超声处理辅助的晚期胚胎与幼虫免疫荧光染色 黑腹果蝇 组织 原位

本实验的总体目标是通过超声处理后利用荧光显微镜观察或定量分析黑腹果蝇（C two）中的组织。该目标首先通过收集胚胎和幼虫样本，然后使用甲醛、正庚烷和甲醇对样本进行固定来实现。第二步是对固定后的样本进行超声处理，以去除角质层，从而允许抗体渗透。

接下来，使用一抗和荧光标记的二抗对样本进行免疫染色。最后一步是将样本封片于基于甘油的抗荧光淬灭溶液中。最终，通过共聚焦显微镜或落射荧光显微镜观察发育中的组织以及蛋白质的表达与定位情况。

与组织解剖等其他方法相比，该技术的主要优势在于能够对多种正在发育的组织进行原位可视化观察。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为超声处理步骤的效率取决于多个因素，包括超声探头的正确放置位置。本次实验操作将由我实验室两名出色的本科研究人员 Ashley Fiddler 和 Lauren Bole 进行示范。

开始实验时，使用一支蘸有磷酸盐缓冲液吐温 X-100（PBTX）溶液的小型画笔，小心地从琼脂平板上移取收集的胚胎。接着，将带有样本的画笔在细胞筛网内侧的凸缘处轻轻擦拭。在细胞筛网下方放置一个培养皿盖。

然后用含有PBTX的冲洗瓶冲洗毛刷和细胞滤筛的壁面。待样本转移至滤筛后，向滤筛中加入足量PBTX，使样本脱离滤网表面。重复此步骤三次，以去除酵母和果蝇残渣，随后移除PBTX。

然后将50%的次氯酸钠溶液倒入筛子中，使幼虫在该溶液中静置五分钟。接着移除溶液，再用PBTX洗涤样品，并让样品在溶液中静置三分钟。

重复该步骤五次，干燥细胞滤筛底部。然后使用蘸有PBTX的画笔将样品转移至含有1.75毫升pems的闪烁瓶中。在通风橱内，加入250微升37%甲醛和8毫升试剂级溶剂。

向闪烁瓶中加入庚烷，在200 rpm条件下振荡20分钟。然后不除去水相，直接向闪烁瓶中加入10毫升甲醇，并在500 rpm条件下剧烈振荡。振荡后立即将内容物倒入置于液体废液容器上方的细胞滤筛中。

向小瓶中加入额外的甲醇，并将内容物通过细胞滤筛过滤，以确保完全转移全部样品。用实验室纸巾轻拭细胞滤筛底部。

然后使用毛笔将样品从滤网转移至含有 0.5 毫升甲醇的 1.5 毫升微量离心管中。等待样品沉降。随后用移液器吸除甲醇，并加入新鲜的 0.5 毫升甲醇等分试样。

重复此步骤三次，然后在储存前向试管中加入最后0.5毫升甲醇，并于负20摄氏度保存。后续使用时，从冰箱中取出储存的样品，用移液器除去甲醇。然后向试管中加入1毫升50%甲醇磷酸盐缓冲液Tween（PBTW）溶液，轻轻摇动试管3分钟。

接着，用一毫升 PBTW 冲洗样品两次，每次冲洗后让样品沉降，再用移液器吸除 PBTW；向小瓶中加入 1.0 毫升牛血清白蛋白磷酸盐缓冲吐温溶液（即 BBTW），轻轻摇动三分钟；待样品沉降后，用移液器移除 BBTW。重复此步骤两次。

注意尽量去除BBTW，同时避免损失任何样品。然后向离心管中加入0.5毫升BBTW，并将管子置于冰上。接下来，将超声仪设置为最大振幅的10%，运行时间为2秒，持续超声。通过将探头尖端插入装有去离子水的50毫升锥形管中，清洗探头，并运行超声仪。

然后用实验室擦拭纸擦干超声探头。将探头浸入离心管中，位于样品上方3至4毫米处，开始超声处理。随后取出离心管，置于冰上30秒，以防止超声过程中过热，并使样品沉降至管底。

根据样品在超声处理完成后的保存时间，按需重复此步骤。用一毫升 BBTW 将样品清洗两次。每次清洗后，让样品静置，然后用移液枪吸去 BBTW。用移液器向小瓶中加入一毫升 BBTW，并将其置于摇床上。

三分钟后，让样品静置，用移液器吸除 BBTW。然后重复此步骤两次。向样品中加入 0.5 毫升用 BBTW 稀释的 5% 正常血清，封闭样品，并将样品置于摇床上，室温孵育一小时。

接下来，加入0.5毫升一抗溶液，在4°C下轻轻振荡孵育过夜，使样品沉降到离心管底部。然后用移液器吸除一抗溶液，用1毫升BBTW缓冲液清洗两次。向离心管中加入1毫升BBTW缓冲液，然后置于摇床中振荡3分钟。

然后用移液器吸除 BBTW，并重复此步骤五次；用 5% 正常血清 BBTW 溶液封闭样本，室温摇床上孵育 30 分钟，随后弃去溶液。

加入用含5%正常血清的BBTW溶液稀释的二抗，将离心管用铝箔包裹，然后在4°C下振荡孵育过夜。用移液器吸除二抗溶液，再用1毫升PBTW缓冲液清洗样品两次。

接下来，向小瓶中加入一毫升 PBTW，置于摇床上摇动五分钟。然后静置样本，用移液器吸除 PBTW。重复此步骤。

重复三步操作。向管中加入 80 至 100 微升 DAB co 溶液，并在 -20 °C 下保存。最后，为封片样本，使用 5 至 10 微升 dab BCO p 氨二苯胺（或 PPD 抗淬灭剂）。

然后使用荧光显微镜观察。这四幅共聚焦切片的Z轴投影图像展示了该方案在可视化果蝇发育晚期胚胎至早期和中期三龄幼虫阶段（C二至L三阶段）形态特征及单个细胞方面的有效性。由于睾丸在幼虫发育过程中成熟过程具有高度动态性，因此睾丸发育是一个特别适合用于展示该方案有效性的体系。

这些图像展示了三龄中期幼虫脑部的单个共聚焦切片，其中生殖细胞呈红色，中心细胞和FU区域呈绿色。绿色标记神经节母细胞、未分化神经元，以及未成熟和初级神经元。红色信号在脑叶和腹神经索中显示出强烈的染色，且表达模式清晰可辨，具体形态取决于样本的封片方向；通过成像可从背侧表面、腹侧表面或矢状截面观察脑组织结构。

这种原位双重技术可使生物学家在那些因具有保护性角质层而阻碍抗体渗透的生物体中，探索组织形态发生过程中的器官发育。观看本视频后，您应能充分掌握如何对晚期胚胎和幼虫的食管样本进行超声处理及免疫染色，以便在C两中观察发育中的组织。请务必注意，甲醛、正庚烷和甲醇的使用具有极高危险性，操作时必须采取预防措施，例如在通风橱内进行操作。

进行此操作时，应始终佩戴合适的手套和实验服。