小鼠新皮层细胞组织的大规模三维成像

该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如新皮层结构与功能的分析。该技术的主要优势在于能够揭示大脑的大尺度三维结构。尽管该方法可为新皮层提供深入见解，也可应用于其他神经系统，如脊髓。

为了将示踪剂注入成年小鼠的脑桥，首先用一支26号Hamilton注射器吸取1 µL荧光标记的霍乱毒素B亚基。将注射泵安装到注射器上，然后将注射器和泵一起放置在立体定位仪操纵器的工具架上。将操纵器从垂直轴向后倾斜12度。

随后，将小鼠置于立体定位仪上。使用剃刀去除其毛发，以防止感染。然后切开10毫米的头皮，使前囟和后囟可见。

使用移液器注射 0.1 毫升 1% 利多卡因。通过调节立体定位仪上咬合板的垂直位置，使头颅的角度调整至前囟（bregma）与后囟（lambda）处于相同的 Z 轴水平。接着，通过滑动操纵器在立体定位仪上的位置，使其调整至注射针尖接近前囟（bregma）处。

记录操纵器的位置。通过移动操纵器上的工具架来回撤注射器。随后将操纵器向后移动 5.4 毫米，向外侧移动 0.4 毫米。

将注射器向前推进，使针尖接近颅骨上的进针点，然后回撤注射器并标记进针位置。在标记处钻出一个直径约1毫米的孔。将注射器针尖通过该孔插入，使针尖深度比在前囟处测得的深度增加6.9毫米。

然后，使用泵以每分钟0.2微升的速度注入1微升示踪剂。注射完成后，将注射器从脑组织中取出。如有必要，可用微纤维止血剂的小碎片和速干胶覆盖暴露的脑组织。

用生理盐水擦拭暴露的脑组织以防止感染，并缝合头皮。随后将小鼠从立体定位仪上取出。将小鼠置于30摄氏度的培养箱中，使其从麻醉状态下恢复约1小时。

在小鼠恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得将其单独留下。待小鼠完全恢复后，将其放回其他动物身边。为采集脑组织，使用剪刀剪开头皮以暴露颅骨。

接下来，使用剪刀剪开暴露的颅骨正中线。然后用镊子去除颅骨。如果需要标记前囟和人字缝的位置，应先去除一侧颅骨。

然后将细钨针插入脑组织的前囟和后囟位置，随后去除剩余的颅骨。接着将脑组织样本放置在振动切片机平台上，在室温下用磷酸盐缓冲液（PBS）切割厚度达500微米的切片。

在此步骤中，将切片转移至含有四毫升 Scale S0 溶液的五毫升塑料离心管中，然后在 37 摄氏度下轻轻振荡孵育 12 小时。12 小时后，用移液器吸去管中的溶液，并加入四毫升 Scale A2 溶液。

将切片在37摄氏度下轻轻振荡孵育36小时。36小时后，从管中移除溶液，并加入4毫升Scale B4溶液。将切片在37摄氏度下轻轻振荡孵育24小时。

24小时后，从管中移除溶液，并加入4毫升Scale A2溶液。在37摄氏度下轻轻振荡孵育切片12小时。12小时后，从管中移除溶液，并加入4毫升PBS。

将切片在室温下轻轻振荡孵育六小时。随后，小心地将切片转移至一个2毫升的塑料离心管中。在1毫升AB Scale溶液中加入一抗，于37°C轻轻振荡孵育48至72小时。

随后，小心将切片转移至一个5毫升的塑料管中。在室温下，用4毫升AB Scale溶液孵育切片，每次2小时，共孵育两次，期间轻柔振荡。之后，小心将切片转移至一个2毫升的塑料管中。

在1 mL AB Scale溶液中，加入荧光标记的二抗，37°C、轻柔振荡孵育48小时。小心将切片转移至含有4 mL抗体Scale溶液的5 mL塑料管中，室温轻柔振荡孵育6小时。移除溶液，加入4 mL AB Scale溶液，室温轻柔振荡，每次2小时，共孵育两次。

接下来，移除溶液，加入4毫升4%PFA，于室温下轻轻振荡孵育切片1小时。然后，移除溶液，加入4毫升PBS，于室温下轻轻振荡孵育切片1小时。移除溶液，加入4毫升Scale S4溶液，于37摄氏度下轻轻振荡孵育切片12小时。

随后，将间隔片置于载玻片上，将切片放入间隔片中，并将切片浸入Scale S4溶液。用盖玻片密封间隔片。在盖玻片上加少量水，使用水浸式长工作距离物镜，通过共聚焦或双光子显微镜对切片进行成像。

在本研究中，通过在7周龄时向脑桥注射逆行示踪剂CTB488，使端脑投射神经元以洋红色显示，而Tlx3-cre AI9转基因小鼠中表达tdTomato的皮层投射神经元则以绿色标记。此为顶视图，用于显示皮层区域的大致位置。以下是CTB488荧光的斜视图，显示皮下投射神经元，以及tdTomato荧光显示的皮层投射神经元，此图为两者的叠加图像。

这两种细胞类型的细胞体在大脑的多个区域范围内均可见，光学切片显示了周期性微柱结构。该图像展示了Crym-eGFP小鼠光学切片中表达eGFP的皮层下投射神经元的细胞体及其顶端树突；另一图像则显示了在C57 Black 6小鼠脑桥注射CTB488后，通过抗体Scale法标记的表达钙结合蛋白parvalbumin的细胞（绿色）以及皮层下投射神经元（品红色）。完成该操作后，可进一步进行三维图像处理等其他方法，以回答有关大脑结构定量表征等更深入的问题。

该技术问世后，为皮层生物学领域的研究人员探索小鼠大脑中新的模块化结构开辟了道路。