Name: 后期阶段的胚胎和幼虫的超声，促进免疫荧光染色果蝇组织原位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学习利用超声波处理技术对黑腹果蝇胚胎和幼虫进行免疫荧光染色，实现组织原位可视化。该方法无需解剖即可观察蛋白质表达与定位，显著提升发育生物学研究效率。

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我们感谢Ruth Lehman和Dorthea Godt慷慨提供了Vasa和Traffic Jam抗体。我们谨向印第安纳大学布卢明顿品系中心致谢，该中心负责保藏所提供的果蝇品系；同时感谢由NICHD资助、爱荷华大学维护的发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）。我们感谢Wawersik实验室所有成员给予的建议与支持。本研究由Monroe Scholars项目资助（资助号：AF和LB）以及美国国家科学基金会（NSF）资助（项目号IOS0823151，MW）提供经费支持。

1. 收集笼的制备
<ol>
	<li>用 CO2 麻醉年轻且具有繁殖能力的果蝇，将麻醉后的果蝇转移至饲养笼中。为获得最佳产量，使用 100–120 只年龄在 2–7 天之间的成年果蝇，雌雄比例为 4:1。在取样固定前，让果蝇适应环境约 24 小时。若饲养笼中使用的是 virgin 雌蝇与雄蝇交配，则应采用 36–48 小时&#160;的适应期。</li>
	<li>在饲养笼的开口端放置一个预先制备好的苹果汁琼脂平板，平板中央滴加一枚硬币大小的酵母糊，覆盖住笼口，然后用胶带固定。再用 Parafilm 密封苹果汁琼脂平板与饲养笼之间的接缝。</li>
	<li>将饲养笼置于一个以苹果汁琼脂平板为底的次级容器中，并根据实验需求在设定温度下让果蝇繁殖适当时间。 
	注意：样品采集时间会有所不同。例如，当收集晚期胚胎/早期一龄幼虫（17–24 小时）时，先让果蝇在 25 °C 下于苹果汁琼脂平板上产卵 7 小时，随后在 25 °C 下继续培养样品 17 小时。类似地，若要收集中期至晚期一龄幼虫（36–48 小时），则先让果蝇在 25 °C 下产卵 12 小时，再于 25 °C 下培养 36 小时。</li>
	<li>当设定时间结束后，轻敲饲养笼使其果蝇脱离苹果汁琼脂平板（无需麻醉）。迅速将已使用的平板更换为含有酵母糊滴的新鲜平板，用胶带和 Parafilm 固定新平板，并将饲养笼以苹果汁琼脂平板为底存放。</li>
	<li>用金属刮刀小心地从已使用的平板上移除酵母滴。盖上已使用苹果汁琼脂平板的盖子，如有实验需要，可让已产下的胚胎继续发育。 
	注意：在胚胎发育过程中，平板可在 25 °C 下保存，除非实验要求更高温度。上述步骤（参见步骤 1.3 的注释）已说明如何进行胚胎发育处理。在样品发育前去除酵母糊，是为了防止幼虫钻入酵母中并破坏下方的琼脂。残留的苹果汁琼脂和少量酵母成分仍可为幼虫生长提供营养。虽然直接产在酵母糊中的胚胎会因去除酵母而丢失，但这种损失优于样品中残留酵母和琼脂碎片对染色效率的不利影响。如果选择不移除酵母糊，可在固定前使用磷酸盐缓冲液 Triton X-100（PBTx）将酵母液化，用画笔混匀，再通过细胞筛网从样品中去除。</li>
</ol>
2. 固定
<ol>
	<li>当苹果汁琼脂平板上产下的胚胎发育至所需时间点时，使用蘸有磷酸盐缓冲液吐温 X-100（PBTx）溶液的小型画笔，小心地将样品从平板上移除。 
	注意：较老的幼虫具有活动能力，可能会爬到平板盖内侧。此类样品也可用画笔以同样方式收集。</li>
	<li>将带有样品的画笔在细胞筛网内侧的凸缘处轻轻擦拭。然后，用装有 PBTx 溶液的冲洗瓶冲洗筛网壁和画笔。在筛网下方放置一个培养皿盖，用于收集流下的 PBTx 溶液。</li>
	<li>待所有样品转移至筛网后，向筛网中倒入足量 PBTx 溶液，使样品脱离滤网表面。随后提起筛网，将培养皿中的内容物倒入液体废液容器中。</li>
	<li>重复步骤 2.3 三次，以去除随样品一同转移的酵母及果蝇代谢废物。</li>
	<li>向筛网中倒入足量 50% 次氯酸钠（NaOCl）/水（ddH2O）溶液，使幼虫脱离滤网表面。让幼虫在溶液中静置 5 分钟。然后提起筛网，将培养皿中的内容物倒入液体废液容器中。 
	注意：仅在发育时间为 0–22 小时的胚胎样品中需要使用漂白剂，以去除卵壳膜。对于较老的样品可省略此步骤，但保留使用亦无不良影响。如需省略，可用 PBTx 替代本步骤中的漂白剂。稀释后的漂白剂应在配制后 24 小时内使用。</li>
	<li>用 PBTx 溶液清洗筛网中的样品：向筛网中倒入足量 PBTx 溶液，使样品脱离滤网表面。让样品在溶液中静置 3 分钟。然后提起筛网，将培养皿中的内容物倒入液体废液容器中。</li>
	<li>重复步骤 2.6 五次。</li>
	<li>用实验纸巾将细胞筛网底部轻轻吸干，然后用画笔将筛网中收集的样品转移至含有 1.75 ml PEMS 溶液的闪烁瓶中。</li>
	<li>在通风良好的通风橱中操作，向闪烁瓶中加入 250 μl 37% 甲醛和 8 ml 试剂级正庚烷。 
	注意：甲醛和正庚烷具有危害性。出于安全考虑，在步骤 2.9 至 3.3 中应持续在通风橱内操作，并佩戴适当的防护手套。</li>
	<li>将闪烁瓶置于摇床上，以 200 rpm 或类似中等速度振荡 20 分钟。</li>
	<li>不移除前一步的水相，直接向闪烁瓶中加入 10 ml 甲醇，并以 500 rpm 的速度剧烈振荡 1 分钟。 
	注意：甲醇具有危害性。请继续在通风橱内操作，并佩戴适当的防护手套。</li>
	<li>从摇床取下闪烁瓶，立即将其内容物倒入通风橱内的细胞筛网，下方放置液体废液容器。如有需要，向瓶中补充额外甲醇并再次通过筛网，以确保所有样品均被转移。 
	注意：细胞筛网排液可能较慢。为加快流速，可用实验纸巾轻触筛网底部，以毛细作用加速液体通过。甲醇、甲醛和正庚烷应收集于合适的废液容器中，并根据机构规定进行妥善处理。</li>
	<li>用实验纸巾将细胞筛网底部吸干，然后用画笔将筛网中截留的样品转移至含有 0.5 ml 甲醇的 1.5 ml 微量离心管中。 
	注意：若同时处理多个闪烁瓶，请逐个完成步骤 2.12 和 2.13，以防止样品在筛网上干燥。</li>
	<li>样品转移至微量离心管后，用移液器吸除甲醇。确保样品已完全沉降至管底。</li>
	<li>向微量离心管中加入约 0.5 ml 甲醇，对样品进行清洗。待样品沉降后，用移液器吸除甲醇。</li>
	<li>重复步骤 15 三次。</li>
	<li>向管中加入 0.5 ml 甲醇，随后将样品置于 -20 °C 冰箱中保存，以备后续使用。</li>
</ol>
3. 免疫染色样品的复水与制备
<ol>
	<li>用移液器从微量离心管中移除甲醇，使样品保留在管内。将甲醇废液收集至适当的废液容器中，待后续按规定处理。 
	注意：为提高超声处理效率，应确保1.5 ml微量离心管底部的样品沉淀厚度不超过3 mm。若样品过多，可在开始上述复水步骤前，用移液器将多余样品转移至另一管中。使用洁净的剃须刀片切去移液器吸头尖端，可防止吸头堵塞。</li>
	<li>向管中加入&#160;1.0 ml 50%甲醇/磷酸缓冲液吐温（PBTw）溶液，并轻轻摇动3分钟。</li>
	<li>将甲醇溶液移至适当的废液容器中，并用1.0 μl PBTw冲洗两次。每次冲洗后，待样品沉降，再用移液器吸走上清液PBTw。</li>
	<li>向管中加入&#160;1.0 ml牛血清白蛋白/磷酸缓冲吐温（BBTw）混合液，并轻轻摇动。摇动3分钟后，让样品沉降，再用移液器吸除BBTw。</li>
	<li>重复步骤3.4两次，注意最后一次洗涤后应尽可能彻底去除BBTw，同时避免样品损失。</li>
	<li>向管中加入&#160;0.5 ml BBTw，并将管置于冰上。</li>
</ol>
4. 样品超声处理
<ol>
	<li>将超声波破碎仪设置为最大振幅的10%，并设定2秒的连续超声时间。 
	注意：这些参数是针对材料与设备表中指定的超声波破碎仪设定的，若使用其他型号的仪器可能需要进行优化。</li>
	<li>在对样品进行超声处理前，通过将探头尖端插入装有去离子水的50 ml锥形管中并运行超声波破碎仪来清洗探头。运行结束后，用实验室纸巾将探头擦干。</li>
	<li>将探头浸入含有样品的微量离心管中，使其位于样品液面上方约3至4 mm处，然后开始超声处理。</li>
	<li>取出微量离心管，置于冰上至少30秒，以散去超声过程中产生的热量，并使样品沉降到管底。</li>
	<li>根据所处理样品的发育年龄，按需重复步骤4.3和4.4。 
	注意：为获得最佳超声效果，对于发育时间少于17小时的胚胎无需进行超声处理；而发育时间为17至24小时（17期/早期L1）的胚胎需进行两次超声处理。发育时间为24–36小时（早期/中期L1）、36–48小时（中期/晚期L1）、48–60小时（早期/中期L2）、60–72小时（中期/晚期L2）、72–84小时（早期L3）、84–96小时（早期/中期L3）、96–108小时（中期/晚期L3）的幼虫分别需要进行5、9、11、13、15、18和22次超声处理。有关超声时间的进一步说明，请参见讨论部分。</li>
	<li>用&#160;1.0 ml BBTw洗涤两次。每次洗涤后，待样品沉降，再用移液器吸除BBTw。</li>
	<li>向管中加入1.0 ml BBTw，置于摇床上轻摇。摇动3分钟后，让样品沉降，然后用移液器吸除BBTw。</li>
	<li>重复步骤4.7两次。</li>
</ol>
5. 免疫染色
<ol>
	<li>向微量离心管中加入用 BBTw 稀释的 5% 正常血清以封闭样品。在摇床上孵育 1 小时后移除封闭液。 
	注意：应使用与二抗来源物种相同的正常血清。</li>
	<li>将一抗用含 5% 正常血清的 BBTw 溶液稀释至适当的工作浓度。</li>
	<li>将样品在含一抗的溶液中于 4 °C 过夜（O/N）或在室温（约 22 °C）孵育至少 3 小时。 
	注意：一抗孵育时间和温度可能因抗体而异。通常在 4 °C 过夜或室温孵育 3 小时已足够。然而，孵育两天可能提高染色质量，尤其适用于陈旧样本或低亲和力一抗。较长孵育一般在 4 °C 进行。使用二抗时也需考虑类似因素（见 5.10）。</li>
	<li>让样品沉降至微量离心管底部，用移液器吸除一抗溶液。如需可保存抗体以重复使用。</li>
	<li>用&#160;1.0 ml BBTw 洗涤两次。每次洗涤后待样品沉降，再用移液器吸除 BBTw。</li>
	<li>向管中加入 1.0 ml&#160;BBTw 并轻轻摇动。在摇床上孵育 3 分钟后，让样品沉降，然后用移液器移除 BBTw。</li>
	<li>重复步骤 5.6 五次。</li>
	<li>向微量离心管中加入含 5% 正常血清的 BBTw 溶液进行封闭。在摇床上孵育 30 分钟至 1 小时后移除封闭液。 
	注意：此额外封闭步骤非必需，但可能改善特定抗体的染色质量。</li>
	<li>将二抗用含 5% 正常血清的 BBTw 溶液稀释至适当的工作浓度。</li>
	<li>用铝箔包裹微量离心管以避免光照导致荧光褪色。将样品在含二抗的溶液中于 4 °C 孵育 12 至 48 小时，或在室温（约 22 °C）孵育至少 3 小时。</li>
	<li>让样品沉降至微量离心管底部，用移液器吸除二抗溶液。</li>
	<li>用&#160;1.0 ml PBTw 洗涤两次。每次洗涤后待样品沉降，再用移液器吸除 PBTw。</li>
	<li>向管中加入 1.0 ml PBTw 并轻轻摇动。在摇床上孵育 5 分钟后，让样品沉降，然后用移液器移除 PBTw。</li>
	<li>重复步骤 5.13 三次。</li>
	<li>可选：将 DAPI 用 PBTw 按 1:1,000 比例稀释后加入。将样品包裹铝箔孵育 3 分钟，然后用移液器吸除 DAPI 溶液。用 1.0 ml PBTw 洗涤五次，每次洗涤后待样品沉降，再用移液器吸除 PBTw。</li>
	<li>向微量离心管中加入 80 - 100 μl 1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷（DABCO）溶液，并于 -20 °C 保存。 
	注意：可使用其他基于甘油的抗荧光淬灭剂替代。</li>
</ol>
6. 分析
<ol>
	<li>在将样品装载到载玻片之前，向微量离心管中额外加入 5 - 10 μl DABCO/对苯二胺（PPD）抗荧光淬灭溶液。 
	注意：样品可不经解剖直接加至载玻片上。加入载玻片的样品体积随盖玻片尺寸而异。将样品移液至载玻片时，可用剃刀片切去移液器吸头尖端，以防止样品剪切损伤。通常将样品排列成行，便于后续分析。添加PPD作为额外的抗荧光淬灭剂可能并非必需，但如果需长期保存样品，则有助于防止光漂白。</li>
	<li>轻柔地将玻璃盖玻片覆盖在样品上，然后用指甲油固定盖玻片。</li>
	<li>使用荧光显微镜观察已封片的样品。</li>
</ol>

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<li>Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+segregation+of+the+tumor+suppressor+brat+regulates+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells.</a> Cell. 124, 1241-1253 (2006).</li>
<li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li>
<li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+identity%2C+morphology%2C+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14(2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了一种成功对靶标进行免疫染色的方法 果蝇 胚胎和幼虫组织 原位，从而无需进行解剖。根据以往对早期胚胎染色的方案1,2,3, 使用50%次氯酸钠（NaOCl）去除绒毛膜。样品用甲醛和甲醇固定。由于幼虫角质层会导致较老的样品漂浮，因此将整个样品通过细胞筛以确保保留幼虫。如需保存，可将样品置于化学纯甲醇中。复水后，通过适当操作的超声处理破坏幼虫角质层的完整性。此步骤在角质层形成后至关重要，以允许免疫染色所需的抗体充分渗透。在加入抗体前，将样品在5%正常血清/BBTw溶液中振荡孵育，以防止非特异性抗体过度结合。随后加入一抗以检测目标组织中表达的特定蛋白。洗去未结合的一抗后，使用与荧光染料偶联的二抗标记结合了一抗的位置。最后可通过落射荧光显微镜或共聚焦显微镜进行观察分析。
在特定情况下，可能需要对实验条件进行一些调整以优化结果。特别是超声功率和超声次数可能需要根据所使用的超声仪型号进行调整。对于不同型号的超声仪，或当样品量不足时，可能还需要调整超声探头距离样品的高度以及溶液的体积。溶液浊度的增加可作为组织裂解的指标，因此可用...

Drosophila 胚胎和幼虫是研究多种器官和组织发育过程的优良模型。在这些研究中，常常需要对单个细胞进行成像，以确定细胞发育所处的复杂环境。通过免疫染色可实现对组织中细胞的可视化观察。目前已有完善的免疫染色方案用于卵孵化后17小时（AEL）以内的胚胎Drosophila组织&#60;1-3。然而，在胚胎发育末期会形成一层保护性角质层，阻碍抗体的有效渗透。因此，这些免疫染色方法在分析晚期胚胎以及后续幼虫发育阶段（1龄（L1）、2龄（L2）和3龄（L3））的组织时效率低下。这种低效性限制了我们对这一较长发育时期内动态过程的理解4。组织解剖是一种广泛应用的技术，可用于克服这一障碍5-7。然而，解剖操作本身也可能效率不高。由于难以定位或分离胚胎和幼虫组织，样本提取过程可能受阻。此外，目标组织的物理移除可能导致组织破裂，或无法完整取出，从而造成损伤。
超声处理是一种利用声波破坏分子间相互作用的方法。该方法已被用于破坏 果蝇 幼虫角质层以免疫标记发育中的神经细胞类型 6该方案已针对晚期胚胎及幼虫性腺的免疫染色进行了优化，其直径可小至50μm 8-10通过此类研究，已对晚期阶段雄性生殖系干细胞（GSC）生态位的形成过程进行了表征。 果蝇 胚胎8-10 晚期胚胎性腺和幼虫中调控干细胞发育与分化的机制已被阐明 9-12因此，超声处理提供了一种高效的替代组织解剖的方法，尤其适用于因组织尺寸过小而难以操作的情况。此外，该方法还能够实现组织的免疫染色 果蝇 组织 原位，使细胞保留在完整生物体的背景下并维持 原位 形态学。本文中，我们描述了一种对晚期胚胎至早期/中期L3阶段组织进行荧光免疫染色的逐步实验方案 原位分析 果蝇 代表性结果中展示了性腺和神经组织，以证明本方案的有效性。此外，该免疫染色方案也可经调整用于分析其他 果蝇 组织以及其他具有外角质层的生物体中的组织。

<table><tbody><tr><td colspan="4">表1：试剂与缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 Triton X-100（PBTx）</td><td></td><td></td><td>5 L：500 ml 10X PBS，4.45 L ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，50 ml Triton 10%。室温保存。</td></tr><tr><td>10倍磷酸盐缓冲液（PBS 10X）</td><td></td><td></td><td>对于1升去离子水&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O：80 g NaCl，2 g KCl，14.4 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，2.4 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;加入组分并定容至适当体积。4 ℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Triton 10%</td><td></td><td></td><td>50 ml 溶液：5 ml 吐温，5 ml 10X PBS，45 ml ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 轻摇混匀。室温保存。</td></tr><tr><td>便携式排放测量系统</td><td></td><td></td><td>0.1 M Pipes（pH 6.9），2.0 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1.0 mM EGTA。室温保存。</td></tr><tr><td>管道</td><td></td><td></td><td>配制400 ml 0.25 M溶液（pH 6.9）：30.24 g Pipes dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 NaOH。将Pipes溶解于300 ml dH₂O中。&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，然后用 NaOH 调节 pH 至 6.9。用 dH₂O 定容至 400 ml。&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 并高压灭菌。室温保存。</td></tr><tr><td>甲醛</td><td></td><td></td><td>37% 甲醛（以重量计）的甲醇溶液。室温保存。甲醛、庚烷和甲醇的废液混合物须置于密闭容器中，存放于通风橱内，随后根据机构规定进行处理。</td></tr><tr><td>庚烷</td><td></td><td>CAS 142-82-5</td><td>正庚烷。室温保存。按照机构规定，将甲醛、庚烷和甲醇的废液混合物储存于密封容器中，并置于通风橱内，待处理。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td></td><td>CAS 67-56-1</td><td>室温保存。根据机构规定，废弃的甲醛、庚烷和甲醇混合液须置于密闭容器中，并在通风橱内存放，待后续处理。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液Tween（PBTw）</td><td></td><td></td><td>配制1 L：100 ml 10X PBS，890 ml ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，10 ml 吐温10%。加入所有组分后过滤除菌，4℃保存。 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Tween 10%</td><td></td><td></td><td>50 ml：5 ml Tween，5 ml 10X PBS，40 ml ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 轻轻摇动混匀。室温保存。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲液吐温（BBTw）</td><td></td><td></td><td>配制1 L：100 ml PBS 10X，890 ml ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，10 ml 吐温10%，1 g 牛血清白蛋白（BSA）。先加入BSA，然后使用0.2 &amp;mu;m 真空滤器单元。4℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>正常山羊血清（NGS）</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>配制10 ml：正常山羊血清 10 ml ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 加入ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O至NGS管，使用0.2 &amp;mu;m 注射器滤器。将等分试样储存在 -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷（DABCO）</td><td></td><td>CAS：281-57-9</td><td>配制 100 ml：25 ml ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，1 ml Tris HCl（1M，pH 7.5），2.5 g DABCO 固体，3.5 ml 6N HCl，250 &amp;mu;l 10 N NaOH，70 ml 甘油。在250 ml烧杯中加入磁力搅拌子，加入ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、Tris HCl 和 DABCO。搅拌后加入 6N HCl、10 N NaOH 和甘油。然后逐滴加入 10N NaOH 至溶液 pH 达到 7.5。分装。将分装样品于 -20℃ 保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DABCO + 对苯二胺（PPD）溶液</td><td></td><td></td><td>1.765 ml NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，0.353 Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，0.02 g PPD（CAS：106-50-3）。将PPD溶于NaHCO₃中&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 和 NaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 溶液。加入60 &amp;mu;500 微升 PPD 溶液 &amp;mu;DABCO 溶液。分装后于 -20 ℃ 保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>苹果汁平板</td><td></td><td></td><td>制备约200块培养板：45 g 琼脂（CAS#9002-18-0）、45 g 颗粒糖（市售）、500 ml 苹果汁（市售）、15 ml 10% Tegosept、1.5 ml ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 向ddH₂O中加入琼脂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;在4 L烧瓶中加入O，然后高压灭菌30分钟。在加热磁力搅拌器上混合苹果汁和蔗糖。将苹果汁混合物缓慢加入已高压灭菌的琼脂中。在加热磁力搅拌器上混合均匀后，分装至35 mm培养皿中，每皿10 ml，室温静置至凝固。4 ℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Tegosept 10%</td><td></td><td></td><td>配制100 ml：10 g Tegosept，100 ml 乙醇。分装后于-20℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>酵母膏</td><td></td><td></td><td>约50 g干活性酵母。逐渐加入ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;将 O 加入含有酵母的烧杯中，边搅拌边混合，直至形成糊状。4 ℃ 保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">表2：染色材料</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>1:1000，储存液浓度为5 mg/ml。</td></tr><tr><td>兔抗 Vasa 抗体</td><td></td><td></td><td>1:250，由Ruth Lehmann惠赠。</td></tr><tr><td>小鼠抗Fasciclin III</td><td>发育研究杂交瘤库 (DSHB)</td><td>7G10</td><td>1:10</td></tr><tr><td>小鼠抗-1B1</td><td>发育研究杂交瘤库 (DSHB)</td><td>1B1</td><td>1:4</td></tr><tr><td>豚鼠抗 Traffic Jam 抗体</td><td></td><td></td><td>1:2500，由Dorthea Godt惠赠（Li 等，2003）。</td></tr><tr><td>小鼠抗Prospero</td><td>发育研究杂交瘤库 (DSHB)</td><td>Prospero MR1A</td><td>1:10</td></tr><tr><td>抗Elav大鼠单克隆抗体</td><td>发育研究杂交瘤库 (DSHB)</td><td>7EBA10</td><td>1:30</td></tr><tr><td>小鼠抗Repo抗体</td><td>发育研究杂交瘤库 (DSHB)</td><td>8D12</td><td>1:10</td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td>1:500</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>1:500</td></tr><tr><td>山羊抗豚鼠 Alexa633</td><td>Invitrogen</td><td>A21105</td><td>1:500</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>1:500</td></tr><tr><td colspan="4">表3：材料与设备</td></tr><tr><td>果蝇培养笼</td><td>手工制作；Genesee Scientific Corporation</td><td>不适用；瓶子：32-130；预制笼具：59-101</td><td>使用复合斜切锯（400 rpm）将透明浇铸亚克力管（直径1 3/4英寸）切割成4英寸高的管段制成。将超细不锈钢筛网用亚克力胶粘合至管的一端。另一种使用空果蝇食物瓶的方法见于 &lt;em&gt;果蝇&lt;/em&gt; 实验方案 ISBN 0-87969-584-4。笼具也可从 Genesee Scientific Corporation 购买。</td></tr><tr><td>超声波破碎仪：Branson 250 Digital Sonifier</td><td>布拉索斯</td><td>型号：Branson Digital Sonifier 250</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎探头</td><td>布拉森</td><td>型号：102C（CE）</td><td>EDP：101-135-066；序列号：OBU06064658</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Nalgene</td><td>190-25-20</td><td>0.2 &amp;mu;m 纤维素，醋酸纤维素膜滤器</td></tr><tr><td>成像系统：配备多色光源、数字CCD相机和成像软件的转盘共聚焦显微镜</td><td>显微镜：Olympus，光源：Lumen Dynamics，相机：Q-Imaging，成像软件：Intelligent Imaging Inc.</td><td></td><td>显微镜：BX51 配备 DSU 转盘，光源：X-Cite 120Q，相机：RETIGA-SRV，成像软件：Slidebook 5.0</td></tr><tr><td>真空滤器装置</td><td>Nalgene</td><td>450-0020</td><td>0.2 &amp;mu;m 硝酸纤维素膜滤器</td></tr></tbody></table>

超声处理辅助的晚期胚胎与幼虫免疫荧光染色 黑腹果蝇 组织 原位

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

在以下研究中进行的实验 黑腹果蝇 胚胎和幼虫为细胞命运决定及器官发生等发育过程提供了关键的研究视角。免疫染色技术可用于可视化正在发育的组织和器官。然而，胚胎发育末期形成的保护性角质层会阻碍抗体渗透至晚期胚胎和幼虫体内。尽管在免疫染色前进行解剖是常规用于分析 果蝇 幼虫组织，但对于某些分析而言效率较低，因为小型组织可能难以定位和分离。超声处理为幼虫组织的分离提供了一种替代解剖的方法。 果蝇 免疫染色实验方案。该方法可快速、同步处理大量晚期胚胎和幼虫，并保持 原位 形态学。样品经甲醛固定后进行超声处理，随后使用抗原特异性一抗和荧光标记的二抗进行免疫染色，以通过荧光显微镜观察目标细胞类型及特定蛋白质。在超声处理过程中，超声探头在样品上方的正确放置位置、超声时间及强度均至关重要。为获得高质量染色结果，可能需对标准免疫染色流程进行少量细微优化。对于信噪比较低的抗体，通常需要延长孵育时间。为验证该超声辅助免疫染色方法的可行性，我们展示了三种组织类型（睾丸、卵巢和神经组织）在多个发育阶段的免疫染色结果。

为了展示基于超声处理的免疫染色在分析晚期胚胎和幼虫组织中的有效性 原位，对野生型胚胎和幼体进行了睾丸、卵巢及神经组织的免疫染色处理。通过共聚焦显微镜成像，展示代表性结果（图1 和 图2结果表明，所述方案可有效用于观察形态特征及单个细胞 原位 从晚期胚胎期到早期/中期L3阶段 果蝇 发育
睾丸免疫染色结果： 
由于睾丸在幼虫发育过程中持续经历动态成熟过程，因此睾丸发育是展示实验方案有效性的理想体系。成年Drosophila的睾丸呈一端封闭的盘绕管状结构，其盲端位置存在生殖干细胞（GSC）微环境（参见文献13,14综述）。在此微环境中，GSC围绕着一群紧密聚集的非增殖性体细胞——称为“hub”——呈放射状排列。GSC通过不对称分裂产生一个仍锚定于hub的子代GSC，以及一个远离干细胞微环境的子细胞——精原母细胞。随着精原母细胞进行不完全分裂，会形成称为“fusome”的胞质延伸结构，将精...

免疫染色是一种用于可视化组织内特定细胞类型和蛋白质的有效技术。通过利用超声处理，本文所述的方案消除了在对晚期胚胎和幼虫进行免疫染色前解剖黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）组织的需要。我们提供了一种针对甲醛固定的整体幼虫进行免疫染色的高效方法。

在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎和幼虫中开展的研究为细胞命运决定等发育过程提供了关键见解，以及……

本实验的总体目标是通过超声处理后利用荧光显微镜观察或分析 C 二中的组织。该目标的实现首先需要收集胚胎和幼虫样本，然后使用甲醛、庚烷和甲醇对样本进行固定。第二步是对固定后的样本进行超声处理，以去除角质层，从而允许抗体渗透。接下来，使用一抗和荧光标记的二抗对样本进行免疫染色。最后一步是将样本封片于基于甘油的抗荧光淬灭剂溶液中。最终，通过共聚焦显微镜或落射荧光显微镜观察发育中的组织以及蛋白质的表达与定位情况。与组织解剖等其他方法相比，该技术的主要优势在于能够对多种发育中的组织进行原位可视化观察。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为超声处理步骤的效率取决于多个因素，包括超声探头的正确放置位置。本实验操作将由我实验室两名优秀的本科研究人员 Ashley Fiddler 和 Lauren Bole 进行演示。开始实验时，使用经磷酸盐缓冲液吐温 X 100 或 PBTX 溶液润湿的小型画笔，小心地从琼脂平板上取下胚胎。接着，将沾有样品的画笔在细胞滤筛内侧的凸缘上轻轻擦拭。在细胞滤筛下方放置一个培养皿盖。然后用含有 PBTX 的冲洗瓶冲洗毛刷和细胞过滤器的器壁。样品转移至过滤器后，向过滤器中加入足量 PBTX，使样品脱离滤网。重复此步骤三次，以去除酵母和果蝇残渣，随后移除 PBTX。然后将50%的次氯酸钠溶液倒入筛子中，使幼虫在该溶液中静置5分钟。接着移除溶液，再用PBTX洗涤样品，并让样品在溶液中静置3分钟。重复该步骤五次，干燥细胞滤网的底部。然后使用浸有PBTX的画笔将样品转移至含有1.75毫升pems的闪烁小瓶中。在通风橱中，加入250微升37%甲醛和8毫升试剂级溶剂。向闪烁瓶中加入庚烷，在200 rpm条件下振荡20分钟。然后不除去水相，直接向闪烁瓶中加入10毫升甲醇，并在500 rpm条件下剧烈振荡。振荡后立即将内容物倒入置于液体废液容器上方的细胞滤筛中。向小瓶中加入额外的甲醇，并将内容物通过细胞滤器过滤，以确保完全转移样品。用实验室纸巾轻拭细胞滤器底部。然后使用毛笔将样品从滤网转移至含有 0.5 毫升甲醇的 1.5 毫升微量离心管中。等待样品沉降。随后用移液器吸除甲醇，并加入新鲜的 0.5 毫升甲醇。重复此步骤三次，并在储存前向试管中加入最后0.5毫升甲醇，然后于负20摄氏度保存。后续使用时，从冷冻箱中取出储存的样品，用移液器除去甲醇。然后向试管中加入1毫升50%甲醇磷酸盐缓冲液Tween（PBTW）溶液，并轻轻摇动试管3分钟。接着，用一毫升 PBTW 冲洗样品两次，每次冲洗后等待样品沉淀，再用移液管吸除 PBTW；向管中加入 1.0 毫升含吐温的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液（BBTW），轻轻摇动三分钟；待样品沉淀后，用移液管吸除 BBTW。重复此步骤两次。注意尽可能去除大部分 BBTW，同时避免损失任何样品。然后向离心管中加入 0.5 毫升 BBTW，并将管子置于冰上。接下来，将超声处理仪设置为最大振幅的 10%，运行时间为 2 秒，持续模式；通过将探针尖端插入装有去离子水的 50 毫升锥形管中，运行超声处理仪以清洗探针。然后用实验室纸巾擦干超声探头。将探头浸入离样品上方三到四毫米的试管中，开始超声处理。随后取出试管，置于冰上30秒，以防止超声过程中过热，并使样品沉降至试管底部。根据样品在超声处理完成后的保存时间，按需重复此步骤。用一毫升 BBTW 将样品清洗两次。每次清洗后，让样品静置，然后用移液管吸去上清 BBTW。再向小瓶中加入一毫升 BBTW，并将其置于摇床上。三分钟后，让样本静置，用移液管吸除 BBTW。然后重复此步骤两次。向试管中加入 0.5 毫升用 BBTW 稀释的 5% 正常血清封闭样本，并将样本置于摇床上，室温孵育 1 小时。接下来，加入0.5毫升一抗溶液，在4摄氏度下轻轻摇动孵育过夜，使样品沉降到离心管底部。然后用移液器吸除一抗溶液，并用1毫升BBTW缓冲液清洗两次。向离心管中加入1毫升BBTW缓冲液，然后置于摇床中摇动3分钟。然后用移液器吸除 BBTW 溶液，并重复此步骤。共重复五次后，用含 5% 正常血清的 BBTW 溶液封闭样本，在摇床上孵育 30 分钟。随后移除溶液。加入用含5%正常血清的BBTW溶液稀释的二抗，将离心管用铝箔包裹，然后在4°C下振荡孵育过夜。用移液器吸除二抗溶液，再用1毫升PBTW缓冲液清洗样品两次。接着，向小瓶中加入 1 毫升 PBTW，置于摇床上摇动 5 分钟。然后静置样本，用移液器吸除 PBTW。重复此步骤。重复三步。向管中加入 80 至 100 微升 DAB co 溶液，并在 -20 °C 下保存。最后，为封片样本，使用 5 至 10 微升 dab BCO p 聚乙烯二胺（PPD 抗淬灭剂）。然后通过荧光显微镜观察。这四幅共聚焦切片的Z轴投影图像展示了该方案在观察果蝇胚胎晚期至三龄幼虫早期及中期阶段形态特征及单个细胞方面的有效性。睾丸发育是展示该方案有效性的理想体系，因为睾丸成熟过程在整个幼虫发育期间具有高度动态性。这些图像展示了三龄幼虫中期大脑的单个共聚焦切片，其中生殖细胞呈红色，集线器细胞和FU区域呈绿色。绿色标记神经节母细胞、未分化的神经元，以及未成熟和初级神经元。红色信号在脑叶和腹神经索中显示出强烈的染色，且表达模式清晰可辨，具体形态取决于样品的封片方向；通过成像可从背侧表面、腹侧表面或矢状横截面观察脑组织结构。这种原位双染技术可使生物学家在保护性角质层阻碍抗体渗透的生物体中探索组织形态发生过程中的器官发育。观看本视频后，您应能充分掌握如何对晚期胚胎和幼虫食管样本进行超声处理及免疫染色，以在 C 二中可视化正在发育的组织。切记，甲醛、正庚烷和甲醇的使用可能具有极高危险性，操作时必须采取防护措施，例如在通风橱内操作。进行此操作时，应始终佩戴合适的手套和实验服。

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

后期阶段的胚胎和幼虫的超声，促进免疫荧光染色<em&gt;果蝇</em&gt;组织<em&gt;原位</em

介观荧光断层成像技术突破了组织切片荧光显微镜的穿透深度限制。该技术基于多角度投影照明和光子传输模型描述。我们展示了在活体中对表达GFP的黑腹果蝇（Drosophila...

介观荧光断层成像技术 体内 发育过程成像 果蝇

活体成像 黑腹果蝇 胚胎血细胞迁移

抗体染色 果蝇 蛹可增强对成虫腹部发育遗传学的基因分析。我们介绍了针对分期蛹的解剖、固定及抗体染色的实验方案。 黑腹果蝇...

Drosophila 蛹腹部免疫组织化学

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

本文介绍了一种针对蚜虫胚胎的整体免疫染色实验方案，重点阐述了降低背景染色和增强组织通透性的关键条件。这些条件专门针对蚜虫胚胎组织中蛋白质表达的有效检测而优化。...

豌豆蚜胚胎免疫染色关键条件的确定：提高组织通透性与降低背景染色

利用光片荧光显微镜对昆虫胚胎的形态发生过程进行成像已成为当前的标准技术。本实验方案概述并比较了三种适用于赤拟谷盗（Tribolium...

活体或固定染色样本的光片荧光显微镜成像 赤拟谷盗 胚胎

所描述的RNA 原位 杂交方案可实现对完整组织中RNA的检测 果蝇...

高分辨率荧光 原位 杂交 果蝇 使用酪酰胺信号放大法的胚胎与组织检测

在此，我们描述了一种用于检测与定位的实验方案 黑腹果蝇 从收集到预包埋和包埋、免疫染色以及 mRNA 检测的胚胎蛋白与 RNA 原位...

一种用于免疫组织化学与RNA的实验方案 原位 早期分布 果蝇 胚胎

本文提供了一种用于活体成像晚期胚胎期黑腹果蝇（Drosophila）雄性生殖腺的解剖方案。该方案可用于在正常条件下，或经过转基因操作及药物干预后，观察细胞内的动态过程。...

晚期胚胎的解剖与活体成像 果蝇 性腺

本方案描述了定制的基于抗体的荧光标记及其向早期Drosophila胚胎中的显微注射，以实现对低丰度蛋白或翻译后修饰的活体成像，这些目标分子使用传统的GFP/mCherry标签方法难以检测。...

在活体中可视化低丰度蛋白质及翻译后修饰 黑腹果蝇 胚胎 通过 荧光抗体注射

这些实验方案阐述了如何在对照组和突变型果蝇胚胎上皮中表征折叠型隔膜连接的结构及其封闭功能。...

免疫染色与染料渗透实验用于确定核心皱褶型紧密连接蛋白 果蝇 胚胎上皮

学习利用超声波处理技术对黑腹果蝇胚胎和幼虫进行免疫荧光染色，实现组织原位可视化。该方法无需解剖即可观察蛋白质表达与定位，显著提升发育生物学研究效率。

超声处理辅助的晚期胚胎与幼虫免疫荧光染色黑腹果蝇组织原位

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