Name: 协议的可视化类固醇机关及其互动器官在果蝇免疫染色果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 学习果蝇类固醇器官免疫染色技术，通过解剖、固定和染色步骤可视化Drosophila幼虫及成虫的激素合成器官及其神经支配结构，揭示昆虫发育与繁殖的调控机制。

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我们感谢 Reiko Kise 和 Tomotsune Ameku 在本研究中提供的技术支持。同时感谢 Kei Ito、Olga Alekseyenko、Akiko Koto、Masayuki Miura、Bloomington Drosophila Stock Center、KYOTO Stock Center（DGRC）以及发育研究杂交瘤库提供的果蝇品系和试剂。本研究得到 Y.S.N. 获得的日本学术振兴会（JSPS）科研费补助金（编号 16K20945）、内藤财团、井上科学研究奖励金资助；以及 R.N. 获得的文部科学省（MEXT）科研费补助金（编号 16H04792）的资助。

注意：整体实验方案流程如图1所示。
1. 幼虫环腺（RG）的解剖
注意：在属于环裂亚目双翅目的D. melanogaster中，咽侧体（PG）位于一个称为环腺（RG）的复合内分泌器官内（图2D）。&#160;由于无法通过手术将PG与其他类型的细胞完全分离（后文将讨论），一个可行的目标是通过解剖分离出完整且未受损的RG。
<ol>
	<li>准备适当发育阶段的幼虫 
	注意：为了同步发育阶段 D. melanogaster 幼虫，必须在较短的时间窗口内收集卵，并在适当的时间收集幼虫。
	<ol>
		<li>在25 °C条件下，于葡萄汁琼脂平板上收集卵2小时。</li>
		<li>收集新孵化的1st 在解剖显微镜下用镊子挑取龄期幼虫，并转移至含有压碎的标准酵母/玉米粉果蝇食物的小瓶中。 
		注意：幼虫的年龄以 &#34;卵孵化后小时数（hAEL）&#34;, &#34;孵化后小时（hAH）&#34;，或 &#34;L3蜕皮后小时数（hAL3E）&#34;.</li>
		<li>在适当的时间点，使用一次性塑料接种环收集处于特定阶段的幼虫，以避免造成不必要的损伤。为尽量减少3个发育阶段之间的发育进程差异rd 龄幼虫，收集第2龄幼虫nd 70小时AEL（48小时AH）的龄期幼虫，每隔2小时使其蜕皮一次，然后收集3龄幼虫rd 在三龄蜕皮后2小时内收集龄期幼虫；该操作可获得0-2小时龄三龄初期幼虫（0-2 hAL3E）。</li>
		<li>将已分级的幼虫转移至盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。</li>
		<li>用PBS冲洗幼虫，以去除体表残留的食物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在解剖显微镜下对幼虫进行粗解剖
	<ol>
		<li>用镊子夹住幼虫的口钩，从幼虫体长前三分之一处切断虫体&#160;微型剪刀</li>
		<li>用一对镊子夹住幼虫前部切端，用另一对镊子轻轻将头部顶端向体内推入，使幼虫体壁外翻内转。 
		注意：对于1的解剖，此步骤可以跳过st 龄幼虫</li>
		<li>用额外的幼虫重复步骤 1.2.1–1.2.2，持续 5–10 分钟。 
		注意：为节省解剖时间，幼虫数量应等于或少于20只。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>幼虫去内脏解剖 
	注意：该方法可保持组织位置不变&#160;完整
	<ol>
		<li>将幼虫仅置于水中1小时。幼虫会因窒息而被固定。</li>
		<li>将幼虫背侧朝上置于硅胶包被培养皿中的一滴PBS液滴中，保持其背侧朝上。 
		注意：背侧有两条纵向走行的气管。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用昆虫针从幼虫前端插入&#160;镊子。将幼虫身体向后拉伸并放置&#160;将第二根针插入幼虫的后端尖端。 
		注意：&#160;除了昆虫针之外，使用钨丝制成的针也可能很有用21可通过加热将针头嵌入移液器吸头中，用作解剖针。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用显微剪刀在尾部附近做一个小切口。从该切口开始，沿背侧中线纵向剪开背侧角质层，向头部方向延伸。注意不要损伤角质层下方的组织。</li>
		<li>将体壁角质层向两侧拉伸，并在解剖后体壁的每个角落各放置一枚大头针，共放置4枚。</li>
		<li>用镊子移除部分前部脂肪体，以暴露&#160;使脑-RG复合体暴露于表面。如有必要，移除一对唾液腺。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织的免疫组织化学固定与染色
	<ol>
		<li>将前三分之一部分&#160;幼虫体（步骤1.2.2）放入含有500 µL固定液（4%多聚甲醛溶于PBS）的1.5 mL微量离心管中。每次固定样本数量少于20个，否则附着在样本上的PBS可能导致固定液被不利稀释。进行肌片解剖时，先移除一滴PBS，再加入一滴固定液。 
		注意：固定液可选用3.7%甲醛或4%多聚甲醛。</li>
		<li>将解剖后的组织在固定液中于室温（RT）孵育30分钟，或在4 °C下孵育2小时。</li>
		<li>用500 µL PBS替换固定液，迅速冲洗样本3次。在室温下，将样本置于摇床上，用500 µL含0.3%辛基酚聚氧乙烯醚的PBS缓冲液（PBT）振荡洗涤15分钟。进行肌片解剖时，取出昆虫针，将样本转移至1.5 mL微量离心管中。 
		注意：为了增强抗体在组织中的渗透性，将样品置于摇床上，在室温下用500 µL 2.0% PBT处理1–2小时。</li>
		<li>用500 µL封闭液（含2%牛血清白蛋白的PBT）替换PBT。将样品在室温下于摇床上孵育1.5小时。</li>
		<li>用50 µL一抗溶液替换封闭液， 即 用封闭液稀释的抗体。</li>
		<li>4 °C 条件下在摇床上孵育样品过夜。</li>
		<li>用500 µL 0.3% PBT替换一抗溶液，并迅速冲洗样品5次。在室温下，将样品置于摇床上，每次用500 µL 0.3% PBT振荡洗涤15分钟，共洗涤3次。</li>
		<li>用50 µL二抗溶液（将荧光标记抗体用封闭液稀释）替换0.3% PBT。进行细胞核染色时，向50 µL二抗溶液中加入0.5 µL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，0.1 mg/mL储存液）&#160;溶液。将样品在室温下于摇床孵育2小时，或在4 °C过夜孵育。 
		注意：将样品避光保存。</li>
		<li>用 500 µL 0.3% PBT 替换抗体溶液，漂洗 5 次。在室温下，用 500 µL 0.3% PBT 洗涤样品 3 次，每次 15 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑-视顶盖复合体（包含颗粒层）的精细解剖与制备
	<ol>
		<li>使用一次性移液管将免疫染色的样品转移至盛有0.3% PBT的培养皿中。 
		注意：为避免在解剖和封片过程中产生不便的气泡，可将0.3% PBT替换为PBS。</li>
		<li>在解剖显微镜下，用一对镊子夹住表皮或口钩。使用连接在1 mL注射器上的27 G针头作为 &#34;刀&#34;，剪断食道前端和眼盘，以从体壁角质层中移除脑-视网膜-眼盘复合体。</li>
		<li>用镊子将食道和肠道与脑-围咽环-眼盘复合体分离。由于食道穿过腹神经索上方的脑部区域，应将肠道向后方拉出。 
		注意：为去除样本中多余的成虫盘，需使用针刀切断脑、眼盘与腿盘之间的连接。</li>
		<li>重复步骤 1.5.1–1.5.4 处理其他样品。 
		注意：为防止组织碎片粘附在样品上，将每个完成处理的样品转移至盛有0.3% PBT或PBS的不同洁净培养皿中。</li>
		<li>用移液器将样品转移至洁净载玻片的中央。 
		注意：对于 2nd 或 3rd 一龄幼虫，应使用剃刀片截断微量移液器吸头的末端。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用镊子将各个样品背侧朝上摆放整齐。 
		注意：RG 位于脑的背侧（图2A这种对齐方式有助于在成像过程中精确定位各个样品。</li>
		<li>倾斜载玻片，尽可能擦去多余的PBT。在载玻片的一侧滴加一滴封片剂。从液滴的另一侧用镊子夹住盖玻片边缘，缓慢将盖玻片覆盖在样品上。 
		注意：此步骤可防止样本移出盖玻片范围。</li>
		<li>将样品置于 4 °C 保存。避光保存样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 卵巢的解剖 成年雌性
<ol>
	<li>成年雌性个体的准备
	<ol>
		<li>用标准的酵母/玉米粉果蝇食物喂养雌性果蝇3-4天，以促进卵巢发育。在25 °C条件下培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成年雌性卵巢的解剖
	<ol>
		<li>用 CO2 麻醉雌蝇2 气体并切断其头部。</li>
		<li>将果蝇尸体转移至盛有PBS的3 cm培养皿中。</li>
		<li>在解剖显微镜下，用镊子夹住胸部背面&#160;镊子。用另一把镊子夹住腹部第5或第6节段并剥离&#160;腹部体壁向后端。从尖端擦去黏性体壁&#160;镊子</li>
		<li>捏住输卵管并将卵巢从体内取出。</li>
		<li>用镊子梳理并展开卵巢的末端。 
		注意：该操作可提高免疫染色的效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成年雌性果蝇脑、腹神经索及生殖器官的解剖 
	注意：该方法可保持卵巢神经支配的完整性。
	<ol>
		<li>用 CO 麻醉雌性果蝇2 气体并转移至盛有PBS的硅化培养皿中。</li>
		<li>在解剖显微镜下，用镊子夹住吻部，剥离头部角质层以暴露脑组织。去除附着在脑部的气管。 
		注意：脑部为白色、圆形结构，与胸部的腹神经索（VNC）相连。</li>
		<li>用一对镊子夹住胸部背侧，剪去腿部和翅膀。用另一对镊子从腿部基部剥离胸部腹侧表皮。暴露腹神经索（VNC）后，去除附着在腹神经索上的残余背侧表皮和肌肉&#160;镊子。注意不要损伤脑与腹神经索之间的连接。</li>
		<li>使用镊子剥离腹部的角质层&#160;暴露卵巢及其相互作用的器官，包括神经元、嗉囊、肠道、输卵管、子宫和附属腺体。</li>
		<li>使用镊子去除残留的组织，包括气管和脂肪体&#160;镊子</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织的免疫组织化学固定与染色
	<ol>
		<li>将大约8-10对卵巢转移至含有250 µL固定液（4%多聚甲醛PBS溶液）的1.5 mL微量离心管中，在室温下孵育30分钟。</li>
		<li>用500 µL PBS替换固定液，并迅速清洗样本3次。</li>
		<li>在室温下，用500 µL 0.1% PBT 洗涤样品2次，每次5分钟。</li>
		<li>用50 µL封闭液替换PBT。将样品在室温下于摇床上孵育1小时。</li>
		<li>用50 µL一抗溶液替换封闭液。</li>
		<li>4 °C 条件下在摇床中孵育样品过夜。</li>
		<li>替换&#160;用500 µL含0.1% PBT的初级抗体溶液孵育样本。在室温下，于摇床上用500 µL含0.1% PBT溶液洗涤样本3次，每次15分钟。</li>
		<li>用50 µL二抗溶液替换0.1% PBT。进行细胞核染色时，加入0.5 µL DAPI &#160;至 50 µL&#160;溶液中，室温下在摇床上孵育样品2小时。</li>
		<li>将二抗溶液替换为500 µL 0.1% PBT。在室温下，于摇床上用500 µL 0.1% PBT对样品进行洗涤，每次15分钟，共洗涤3次。 
		注意：洗涤步骤可在 4 °C 条件下过夜进行。样品需避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品固定在载玻片上
	<ol>
		<li>使用微量移液器将样品转移至含0.1% PBT的玻璃载片上。 
		注意：为避免在解剖和封片过程中产生不便的气泡，可将0.1% PBT替换为PBS。</li>
		<li>对于卵巢，使用镊子在解剖显微镜下将各卵巢管细线彼此分离，注意不要损伤含有生殖腺末端的卵巢管尖端。对于脑-腹神经索-生殖器官复合体，去除残留的角质层，并将其置于载玻片上，调整位置。</li>
		<li>尽可能擦去多余的 PBT，然后在样品中央滴加一滴封片剂。缓慢放置盖玻片，使用&#160;镊子</li>
		<li>将样品置于 4 °C 保存。避光保存样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用共聚焦激光扫描显微镜进行成像
<ol>
	<li>在显微镜下观察样本，将类固醇生成器官置于视野中。视野固定后，将成像系统切换至图像采集模式。 
	注意：使用10-20倍物镜获取脑-生殖腺复合体或整个卵巢的图像。 alternatively，可使用40-63倍物镜（水镜或油镜）观察生殖干细胞中蛋白质的亚细胞定位，以及咽侧体和卵巢的神经支配。</li>
	<li>在连接的软件中设置图像采集参数。选择荧光组合（例如 GFP 和 RFP）。通过快速扫描程序，调节激光功率、探测器灵敏度（增益/偏移）以及针孔大小。 
	注意：为了获得高质量的图像，应针对每个样品优化扫描激光功率和探测器灵敏度（增益）。为了清晰显示组织的轮廓，除荧光图像外，还可同时采集透射光图像。</li>
	<li>拍摄图像的Z轴层扫。在&#160;连续快速扫描时，使用显微镜的聚焦驱动移动焦平面，并设定起始位置和终止位置。切片数量及&#160;切片之间的间隔距离相应调整。</li>
	<li>选择扫描速度、扫描方法和双向扫描模式。</li>
	<li>&#34;开始真正的扫描以进行图像采集。</li>
	<li>保存图像&#160;附加软件的格式。 
	注意：原始图像文件包含图像采集参数和比例尺信息。导出的图像可在计算机上使用图像处理软件进行后续处理。22.</li>
</ol>

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<li>Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+calcium+imaging+in+the+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Gen.+Subjects%22%5BJournal%5D)">Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster.</a> BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).</li>
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</ol>

未声明利益冲突。

我们研究了黑腹果蝇（D. melanogaster）中蜕皮甾醇的生物合成及其调控机制，并设计了一套用于组织解剖和免疫染色的实验方案。蜕皮甾醇的生物合成时间受环境信号通过神经输入的影响33，因此在解剖过程中必须保持蜕皮甾醇合成器官与脑、腹神经索（VNC）及其他组织之间的神经支配完整性。
如上所述，&#160;D. melanogaster PG 与咽侧体（corpora allata, CA）和心侧体（corpora cardiaca, CC）共同构成一个复杂的内分泌器官——围咽器官（RG）图 2D）。尽管咽侧体（PG）产生蜕皮类固醇，但咽侧体（CA）和心侧体（CC）分别产生保幼激素和脂肪体激活激素。这一解剖学特性已成为研究中的障碍&#160;研究正在研究&#160;蜕皮类固醇生成 D. 黑腹果蝇与其他昆虫相比。然而，在过去的几十年中，果蝇遗传学研究使我们能够鉴定出许多特异性表达于咽侧体（PG）的蜕皮类固醇...

在多细胞生物中，一群细胞具有特定的生物活性功能，这对整个机体至关重要。为了完成其功能，每种组织或器官都会表达一系列与其功能相关的基因，并与其他组织进行通讯，以协调发育过程中的各项活动。为了表征这些特化的细胞功能及器官间的相互作用，我们需要特异性地标记某一类细胞，同时保持多细胞结构中其他类型的细胞完整不变。
这类特化器官的一个例子是类固醇生成器官，其中多种生物合成酶介导了从胆固醇转化为活性类固醇激素的各个步骤1。这些酶基因中的大多数仅在类固醇生成器官中特异性表达，并且该生物合成途径通过体液输入和神经输入受到多种外界刺激的严密调控。一旦合成，类固醇激素即被分泌到血淋巴中，并作用于多种组织和器官，以调控大量基因的表达2。因此，类固醇激素的作用可诱导产生系统性反应，以维持机体稳态、生长和繁殖。
为了研究类固醇激素生物合成的功能以及类固醇激素的多效性作用， 黑腹果蝇 可作为合适的模型系统。在幼虫阶段，昆虫类固醇激素蜕皮激素在一种称为前胸腺（prothoracic gland, PG）的特化内分泌器官中生物合成。3在咽侧体（PG）中，多种合成蜕皮激素的酶特异性催化胆固醇转化为蜕皮酮的多步反应，该激素在适当的发育阶段调控蜕皮和变态过程。4因此，一种动态变化在&#160;蜕皮激素滴度受多种信号通路调控，以响应环境信号。另一方面，在成虫阶段，蜕皮激素在生理过程中发挥关键作用，包括生殖、睡眠、记忆和寿命。5,6,7,8已知蜕皮类固醇在卵巢中被积极生物合成，调控卵子发生进程6,7,8,9,10,11最近我们报道了在交配刺激下，生殖系干细胞（GSCs）的数量受到蜕皮甾醇和性肽信号通路的影响。12.
强大的工具 D. melanogaster 遗传学与细胞生物学，包括注释完善的基因组信息、双元基因表达系统以及转基因RNA干扰技术，使我们能够鉴定出在前胸腺和卵巢中对蜕皮类固醇生物合成至关重要的基因13,14,15一旦鉴定出蜕皮类固醇生成相关基因，便可研究这些基因在生物合成途径中的转录调控机制以及基因产物的动态定位16定量逆转录-聚合酶链式反应，RNA 原位 杂交和免疫组织化学分析被实施。这些技术的应用包含一项具有挑战性的任务；&#160;精细解剖咽侧体或卵巢。特别是，果蝇的咽侧体相较于其他昆虫而言相对较小（例如 家蚕和丽蝇），因此需要练习果蝇解剖这一关键技能以进行取样。此外，两种蜕皮类固醇生成器官均接受来自中枢神经系统（CNS）的神经支配17,18,19,20因此，为了进行准确的解剖学分析，应保持蜕皮甾类生成器官与中枢神经系统及其他器官的完整，以免破坏其神经连接。
本文提供了黑腹果蝇（D. melanogaster）类固醇合成器官的解剖与可视化实验方案。掌握解剖技术是开展这些&#160;实验的关键起点。此外，可利用多种抗体及GAL4驱动品系，成功标记类固醇合成器官及其相互作用的器官。通过结合这些技术、材料与遗传工具，研究者可深入探究类固醇激素生物合成的全面机制。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;卵收集&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿（55 mm）</td><td>AS ONE</td><td>1-8549-02</td><td>&amp;nbsp;用于葡萄汁琼脂平板</td></tr><tr><td>收集杯</td><td>光科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母膏</td><td>东方干酵母，东京</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% 葡萄汁</td><td>Welch Food Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;饲养幼虫&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小瓶（12 ml，40&amp;times;23.5 毫米，聚苯乙烯（PS）</td><td>SARSTEDT</td><td>58.487</td><td></td></tr><tr><td>一次性接种环</td><td>AS ONE</td><td>6-488-01</td><td></td></tr><tr><td>标准果蝇食物</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;布卢明顿果蝇中心网站上的收货人信息。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;解剖&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>S8 AP0</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿（35 × 10 mm，未处理）</td><td>IWAKI</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>TORAY</td><td></td><td>在培养皿中包埋硅</td></tr><tr><td>Terumo 针头（27G，0.40 × 19 mm）&amp;nbsp;</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td>A &quot;刀&quot; 切割组织</td></tr><tr><td>镊子，Inox，#5</td><td>杜蒙，瑞士</td><td></td><td></td></tr><tr><td>昆虫针（直径0.18 mm）</td><td>志贺品牌</td><td></td><td>用于去骨解剖</td></tr><tr><td>微型剪刀</td><td>NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.&amp;nbsp;</td><td>MB-50-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;固定&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>默克密理博</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Nacalai Tesque</td><td>16222-65</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Nacalai Tesque</td><td>02890-45</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>微型离心管（1.5 ml）</td><td>INA OPTIKA</td><td>CF-0150</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;孵育&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>As one Swist Mixer TM-300（摇床）</td><td>作为一个</td><td>TM-300</td><td>摇床</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗Sro抗体（豚鼠），1:1000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗GFP（兔），1:1000</td><td>分子探针</td><td>A6455</td><td>Shimada-Niwa 和 Niwa，2014</td></tr><tr><td>抗GFP（小鼠单克隆抗体，GF200），1:100</td><td>Nakarai tesque</td><td>04363-66</td><td></td></tr><tr><td>抗5HT（兔），1:500</td><td>SIGMA</td><td>S5545</td><td></td></tr><tr><td>抗Hts 1B1（小鼠）</td><td>发育研究杂交瘤库 (DSHB)</td><td>1B1</td><td></td></tr><tr><td>抗DE-钙黏蛋白（大鼠），1:20</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td></td></tr><tr><td>抗nc82（小鼠），1:50</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;二抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 546标记</td><td>Life Technologies</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗豚鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 555标记</td><td>Life Technologies</td><td>A-21435</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 荧光染料标记的鬼笔环肽</td><td>Life Technologies</td><td>A-22283</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;封片剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微载玻片</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>SS7213</td><td></td></tr><tr><td>方形显微镜盖玻片</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>C218181</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave 封片剂（封片试剂）</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>移液管 1 ml（一次性滴管）</td><td>WATSON</td><td>5660-222-1S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;成像&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 激光扫描共聚焦显微镜系统</td><td>卡尔·蔡司</td><td></td><td>倒置 Axio Observer. Z1 SP 左侧</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;图像处理&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 ZEN</td><td>卡尔·蔡司</td><td></td><td>它是一个基于 64 位 Microsoft Windows 7 操作系统的特殊用户界面</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;果蝇品系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w；GMR45C06-GAL4</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;来自布卢明顿果蝇资源库。（#46260）</td></tr><tr><td>UAS&amp;ndash;GFP；UAS&amp;ndash;mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>东京大学伊藤K.惠赠</td></tr><tr><td>w[1118]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w；UAS-mCD8::GFP；TRH-GAL4</td><td></td><td></td><td>参见参考文献29，Alekseyenko, O. V, Lee, C. &amp;amp; Kravitz, E. A. (2010)</td></tr><tr><td>w；UAS-mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;来自布卢明顿果蝇资源中心。（#32188）</td></tr><tr><td>yw;; nSyb-GAL4</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;来自布卢明顿果蝇资源中心。（#51941）</td></tr></tbody></table>

在果蝇 drosophila melanogaster 中通过免疫染色可视化类固醇生成器官及其相互作用器官的实验方案

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

在多细胞生物中，少数细胞群体具有特殊的生物合成功能，能够诱导机体对生长和繁殖产生系统性反应。&#160;在昆虫中，幼虫期的前胸腺（PG）和成虫雌性卵巢在合成一类主要的类固醇激素——蜕皮类固醇（ecdysteroids）中发挥关键作用。这些合成蜕皮类固醇的器官受到神经系统的神经支配，&#160;其生物合成的时机可受环境信号的调控。本文介绍了一种用于可视化果蝇 Drosophila melanogaster 幼虫和成虫中蜕皮类固醇合成器官及其相互作用器官的实验方案，该体系是研究类固醇激素生物合成及其调控机制的适宜模型。通过熟练的解剖技术，可保持蜕皮类固醇合成器官及其相互作用器官（包括脑、腹神经索及其他组织）的原始位置。利用针对蜕皮类固醇合成酶的抗体进行免疫染色，结合组织特异性启动子驱动的转基因荧光蛋白标记，可有效标记蜕皮类固醇合成细胞。此外，还可利用特异性抗体或多种神经元类型中表达的GAL4驱动系对蜕皮类固醇合成器官的神经支配进行标记。因此，可通过免疫染色与转基因技术&#160;同时可视化&#160;蜕皮类固醇合成器官及其神经连接。最后，本文还描述了如何可视化生殖系干细胞，其增殖与维持受蜕皮类固醇的调控。该方法有助于全面理解类固醇激素的生物合成过程及其神经调控机制。

我们采用上述方案对黑腹果蝇（D. melanogaster）幼虫及成年雌性个体中的类固醇生成器官及其相互作用器官进行可视化观察。各方案的整体流程如图1所示。
RG，包括 PG（图2D)，比脑小且更透明，位于脑的前背侧图2A-C 和 3A-E）。为了标记PG细胞，多个研究团队已针对蜕皮类固醇合成酶开发了多种类型的抗体 (即，永无乡23，更吓人24，Shroud20，模体25, 无实体25和阴影26）。其中，抗Shroud（Sro）抗体可稳定用于通过免疫染色标记PG图2C, 2E，以及 3C</str...

我们描述了一种用于解剖、固定和免疫染色黑腹果蝇（Drosophila）幼虫及成年雌性个体中类固醇生成器官的实验方案，以研究类固醇激素的生物合成及其调控机制。除了类固醇生成器官外，我们还对这些器官的神经支配以及类固醇作用的靶细胞（如生殖系干细胞）进行可视化观察。

在果蝇 Drosophila melanogaster 中通过免疫染色可视化类固醇生成器官及其相互作用器官的实验方案

在多细胞生物中，一小群细胞因其生物发生活性而具备特殊功能，可诱导产生系统性反应……

本实验的总体目标是观察黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫或成年雌性个体中的类固醇生成器官及其相互作用器官。该方法有助于理解昆虫类固醇激素的生物合成过程，以及调控交配行为和变态发育的神经调节机制。该技术的主要优势在于，类固醇生成器官的神经支配及其与相互作用器官之间的相对位置关系能够保持完整。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为果蝇幼虫的类固醇生成器官非常微小且透明。我们实验室很乐意分享我们的解剖方案。现在，让我们开始吧。制备好幼虫后，在装有PBS的3厘米培养皿中，于解剖显微镜下开始进行长程解剖。首先，用镊子夹住口钩。然后，使用显微剪刀从身体前端约三分之一处将虫体剪断。接下来，用一对镊子夹住幼虫的前端，在10分钟内用另一对镊子轻轻将头部顶端推入体内，使幼虫体壁完全翻转。以该方法在10分钟内最多准备20只幼虫，随后将其转移至固定液中。30分钟后，洗涤样品，然后进行免疫染色。首先，将幼虫浸没在水中约一小时，使其窒息从而达到固定幼虫的目的。然后，将一只幼虫背面向上放置于涂有硅胶的培养皿中的 PBS 液滴中。背侧具有两条气管。在解剖显微镜下，使用镊子将昆虫针插入虫体前端。然后，将虫体向后拉伸，并在尾端插入第二根针。接着，使用显微剪刀在尾部附近做一个小切口。从切口处开始，沿背侧中线向头部方向纵向小心切开背侧角质层，注意不要损伤角质层下方的任何组织。完成切口后，将体壁向两侧拉开，并用昆虫针在四角固定。然后用镊子移除前部的脂肪体和唾液腺，从而暴露位于表面的脑-环腺复合体。现在，吸去 PBS，将样本浸入固定液中。30 分钟后，用镊子取下昆虫针，并将样本转移至含有 0.3%PBT 的微量离心管中。随后，进行免疫染色。免疫染色幼虫后，使用一次性移液管将样品转移至盛有0.3% PBT的培养皿中。在解剖显微镜下，用一对镊子夹住幼虫的表皮或口钩。然后，使用连接在1毫升注射器上的27号针头，像使用刀具一样切断食道前端和眼原基，从而将脑-环腺-眼原基复合体从体壁表皮中分离出来。接下来，使用镊子小心地将食道和肠道从脑-环腺-眼盘复合体上分离。将肠道拉向后方，因为食道位于腹神经索上方并穿过脑部。最后，用解剖针刀小心切断脑盘、眼盘与腿盘之间的连接，以分离出脑-环腺复合体。解剖过程中使用刃口锋利的精细镊子至关重要。强烈建议您用磨石打磨镊子，使其刃口紧密贴合，无任何缝隙。转移样品时，请使用带有宽口吸头的微量移液器。将样品置于载玻片中央。然后用镊子将样品调整至腹面朝上，以便对位于脑部背面的环腺进行成像。接着倾斜载玻片，尽可能擦去多余的PBT。然后，在样品附近滴加一滴封片剂，用镊子将盖玻片缓慢地先覆盖在封片剂上，再覆盖到样品上。为了分离成年雌性果蝇的卵巢，先用二氧化碳气体麻醉果蝇，然后切下其头部，并将其身体转移到盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的3厘米培养皿中。接下来，在解剖显微镜下，用镊子夹住胸部的背侧，并用另一把镊子抓住第5或第6腹节。然后，将腹部表皮向后侧剥离。操作前，需将镊子上粘附的表皮残渣清理干净。接下来，夹住一条卵巢管，分离出卵巢。然后用镊子梳理并展开卵巢的末端。展开后，将卵巢浸入固定液中固定30分钟，以备染色。为了制备保留卵巢神经支配的样本，将麻醉后的雌性果蝇转移至盛有 PBS 的硅胶涂层培养皿中。在解剖显微镜下，夹住吻部，剥离头部的表皮以暴露脑组织。从脑组织上除去附着的气管，保留脑与腹神经索的连接。然后，从背侧握住胸部，去除足和翅。接着，从每条足的基部开始，剥除胸部的腹侧表皮。一旦腹神经索暴露，需使用镊子非常小心地去除附着在腹神经索上的残余背侧表皮和肌肉。切勿损伤脑与腹神经索之间的连接。接下来，使用镊子剥离腹部体壁，以暴露卵巢及其相关器官，包括支撑结构、肠道、输卵管、子宫和附属腺体。最后，清除所有残留组织，包括气管和脂肪体。然后，将样品浸入固定液中30分钟，以进行免疫染色前的准备。免疫染色后，使用微量移液器将样品转移至含有0.1%PBT的载玻片上。接着，在显微镜下观察载玻片，并用镊子将卵巢管的串状结构彼此分离。在此过程中切勿损伤卵管末端，因其含有生殖腺。在制备脑与生殖器官复合体时，应去除任何残留的角质层，并将结构展开铺于载玻片上。接下来，擦去大部分多余的 PBT，然后向样本上滴加一滴封片剂。接着，用镊子将盖玻片缓慢地放置在载玻片上，并将载玻片置于 4 摄氏度避光保存。随后在显微镜下观察样本，并将类固醇生成器官移入视野中。固定视野后，将成像系统切换至图像采集模式。在幼虫阶段，使用针对蜕皮类固醇生成酶的抗体（包括抗-shroud 抗体）对前胸腺进行标记。为了观察前胸腺与脑之间的神经连接，解剖了脑-环腺复合体。通过去膜解剖法可观察到口胃神经系统，其中一群5-羟色胺能神经元投射至前胸腺、前胃和咽部肌肉。在成年雌性个体中，卵巢蜕皮类固醇激素影响卵子发生过程的多个方面，例如生殖干细胞（GSC）的增殖。GSC位于卵巢每个卵小管末端的生殖囊中。在卵原区中，使用两种抗体1B1和DE-cadherin特异性地标记了生殖干细胞（GSCs）。为了观察卵巢的神经支配情况，解剖了卵巢以及脑、腹神经索（VNC）、肠道、受精囊、子宫和交配囊。在n-Synaptobrevin GAL4驱动下，通过mCD8:GFP标记来可视化神经元。此外，使用双偶联鬼笔环肽对肌肉结构进行染色。尽管类固醇生成器官的解剖最初可能感觉较难，但可通过观看本视频学习组织的切割位点，从而更轻松地分离器官并避免损伤。我们希望本实验方案不仅对初学者，也对有经验的研究人员具有参考价值。一旦掌握，您便可将此方法应用于自身研究，并根据需求进行调整优化。我们希望本实验方案有助于全面理解类固醇激素的生物合成过程。更详细的分步操作流程请参见相关论文。请查看。

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