协议的可视化类固醇机关及其互动器官在果蝇免疫染色果蝇
April 14th, 2017
我们描述了解剖，固定，并在果蝇幼虫和成年女性类固醇合成器官，研究类固醇激素的生物合成及其调控机制的免疫染色的协议。除了类固醇合成器官，我们可以形象地类固醇合成器官的神经支配和类固醇合成的靶细胞，如生殖系干细胞。
该程序的总体目标是可视化果蝇黑腹果蝇的幼虫或成年雌性的类固醇生成器官及其相互作用器官。这种方法可以帮助了解昆虫类固醇激素的生物合成，以及交配和的神经元调节机制。这种技术的主要优点是类固醇生成器官的神经支配及其相互作用器官的相对部分保持完整。
一般来说，刚接触这种方法的个体会很挣扎，因为果蝇幼虫中的类固醇生成器官非常小且透明。我和我的实验室很高兴分享我们的解剖方案。那么，让我们开始吧。
准备好幼虫后，在解剖显微镜下，在装满 PBS 的 3 厘米培养皿中开始解剖。首先，用镊子抓住口钩。然后，使用微型剪刀，从前尖端大约三分之一的长度处切断身体。
接下来，用一对镊子握住前部长度，用第二对镊子轻轻地将头尖推入体内，最终将幼虫身体翻过来。在 10 分钟内以这种方式制备多达 20 只幼虫，然后将它们转移到固定液中。30 分钟后，清洗制剂，然后进行免疫染色。
首先，将幼虫浸入水中约一小时，以窒息并固定幼虫。然后，将幼虫背面朝上放入一滴 PBS 中，放在硅胶涂层的培养皿上。背面有两根气管插管。
在解剖显微镜下，使用镊子将昆虫针插入前尖端。然后，将身体拉伸到后侧，并将第二个销钉放入后尖。接下来，用微型剪刀在尾巴附近做一个小切口。
从切口开始，小心地沿着背侧中线纵向切开背侧角质层，朝向头部，同时不要损坏角质层下的任何组织。切开后，将体壁分开，并在角落用昆虫针固定它们。然后，使用镊子去除前脂肪体和唾液腺，从而暴露表面的脑环腺复合体。
现在，吸出 PBS，并将制剂浸入固定液中。30 分钟后，用镊子去除昆虫针，将制剂转移到装有 0.3%PBT 的微管中。然后，进行免疫染色。
对幼虫进行免疫染色后，使用一次性移液管将样品转移到装有 0.3% PBT 的培养皿中。在解剖显微镜下，用一对镊子抓住角质层或口钩。然后，使用连接到 1 毫升注射器的 27 号针头（如刀）通过切掉食道和眼盘的前尖端，从体质层中去除脑环腺眼盘复合体。
接下来，使用镊子小心地将食道和肠道与脑环腺眼盘复合体分开。将肠道拉出到后侧，因为食管穿过腹侧神经索上方的大脑。最后，为了隔离脑环腺复合体，用针刀小心地切断脑盘、眼盘和腿盘之间的连接。
在解剖过程中使用带有锋利边缘的细镊子非常重要。我强烈建议你用一块磨石磨镊子，使它们的边缘毫无间隙地靠在一起。要转移样品，请使用带有宽口径尖端的微量移液器。
将样品沉积在载玻片的中心。然后，使用镊子将样本定位到其腹侧，以便对位于大脑背侧的环形腺进行成像。接下来，倾斜载玻片并尽可能多地擦去多余的 PBT。
然后，在样品附近滴一滴封固剂，用镊子慢慢降低试剂上的盖玻片，然后再降低样品上的盖玻片。为了解剖成年雌性卵巢，用二氧化碳气体麻醉果蝇。然后，切下他们的头，将他们的身体转移到一个装满 PBS 的 3 厘米长的培养皿中。
接下来，在解剖显微镜下，用镊子抓住胸部的背侧，然后用第二对镊子抓住腹部 A-5 或 A-6。然后，向后侧剥去腹部角质层。在继续之前，请清理镊子上的粘性角质层。
接下来，捏住一个卵子，并分离卵巢。然后用镊子梳理并展开卵巢的尖端。铺展后，将卵巢浸入固定液中 30 分钟，为染色做好准备。
为了制备维持卵巢神经支配的制剂，将麻醉的雌性果蝇转移到装满 PBS 的硅胶涂层培养皿中。在解剖显微镜下，握住长鼻，剥去头部角质层，露出大脑。从大脑中取出附着的气管，使大脑连接到腹侧神经索。
然后，握住胸部的背侧，并移除腿部和翅膀。接下来，从每条腿的底部开始剥去胸部的腹侧角质层。一旦 VNC 暴露出来，使用镊子非常小心地去除残留的背侧角质层和附着在 VNC 上的肌肉。
不要破坏大脑和 VNC 之间的连接。接下来，使用镊子剥开腹部角质层，露出卵巢及其相互作用的器官，包括支柱、肠道、卵管、子宫和附属腺。最后，去除所有残留的组织，包括气管和脂肪体。
然后，将样品浸入固定液中 30 分钟，以准备进行免疫染色。免疫染色后，使用微量移液管将样品转移到含有 0.1% PBT 的载玻片上。然后，用显微镜观察载玻片，并使用镊子将卵巢的绳子彼此分开。
在此过程中，不要伤害卵巢的尖端。它们含有 germaria。当准备大脑到生殖器官复合物时，去除任何残留的角质层，并将结构摊开到载玻片上。
接下来，擦去大部分多余的 PBT，然后将一滴封片剂滴在样品上。接下来，使用镊子慢慢将盖玻片放在载玻片上，并将载玻片存放在 4 摄氏度的黑暗中。稍后，在显微镜下观察样品，并将类固醇生成器官带入视野。
固定视图后，将成像系统切换到图像采集模式。在幼虫阶段，前胸腺被标记有针对蜕皮类固醇生成酶的抗体，包括抗裹尸布抗体。为了可视化前胸腺和大脑之间的神经元连接，解剖了脑环腺复合体。
菲力碎屑解剖法显示口胃神经系统，其中一组 5-羟色胺能神经元投射到前胸腺、前脑室和咽肌。在成年女性中，卵巢蜕皮类固醇会影响卵生成的许多方面，例如 GSC 增殖。GSC 位于卵巢中每个卵巢尖端的天竺葵中。
在天竺中，使用两种抗体 1B1 和 DE-钙粘蛋白特异性标记 GSC。为了可视化卵巢的神经支配，解剖了卵巢以及大脑、VNC、肠道、prop、子宫和精子。在 n-Synaptobrevin GAL4 驱动程序的控制下，通过 mCD8：GFP 观察神经元。
此外，使用 diconjugated 鬼笔环肽对肌肉结构进行染色。虽然解剖类固醇生成器官起初会感觉很困难，但通过这部电影来了解组织的切割点，以便更容易地分离器官而不会受伤。我们希望我们的协议不仅对初学者有用，而且对经验丰富的研究人员也有所帮助。
掌握后，您可以将此程序应用于您的研究，并根据您的需要进行复习。我们希望该协议将有助于全面了解类固醇激素的生物合成。手稿中提供了更详细的分步协议。
请看一看。
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概述
本文介绍了一种用于剥离、固定和免疫染色果蝇幼虫和成年雌性的甾体生成器官的协议。该方法旨在可视化甾体激素的生物合成及其调控机制，包括这些器官及其靶细胞的神经支配。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 内分泌学
背景
- 黑腹果蝇作为研究甾体激素生物合成的模式生物。
- 了解神经调控机制对于深入了解交配和变态过程至关重要。
- 该技术保留了甾体生成器官的神经支配。
- 剥离微小且透明的器官对于新手来说可能具有挑战性。
研究目的
- 可视化果蝇的甾体生成器官及其相互作用。
- 阐明甾体激素生物合成的机制。
- 研究神经对生殖和发育过程的控制。
使用的方法
- 果蝇幼虫和成年雌性的剥离。
- 甾体生成器官的固定。
- 免疫染色技术以可视化结构。
- 神经支配模式和靶细胞相互作用的分析。
主要结果
- 成功可视化了幼虫和成年果蝇的甾体生成器官。
- 展示了甾体生成器官的完整神经支配。
- 洞察了甾体生成器官与生殖干细胞之间的相互作用。
- 为未来的研究建立了可靠的协议。
结论
- 该协议为研究甾体激素生物合成提供了宝贵的工具。
- 了解调控机制可以增进对昆虫发育的认识。
- 这种方法可以适用于神经生物学和内分泌学的各种研究应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables visualization of steroidogenic organs and their neuronal interactions in Drosophila, providing a genetically tractable model for studying hormone biosynthesis regulation. The method supports mechanistic de-risking in early discovery by preserving innervation patterns and tissue architecture, which is critical for understanding endocrine signaling pathways relevant to metabolic and reproductive targets. It offers a scalable approach for target validation in invertebrate models, facilitating hypothesis testing before mammalian translation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of steroid hormone biosynthesis pathways through direct visualization of ecdysteroidogenic organs and their enzymatic markers.
- Scientific Value: Supports functional target validation by mapping neuronal innervation of steroidogenic tissues, clarifying regulatory mechanisms.
- Operational Value: Provides a reproducible dissection and immunostaining workflow for consistent sample preparation across experiments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative imaging readouts of organ structure and innervation, enabling phenotypic screening of genetic or pharmacological perturbations.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and staining protocols, improving assay reproducibility and cross-lab comparability.
- Scientific Value: Facilitates co-visualization of germline stem cells and steroidogenic organs, supporting biomarker-aligned assay development for reproductive signaling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes a disease-relevant system for studying steroid hormone regulation, with direct links to germline stem cell proliferation and developmental timing.
- Operational Value: Enables longitudinal analysis of organ interactions, supporting predictive modeling of endocrine disruption effects.
- Strategic Value: Supports mechanistic de-risking by linking neuronal activity to hormonal output, reducing uncertainty in target pathway validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting progression from target hypothesis testing to mechanistic validation in neuroendocrine systems before lead identification stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of steroidogenic regulation by visualizing enzyme expression and neuronal connections in intact tissue preparations.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based outputs for assessing compound or genetic effects on organ morphology and innervation patterns.
- Analytics: Provides spatial and fluorescence readouts that allow comparative analysis across conditions, supporting data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects steroidogenic organ function to germline stem cell activity, offering a translational biomarker pathway for reproductive development studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neuroendocrine phenotyping, adaptable across multiple targets and genetic backgrounds in Drosophila.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in steroid hormone regulatory networks.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability of organ visualization workflows, enabling high-throughput sample processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing direct evidence of target engagement and pathway modulation in a physiological context.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by validating target relevance through conserved endocrine mechanisms observable in a genetic model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and fluorescence microscopy for accurate tissue handling and imaging.
- Dependent on immunostaining reagents and transgenic lines for specific labeling of enzymatic and neuronal markers.
- Necessitates standardized fixation and permeabilization protocols to maintain antigenicity and tissue integrity across samples.
- Involves adaptation challenges when applying the protocol to different developmental stages or tissue types due to size and fragility variations.
- Limited by the need for specialized equipment such as fine forceps, micro scissors, and silicone-coated dishes to prevent tissue damage during dissection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Dissecting the Larval Ring Gland-brain Complex
1:53
Filleting Larvae to Maintain Relative Tissue Positions
3:35
Fine Dissection of the Brain-ring Gland Complex and Mounting
5:34
Dissection of Adult Ovary
6:36
Dissection of Adult Reproductive Organs Along with Other Interactive Tissues
8:15
Mounting of Adult Structures and Imaging
9:33
Results: Preparation images
11:13
Conclusion
