小鼠大脑皮层细胞组织的大尺度三维成像

在这里, 我们描述一个程序, 组织清除, 荧光标记, 和大规模的小鼠脑组织成像, 从而使可视化的三维组织的细胞类型在大脑皮层。

这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如新皮层的结构和功能分析。这种技术的主要优点是它可以揭示大脑中的大规模三维结构。虽然这种方法可以提供对新皮层的洞察，但它也可以应用于其他神经系统，例如脊髓。

要将示踪剂注射到成年小鼠的脑桥中，首先将 1 微升荧光标记的霍乱毒素亚基 B 吸入 26 号汉密尔顿注射器中。将注射器泵放在注射器上，然后将注射器和泵放在立体定位器上机械手的工具架上。将纵器从垂直轴向后倾斜 12 度。

然后，将鼠标放在立体定位仪器上。使用剃须刀片去除它的毛发以防止感染。然后切下 10 毫米的头皮，使前囟和 lambda 可见。

使用移液管施用 0.1 毫升 1% 利多卡因。通过调整咬嘴在立体定位器械上的垂直位置来设置头部的角度，使前囟和 lambda 具有相同的 Z 水平。接下来，通过将机械手滑到立体定位器上来调整机械手的位置，使注射器的尖端靠近前囟。

记录纵器的位置。通过移动机械手上的刀架来缩回注射器。随后将机械手向后移动 5.4 毫米，向侧面移动 0.4 毫米。

推进注射器，使尖端靠近颅骨上的入口点，然后缩回注射器并标记入口点。在标记位置，钻一个直径约为 1 毫米的孔。将注射器尖端插入孔中，使尖端深度比在前囟处测量的尖端深度大 6.9 毫米。

然后，使用泵以每分钟 0.2 μL 的速度注入 1 μL 示踪剂。注射后，从大脑中取出注射器。如有必要，用微纤碎止血剂和速溶胶的小碎片覆盖暴露的大脑。

用生理盐水擦拭裸露的大脑以防止感染并缝合头皮。接下来，从立体定位器上取下鼠标。让小鼠在 30 摄氏度的培养箱中从麻醉中恢复约一个小时。

在鼠标恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让鼠标无人看管。将老鼠完全恢复后，将其送回其他动物的陪伴处。要收集脑组织，请用剪刀剪开头皮，露出头骨。

接下来，用剪刀剪掉裸露的头骨的中线。然后，使用镊子取出头骨。如果需要标记前囟和 lambda 的位置，请先去除颅骨的一侧。

然后将细钨针插入大脑前囟和 lamb 的位置，然后取出剩余的头骨。随后，将大脑样品放在振动切片机上。在室温下用 PBS 切割厚达 500 微米的切片。

在此过程中，将切片转移到含有 4 毫升 S0 秤溶液的 5 毫升塑料管中。然后在 12 摄氏度下轻轻摇晃孵育 37 小时。12 小时后，使用移液管从试管中取出溶液，并加入 4 毫升 A2 级溶液。

将切片在 37 摄氏度下轻轻摇晃 36 小时。36 小时后，从试管中取出溶液，加入 4 毫升 B4 比例溶液。将切片在 24 摄氏度下轻轻摇晃 37 小时。

24 小时后，从试管中取出溶液，加入 4 毫升 A2 级溶液。将切片在 12 摄氏度下轻轻摇晃 37 小时。12 小时后，从试管中取出溶液并加入 4 毫升 PBS。

在室温下轻轻摇晃切片 6 小时。随后，小心地将切片取出到 2 毫升的塑料管中。将它们与一抗在 1 毫升 AB Scale 溶液中在 37 摄氏度下孵育 48 至 72 小时，同时轻轻摇晃。

然后，小心地将切片取出到 5 毫升塑料管中。将它们在 4 毫升 AB Scale 溶液中孵育 2 小时，室温下孵育 2 次，两次，同时轻轻摇晃。之后，小心地将切片取出到 2 毫升的塑料管中。

与 1 mL AB Scale 溶液中的荧光标记二抗在 37 °C 下孵育 48 小时，同时轻轻摇晃。小心地将切片取出到装有 4 mL 抗体 Scale 溶液的 5 mL 塑料管中，并在室温下轻轻摇动孵育切片 6 小时。取出溶液，加入 4 毫升 AB Scale 溶液，在室温下轻轻摇动孵育切片 2 小时，孵育 2 次。

接下来，去除溶液并加入 4 毫升 4% PFA，并在室温下轻轻摇动孵育切片 1 小时。然后，去除溶液并加入 4 毫升 PBS，并在室温下轻轻摇动孵育切片 1 小时。取出溶液，加入 4 毫升 Scale S4 溶液，在 37 摄氏度下轻轻摇晃，将切片孵育 12 小时。

随后，将垫片放在载玻片上，将切片放入垫片中，然后将切片浸入 Scale S4 溶液中。用盖玻片密封垫片。在盖玻片上放一些水，并使用共聚焦或双光子显微镜和水浸长距离物镜对切片进行成像。

在这项研究中，在 Tlx3-cre AI9 转基因小鼠中通过 tdTomato 表达将皮层投射神经元标记为绿色，通过在 7 周龄时将逆行示踪剂 CTB488 注射到脑桥中来观察洋红色的脑下投射神经元。这是显示皮质区域大致位置的俯视图。以下是 CTB488 荧光的斜视图，显示大脑下投射神经元和 tdTomato 荧光，显示皮质投射神经元，这是合并图像。

两种细胞类型的细胞体在广泛的大脑区域可见，光学切片显示周期性的微柱。该图像显示了 Crym-eGFP 小鼠光学切片中表达 eGFP 的脑下投射神经元的细胞体和顶端树突，该图像显示了表达小白蛋白的细胞，通过抗体 Scale 方法将 CTB488 注射到 C57 Black 6 小鼠的脑桥中，以绿色标记和以品红色标记的脑下投射神经元。按照这个程序，可以执行其他方法，如 3D 图像处理，以回答其他问题，如大脑组织的定量表征。

开发后，这项技术为皮质生物学领域的研究人员探索小鼠大脑中的新型模块化组织铺平了道路。