后期阶段的胚胎和幼虫的超声，促进免疫荧光染色果蝇组织原位

免疫染色是一种可视化组织内特定细胞类型和蛋白质的有效技术。通过利用超声处理，此处描述的方案减轻了在免疫染色前从晚期胚胎和幼虫中解剖黑腹果蝇组织的需要。我们提供了一种有效的方法，用于甲醛固定的整个安装幼虫的免疫染色。

该程序的总体目标是在超声处理后使用荧光显微镜观察或填充 C 2 中的组织。这是通过首先收集胚胎和幼虫样品，然后使用甲醛、庚烷和甲醇固定它们来实现的。第二步是对固定样品进行超声处理，以去除角质层以允许抗体渗透。

接下来，使用一抗和荧光二抗对样品进行免疫染色。最后一步是将样品封片在基于甘油的 Antifa 溶液中。最终，共聚焦或 epi 荧光显微镜用于可视化发育中的组织以及蛋白质表达和定位。

与组织解剖等其他方法相比，该技术的主要优点是它允许对各种发育中的组织进行可视化。通常，刚接触这种方法的人会遇到困难，因为超声处理步骤取决于许多因素来实现最大效率，包括声波探头的正确定位。演示该程序的是 Ashley Fiddler 和 Lauren Bole，他们是我实验室的两位才华横溢的本科生研究人员。

要开始实验，请使用与磷酸盐缓冲液 Triton X 100 或 PBTX 溶液结合的小油漆刷小心地去除收集在琼脂平板上的胚胎。接下来，将装有样品的画笔擦拭到细胞过滤器的内侧脊上。将培养皿盖放在细胞过滤器下方。

然后用含有 PBTX 的喷瓶冲洗画笔和细胞过滤器的壁。将样品转移到过滤器后，将足够的 PBTX 倒入过滤器中，使样品从筛网上抬起。重复此步骤 3 次以去除酵母和苍蝇废物，去除 PBTX。

然后将 50% 漂白剂溶液倒入过滤器中，让幼虫在溶液中静置 5 分钟。接下来，删除解决方案。然后用 PBTX 洗涤样品，让样品在溶液中静置 3 分钟。

重复该步骤五次，擦干细胞过滤器的底部。然后使用与 PBTX 缠绕的画笔将样品转移到含有 1.75 毫升 PEMS 的闪烁瓶中。在通风橱中，加入 250 微升 37% 甲醛和 8 毫升试剂级。

庚烷加入闪烁样品瓶中，并以 200 RPM 的转速摇动样品瓶 20 分钟。然后向闪烁瓶中加入 10 毫升甲醇，不去除水相，并以 500 RPM 的转速剧烈摇晃。摇晃后立即将内容物倒入液体废液容器上的细胞过滤器中。

向样品瓶中加入额外的甲醇，并将内容物流过细胞过滤器。确保已移除整个样品。尝试用实验室组织填充细胞过滤器的底部。

然后用画笔将样品从过滤器转移到含有 0.5 mL甲醇的 1.5 mL 微量离心管中。等待样品沉淀。然后用移液管除去甲醇，并用新鲜的 0.5 毫升等分试样的甲醇代替。

重复此步骤 3 次，最后向试管中加入 0.5 毫升甲醇，然后在零下 20 摄氏度下储存。稍后，从冰箱中取出储存的样品，然后用移液管去除甲醇。然后向试管中加入 1 毫升 50% 甲醇磷酸盐缓冲补间或 PBTW 溶液，摇动试管 3 分钟。

接下来，用 1 毫升 PBTW 冲洗样品两次，让样品沉淀，然后用移液管吸出 PBTW，向样品瓶中加入 1.0 毫升牛血清白蛋白磷酸盐缓冲吐温，或 BBTW，并摇动 3 分钟。让样品沉淀并用移液管去除 BBTW。重复此步骤两次。

注意在不丢失任何样品的情况下去除尽可能多的 BBTW。然后在试管中加入 0.5 毫升 BBTW 并将其置于冰上。接下来，将超声处理液设置为 10% 最大振幅和持续运行时间为 2 秒，将探头尖端放入装满去离子水的 50 毫升锥形管中清洁探头，然后运行超声处理液。

然后用实验室组织干燥超声探针。将探针浸入样品上方 3 至 4 毫米的试管中，然后开始超声处理。然后取出试管并将其置于冰上 30 秒，以防止超声处理过热，并让样品沉淀在试管底部。

超声处理完成后，根据样品年龄的要求重复此步骤。用 1 毫升 BBTW 冲洗样品两次。每次冲洗后，让样品沉淀，然后擦干 BBTW 用移液管向样品瓶中加入 1 毫升 BBTW 并将其放在摇杆上。

三分钟后，让样品沉淀并用移液管去除 BBTW。然后重复此作。步骤 2 次，用 0.5 mL用 BBTW 稀释的 5% 正常血清封闭样品到试管中，并将样品在室温下放在摇杆上 1 小时。

接下来，加入 0.5 毫升一抗溶液，在 4 摄氏度下摇动样品过夜，让样品沉降到试管底部。然后用移液管吸出一抗，并用 1 毫升 BBTW 冲洗两次。向小瓶中加入 1 毫升 BBTW，然后将其放在摇杆上 3 分钟。

然后用移液管取出 BBTW 并重复此作。步骤 5 次，用 5% 正常血清 BBTW 溶液封闭样品，摇动 30 分钟。然后删除溶液。

加入用 5% 正常血清 BBTW 溶液稀释的二抗，并用铝箔包裹试管。然后将样品在 4 摄氏度下摇动过夜。用移液管吸出二抗，然后用 1 毫升 PBTW 冲洗样品两次。

接下来，向小瓶中加入 1 毫升 PBTW，并将其放在摇杆上 5 分钟。然后让样品沉淀并用移液管去除 PBTW。重复此作。

步骤 3 次。向试管中加入 80 至 100 微升 DAB co 溶液，并将其储存在零下 20 摄氏度。最后，要封片样品，请使用 5 至 10 微升的 dab BCO p lene diamine 或 PPD 抗褪色剂。

然后用荧光显微镜观察它。四个共聚焦切片的这些 Z 投影证明了该方案在果蝇发育的胚胎晚期到早期和中期 L 三个阶段可视化 C 2 中的形态特征和单个细胞的有效性。睾丸发育是说明方案功效的一个特别好的系统，因为睾丸成熟在整个幼虫发育过程中是动态的。

这些图像突出显示了红色的生殖细胞和绿色的枢纽细胞和 FU 区，即 L 中三个大脑的单共聚焦切片。用于神经节母细胞、绿色未分化神经元和未成熟神经元以及原代神经元的免疫染色。红色显示脑叶和腹侧神经索中具有不同表达模式的强烈染色，根据安装方向，成像允许从背表面、腹面或矢状横截面观察脑组织。

这种原位 2 技术使生物学家能够探索生物体组织形态发生的器官发育，其中保护性角质层阻止抗体渗透。观看本视频后，您应该对如何对晚期胚胎和幼虫食管样本进行超声处理和免疫染色，以便可视化 C 2 中发育中的组织。不要忘记，与甲醛、庚烷和甲醇一起工作可能非常危险，并采取预防措施，例如在通风橱中工作。

执行此程序时应始终佩戴适当的手套和实验室外套。