利用超常光学透射技术定量检测人血清中的心脏生物标志物

该技术的总体目标是在临床相关的浓度下，在即时检测环境中测量复杂生物液体背景中存在的生物标志物，而无需复杂的光学或电学装置。该方法有助于推动基于异常透射的生物传感器在即时检测场景中的实际应用。该技术的主要优势在于不需要任何复杂的电学或光学设置。

在我们的实验中，该传感器能够可靠地检测到临床相关浓度的生物标志物。传感器芯片的制备在洁净室中进行，无法拍摄实际过程。出于演示目的，此处通过动画展示该流程。

制备镍模具时，将一层220纳米厚的负性电子束抗蚀剂涂覆在厚度为600微米的四英寸硅片上。使用电子束光刻系统在该硅片上写入设计的纳米孔阵列。为加快电子束写入速度，每个300微米的场尺寸采用20,000的低点阵图进行图案写入。

将四英寸硅片浸入显影液中 10 秒以进行显影，随后让硅片在空气中自然干燥。在硅片上沉积一层金属种子层，例如镍、铜或铝。然后在镀镍磺酸盐溶液中，通过电镀系统分两步对硅片进行电镀。

通过施加轻微的机械力，将镍模具从硅基底上分离。接着，使用纳米压印机将纳米图案压印到已涂覆有300纳米厚光固化纳米压印光刻胶层的四英寸玻璃晶圆上。将模具、光刻胶和玻璃晶圆转移至紫外光固化系统中进行光照固化。

如果所有步骤均正确执行，镍模具应能轻松从光刻胶上脱模。在玻璃基底上的玻璃晶圆进行光刻胶的空白刻蚀后，使用电子束沉积设备沉积一层铬以增强金属附着力，并沉积一层金用于等离子体传感器。通过氧气等离子体刻蚀三分钟去除光刻胶，随后在丙酮中超声处理15秒。

然后，将样品切成5毫米×5毫米的芯片。纳米孔阵列将位于芯片中央的2毫米×2毫米正方形区域内。为获取数据，设置实验装置以进行光学测量，使白光光束从发射端光纤末端射出后被准直，并以90度角垂直入射到传感器表面。

光穿过整个纳米孔阵列。使用接收光纤收集透射信号，并用紫外-可见分光光度计在300至1,000纳米范围内记录信号。对于传感器体相灵敏度测试，将折射率在1.31至1.39之间变化的标准折射率液体注入液相池中。

将传感器芯片浸入标准折射率液体中，并与白光光束对准，然后获取透射光谱。每次测量后，使用表面活性清洗剂清洁传感器芯片，并用氮气吹干。

对于传感器表面的修饰，首先在进行任何化学修饰之前，将传感器芯片依次浸入异丙醇、丙酮和去离子水中进行清洗。然后，在室温下用干燥的氮气流吹干传感器芯片。接着，将传感器芯片在乙醇溶液中于室温下孵育12小时。

这将形成一种胺基反应性自组装单分子层。孵育后，使用乙醇彻底冲洗芯片，并在室温下干燥。接着，将芯片浸入含有75毫摩尔的磺基-N-羟基琥珀酰亚胺和15毫摩尔EDC的混合溶液中，反应15分钟。

这将激活自组装单分子层的羧基。然后在传感器表面点样50微升用pH 4.5醋酸盐缓冲液配制的200微克/毫升抗钩端螺旋体抗体溶液。孵育30分钟后，将传感器芯片浸入1摩尔的乙醇胺盐酸盐溶液中15分钟，以封闭未反应的酯基。

最后，用去离子水冲洗芯片，并在室温下用干燥的氮气流吹干。通过在传感器芯片表面点样100 µL的1%牛血清白蛋白溶液，以阻断非特异性结合。孵育15分钟。

用磷酸盐缓冲液冲洗传感器芯片三次。将芯片插入测量池中以记录透射光谱。此光谱即为参考光谱。

然后将50微升心肌肌钙蛋白I标准品点样到芯片表面。将芯片置于湿润环境中孵育30分钟。用PBS溶液将传感器芯片清洗三次后，将其插入测量池中以记录透射光谱。

这是结合后的光谱。接下来，将芯片浸入50毫摩尔的甘氨酸盐酸溶液中1分钟，然后用PBS溶液冲洗3次，以再生芯片表面。在PBS中测量透射光谱，以验证再生步骤是否成功。

展示了生物传感器与血清中浓度为30纳克每毫升的人类心肌肌钙蛋白相互作用后透射光谱的变化。蓝色曲线表示相互作用前，红色曲线表示相互作用后。虚线圆圈标示了被追踪的谱带。

图中显示了在肌钙蛋白浓度分别为 2.5 纳克/毫升、7.5 纳克/毫升、30 纳克/毫升和 75 纳克/毫升时，第二谱带波长的偏移情况。误差条表示标准偏差。该图展示了纳米孔生物传感器芯片在再生后所观测到的谱带波长偏移。

第二条带重新回到其原始位置，表明再生步骤成功。一旦掌握，若操作得当，测量可在一小时内完成。采用该方法测量生物分析物时，必须使用 freshly prepared 试剂。

请务必确保将耗材充分溶解。观看本视频后，您应能充分理解如何制备基于异常光学透射原理的生物传感器，并能够在复杂背景下监测生物分析物。通常，刚接触该方法的研究人员会遇到困难，原因是难以制备高保真度的纳米孔阵列，而这种阵列是实现芯片与光纤连接的关键，无需使用显微镜，并可选用可重复的树脂材料。

该技术可实现连续测量，这在医疗环境中至关重要。芯片的制备在很大程度上保证了测量结果的可重复性。在基本平台保持不变的情况下，该技术的进一步改进将来源于采用更高分辨率的方法以提高灵敏度，以及运用信号处理技术以获得更优的信噪比。

该技术的意义在于能够在实时、即时检测的条件下，针对血清复杂背景中的多种生物分析物进行监测。