管中，在 37 °C 下轻轻振荡孵育 12 h（图4B).</li>
	<li>用移液器从离心管中移除溶液，加入4 mL Sca/eA2溶液，在37 °C下轻轻振荡孵育切片36小时。</li>
	<li>用移液器从离心管中移除溶液，加入4 mL Sca/eB4溶液，在37 °C下轻轻振荡孵育切片24 h。</li>
	<li>用移液器从离心管中移除溶液，加入4 mL Sca/eA2溶液，在37 °C下轻轻振荡孵育切片12小时。</li>
	<li>用移液器从离心管中移除溶液，加入4 mL PBS，将组织切片在室温下轻轻振荡孵育6小时。</li>
	<li>使用刮勺小心地将切片转移至一个2 mL塑料管中。</li>
	<li>孵育一抗（表3) 加入 1 mL AbSca 中le溶液中37°C孵育48-72小时（图 4C轻柔振荡。</li>
	<li>使用刮勺小心地将切片转移至一个5 mL塑料管中。</li>
	<li>在 4 mL AbSca 中孵育l在室温下轻轻振荡，用溶液处理2次，每次2小时。</li>
	<li>使用刮勺小心地将切片转移至一个2 mL塑料管中。</li>
	<li>孵育荧光标记的二抗（材料表，1:100）溶于1 mL AbScal在37 °C下轻轻振荡孵育48小时。</li>
	<li>使用刮勺小心地将切片转移至含有 4 mL AbSca 的 5 mL 塑料管中le溶液中，在室温下轻轻振荡孵育切片6小时。</li>
	<li>用移液器从离心管中移除溶液，然后加入 4 mL 的 AbScale溶液中，在室温下轻轻振荡孵育切片，每次2小时，重复两次。</li>
	<li>用移液器从离心管中移除溶液，加入4 mL 4% PFA，于室温下轻轻振荡孵育切片1小时。</li>
	<li>用移液器从离心管中移除溶液，加入4 mL PBS，于室温下轻轻振荡孵育切片1小时。</li>
	<li>用移液器从离心管中移除溶液，加入4 mL Sca/eS4溶液，在37 °C下轻轻振荡孵育12小时。</li>
	<li>将间隔器置于载玻片上，将切片放入间隔器内，并用 Sca/eS4 溶液浸没切片。用盖玻片密封间隔器。图1D).</li>
	<li>将水滴加到盖玻片上，使用水浸式长工作距离物镜，通过共聚焦或双光子显微镜进行成像。必要时，使用电动载物台。 
	注意：检查样本深层部分的标记是否与表层部分相似，以确认不存在显著的标记偏差。 
	注意：本实验中所测试抗体的穿透性详见于 表3.</li>
</ol>
6. 细胞位置的确定
<ol>
	<li>针对扫描图像中的每个位置，使用三维图像滤波器计算相关值14（图 5A-5D）。</li>
	<li>确定相关值峰值的位置（图 5D）。</li>
	<li>检查峰值周围图像以定位细胞（图 5E）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们已展示了获取小鼠新皮层第5层主要细胞类型在细胞类型特异性组织中大规模三维图像的实验流程。与传统的切片染色方法相比，该方法在确定新皮层三维组织结构方面更具优势。与常规方法相比，该技术能够实现更广泛且更深脑区的成像采集 体内 双光子显微镜或传统共聚焦显微镜，从而能够对新皮层的细胞结构进行全面分析。
该方法的关键步骤是抗体的渗透。部分抗体在厚样本中的渗透效果较差（表3），因此不能用于AbScale 方法。为了使本研究中使用的抗体实现均匀标记，必须将脑组织切成500 µm的切片。使用较小的抗体片段， 例如， Fab 或 F(ab')2 片段，和/或其他清除方法21,22,23,24,25<...

哺乳动物的新皮层由大量细胞类型组成，每种细胞都具有特定的基因表达模式、电生理和生化特性以及突触连接， 体内 功能1,2,3,4,5,6,7这些细胞类型是否被组织成重复性结构尚不明确。皮层柱（包括视觉朝向柱和体感桶状结构）具有重复性结构，但其细胞层面的组织形式仍不清楚。8,9这些存在于特定的皮层区域，并非全脑范围的系统。
在新皮层第5层中，绝大多数神经元可分为四种主要类型。其中一种主要的兴奋性神经元为皮层下投射神经元，其轴突投射至脑桥、脊髓和上丘等皮层下靶区，因此构成了主要的皮层输出通路10。另一种主要的兴奋性神经元是皮层投射神经元，其支配大脑皮层本身10。抑制性神经元也包含两大主要类别：表达小清蛋白的细胞和表达生长抑素的细胞11。
近期分析表明，这四种细胞类型以重复的结构排列12,13,14。皮层下投射神经元12,13,14和皮层投射神经元14均形成细胞类型特异性的微柱结构，其直径为1–2个细胞。表达小清蛋白的细胞和表达生长抑素的细胞特异性地与皮层下投射神经元的微柱对齐，但不与皮层投射神经元的微柱对齐14。微柱本身周期性排列，形成六边形晶格阵列14，存在于小鼠脑的多个皮层区域，包括视觉、体感和运动区域12,14，也存在于人脑的语言区域13。单个微柱内的神经元表现出同步活动，并具有相似的感觉反应14。这些观察结果表明，第5层的细胞类型组织成一种微柱晶格结构，代表了首个已知的全脑范围内重复功能模块的组织形式。
微柱的半径约为10 µm，空间周期性约为40 µm。此外，微柱的取向与其顶端树突平行，并随其在皮层中的位置不同而发生变化14因此，使用通常厚度为几十微米的传统脑片难以对微柱系统进行分析。此外，周期性分析需要来自大范围脑区的三维数据，而共聚焦显微镜通常的成像范围较小，因而难以满足这一需求。 体内 双光子成像的视野过窄。
近年来，已开发出清除厚组织的技术15,16。本文描述了这些方法的应用，以获取小鼠新皮层第5层中构成微柱系统的各类主要细胞类型的大尺度三维图像。皮层下投射神经元通过逆行标记法标记，或通过Crym-egfp转基因小鼠中增强型绿色荧光蛋白的表达进行标记12；皮层投射神经元则通过逆行标记法，或通过Tlx3-cre/Ai9 小鼠中 tdTomato 的表达进行标记17。表达小清蛋白和生长抑素的细胞通过免疫组织化学方法进行标记。抗体染色实验采用（抗体标尺 S）AbScale 方法18，而其他实验则采用（见深层脑组织）SeeDB 方法19。这些方法克服了上述传统成像方法的困难，揭示了第5层细胞结构的精确组织方式14。

<table><tbody><tr><td>Crym-egfp 转基因小鼠</td><td>MMRRC</td><td>012003-UCD</td><td></td></tr><tr><td>Tlx3-cre 转基因小鼠</td><td>MMRRC</td><td>36547-UCD</td><td></td></tr><tr><td>ROSA-CAG-flox-tdTomato 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>JAX #7909</td><td></td></tr><tr><td>硅橡胶片</td><td>AS ONE</td><td>6-611-01</td><td>0.5 mm 厚度</td></tr><tr><td>硅橡胶片</td><td>AS ONE</td><td>6-611-02</td><td>1.0 mm 厚度</td></tr><tr><td>硅橡胶片</td><td>AS ONE</td><td>6-611-05</td><td>3.0 mm 厚度</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Matsunami</td><td>C022241</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素亚基 B（重组），Alexa Fluor 488 标记物</td><td>Invitrogen</td><td>C22841</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素亚基 B（重组），Alexa Fluor 555 标记物</td><td>Invitrogen</td><td>C22843</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素亚基 B（重组），Alexa Fluor 594 标记物</td><td>Invitrogen</td><td>C22842</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素亚基 B（重组），Alexa Fluor 647 标记物</td><td>Invitrogen</td><td>C34778</td><td></td></tr><tr><td>26 G Hamilton 注射器</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 310</td><td>pons 注射</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 100</td><td>上丘注射</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>协和化学</td><td>Somnopentyl</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>辉瑞</td><td></td><td></td></tr><tr><td>利多卡因</td><td>阿斯利康</td><td>含肾上腺素的 1% 利多卡因注射液</td><td></td></tr><tr><td>钻机</td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Avitene 微纤维止血剂</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>Alonalfa</td><td>第一三共</td><td>Alonalpha A</td><td></td></tr><tr><td>外科缝合丝线</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>孵育器</td><td>UVP</td><td>HB-1000 Hybridizer</td><td></td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>Drummond 科学公司</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>电极拉制仪</td><td>Sutter 仪器公司</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>液体石蜡，轻质</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>大冢</td><td>1326</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26126-54</td><td></td></tr><tr><td>钨针</td><td>Inter medical</td><td>&amp;Phi;0.1 *L200 mm</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 塑料管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-硫代甘油</td><td>Nacalai Tesque</td><td>33709-62</td><td></td></tr><tr><td>D(-) 果糖</td><td>Nacalai Tesque</td><td>16315-55</td><td></td></tr><tr><td>BluTack</td><td>Bostik</td><td>CKBT-450000</td><td></td></tr><tr><td>双光子显微镜</td><td>尼康</td><td>A1RMP</td><td></td></tr><tr><td>长工作距离水浸物镜</td><td>尼康</td><td>CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>长工作距离水浸物镜</td><td>尼康</td><td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td><td></td></tr><tr><td>电动载物台</td><td>COMS</td><td>PT100C-50XY</td><td></td></tr><tr><td>滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-492/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF03-575/25-25</td><td></td></tr><tr><td>滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-629/56</td><td></td></tr><tr><td>滤光片</td><td>Chroma</td><td>D605/55m</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 塑料管</td><td>AS ONE</td><td>VIO-5B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 塑料管</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35905-35</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-aldrich</td><td>191612</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-山梨醇</td><td>和光</td><td>191-14735</td><td></td></tr><tr><td>甲基-&amp;beta;-环糊精</td><td>东京化成工业</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-环糊精</td><td>和光</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰-L-羟基脯氨酸</td><td>Skin Essential Actives</td><td>33996-33-7</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Nacalai Tesque</td><td>13445-45</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20 (1.1 g/mL)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555 标记</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555 标记</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 标记</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>长工作距离水浸物镜</td><td>奥林巴斯</td><td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>抗 NeuN 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>抗 NeuN 抗体</td><td>Millipore</td><td>ABN78</td><td></td></tr><tr><td>抗 CTIP2 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td></td></tr><tr><td>抗 Statb2 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab51502</td><td></td></tr><tr><td>抗 GAD67 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB5406</td><td></td></tr><tr><td>抗 GABA 抗体</td><td>Sigma</td><td>A2052</td><td></td></tr><tr><td>抗钙结合蛋白 Parvalbumin 抗体</td><td>Swant</td><td>235</td><td></td></tr><tr><td>抗钙结合蛋白 Parvalbumin 抗体</td><td>Frontier Institute</td><td>PV-Go-Af460</td><td></td></tr><tr><td>抗钙结合蛋白 Parvalbumin 抗体</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td></td></tr><tr><td>抗钙结合蛋白 Parvalbumin 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab11427</td><td></td></tr><tr><td>抗生长抑素抗体</td><td>Peninsula Laboratories</td><td>T-4103</td><td></td></tr><tr><td>抗 c-Fos 抗体</td><td>CalbioChem</td><td>PC38</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠新皮层细胞组织的大规模三维成像

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

哺乳动物的新皮层由多种类型的兴奋性和抑制性神经元组成，每种神经元都具有特定的电生理和生化特性、突触连接以及 体内 功能，但其从细胞到网络水平的基本功能与解剖组织结构仍不清楚。本文介绍一种用于在全脑大范围区域内对荧光标记神经元进行三维成像的方法，以研究大脑皮层的细胞组织结构。通过向转基因小鼠体内注射荧光逆行神经示踪剂或使其表达荧光蛋白，可特异性标记特定类型的神经元。将脑组织制成整块样本， 例如， 半脑在固定后制备，通过组织透明化方法使其透明，并对特定细胞类型进行荧光免疫标记。使用配备长工作距离物镜和电动载物台的共聚焦或双光子显微镜扫描大范围区域。该方法可解析小鼠新皮层中细胞类型特异性微柱功能模块的周期性排列。此技术可用于研究不同脑区及其他复杂组织中的三维细胞架构。

我们通过在Tlx3-cre/Ai9转基因小鼠中表达tdTomato标记皮层投射神经元，并通过向脑桥注射逆行示踪剂CTB488来可视化皮层下投射神经元。对小鼠脑的左半球采用SeeDB方法进行透明化处理，并使用配备水浸长工作距离物镜（25X，数值孔径1.1，工作距离2 mm）和电动载物台的双光子显微镜进行扫描。在每个30个扫描位置处，以z步进2.8 µm获取一组401张图像（512 x 512像素；像素大小=0.99 µm）。两类细胞的胞体在大脑多个区域范围内均清晰可见（图6），光学切片显示了周期性微柱结构（图7A）。此外，将Crym-egfp小鼠（以C57BL/6J为遗传背景的杂合子）的脑组织经SeeDB法透明化处理后，按上述方法进行成像。EGFP表达的皮层下投射神经元的胞体及其顶端树突在光学切片中清晰可辨（图7B）。
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本文介绍一种用于小鼠脑组织透明化、荧光标记及大规模成像的实验流程，该方法可实现新皮层中细胞类型三维空间组织结构的可视化。

哺乳动物的新皮层由多种类型的兴奋性和抑制性神经元组成，每种神经元都具有特定的电生理和生化特性……

该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如新皮层结构与功能的分析。该技术的主要优势在于能够揭示大脑的大尺度三维结构。尽管该方法可为新皮层提供深入见解，也可应用于其他神经系统，如脊髓。为了将示踪剂注入成年小鼠的脑桥，首先用一支26号Hamilton注射器吸取1 µL荧光标记的霍乱毒素B亚基。将注射泵安装到注射器上，然后将注射器和泵一起放置在立体定位仪操纵器的工具架上。将操纵器从垂直轴向后倾斜12度。随后，将小鼠置于立体定位仪上。使用剃刀去除其毛发，以防止感染。然后切开10毫米的头皮，使前囟和后囟可见。使用移液器注射 0.1 毫升 1% 利多卡因。通过调节立体定位仪上咬合板的垂直位置，使头颅的角度调整至前囟（bregma）与后囟（lambda）处于相同的 Z 轴水平。接着，通过滑动操纵器在立体定位仪上的位置，使其调整至注射针尖接近前囟（bregma）处。记录操纵器的位置。通过移动操纵器上的工具架来回撤注射器。随后将操纵器向后移动 5.4 毫米，向外侧移动 0.4 毫米。将注射器向前推进，使针尖接近颅骨上的进针点，然后回撤注射器并标记进针位置。在标记处钻出一个直径约1毫米的孔。将注射器针尖通过该孔插入，使针尖深度比在前囟处测得的深度增加6.9毫米。然后，使用泵以每分钟0.2微升的速度注入1微升示踪剂。注射完成后，将注射器从脑组织中取出。如有必要，可用微纤维止血剂的小碎片和速干胶覆盖暴露的脑组织。用生理盐水擦拭暴露的脑组织以防止感染，并缝合头皮。随后将小鼠从立体定位仪上取出。将小鼠置于30摄氏度的培养箱中，使其从麻醉状态下恢复约1小时。在小鼠恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得将其单独留下。待小鼠完全恢复后，将其放回其他动物身边。为采集脑组织，使用剪刀剪开头皮以暴露颅骨。接下来，使用剪刀剪开暴露的颅骨正中线。然后用镊子去除颅骨。如果需要标记前囟和人字缝的位置，应先去除一侧颅骨。然后将细钨针插入脑组织的前囟和后囟位置，随后去除剩余的颅骨。接着将脑组织样本放置在振动切片机平台上，在室温下用磷酸盐缓冲液（PBS）切割厚度达500微米的切片。在此步骤中，将切片转移至含有四毫升 Scale S0 溶液的五毫升塑料离心管中，然后在 37 摄氏度下轻轻振荡孵育 12 小时。12 小时后，用移液器吸去管中的溶液，并加入四毫升 Scale A2 溶液。将切片在37摄氏度下轻轻振荡孵育36小时。36小时后，从管中移除溶液，并加入4毫升Scale B4溶液。将切片在37摄氏度下轻轻振荡孵育24小时。24小时后，从管中移除溶液，并加入4毫升Scale A2溶液。在37摄氏度下轻轻振荡孵育切片12小时。12小时后，从管中移除溶液，并加入4毫升PBS。将切片在室温下轻轻振荡孵育六小时。随后，小心地将切片转移至一个2毫升的塑料离心管中。在1毫升AB Scale溶液中加入一抗，于37°C轻轻振荡孵育48至72小时。随后，小心将切片转移至一个5毫升的塑料管中。在室温下，用4毫升AB Scale溶液孵育切片，每次2小时，共孵育两次，期间轻柔振荡。之后，小心将切片转移至一个2毫升的塑料管中。在1 mL AB Scale溶液中，加入荧光标记的二抗，37°C、轻柔振荡孵育48小时。小心将切片转移至含有4 mL抗体Scale溶液的5 mL塑料管中，室温轻柔振荡孵育6小时。移除溶液，加入4 mL AB Scale溶液，室温轻柔振荡，每次2小时，共孵育两次。接下来，移除溶液，加入4毫升4%PFA，于室温下轻轻振荡孵育切片1小时。然后，移除溶液，加入4毫升PBS，于室温下轻轻振荡孵育切片1小时。移除溶液，加入4毫升Scale S4溶液，于37摄氏度下轻轻振荡孵育切片12小时。随后，将间隔片置于载玻片上，将切片放入间隔片中，并将切片浸入Scale S4溶液。用盖玻片密封间隔片。在盖玻片上加少量水，使用水浸式长工作距离物镜，通过共聚焦或双光子显微镜对切片进行成像。在本研究中，通过在7周龄时向脑桥注射逆行示踪剂CTB488，使端脑投射神经元以洋红色显示，而Tlx3-cre AI9转基因小鼠中表达tdTomato的皮层投射神经元则以绿色标记。此为顶视图，用于显示皮层区域的大致位置。以下是CTB488荧光的斜视图，显示皮下投射神经元，以及tdTomato荧光显示的皮层投射神经元，此图为两者的叠加图像。这两种细胞类型的细胞体在大脑的多个区域范围内均可见，光学切片显示了周期性微柱结构。该图像展示了Crym-eGFP小鼠光学切片中表达eGFP的皮层下投射神经元的细胞体及其顶端树突；另一图像则显示了在C57 Black 6小鼠脑桥注射CTB488后，通过抗体Scale法标记的表达钙结合蛋白parvalbumin的细胞（绿色）以及皮层下投射神经元（品红色）。完成该操作后，可进一步进行三维图像处理等其他方法，以回答有关大脑结构定量表征等更深入的问题。该技术问世后，为皮层生物学领域的研究人员探索小鼠大脑中新的模块化结构开辟了道路。

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