Name: 用超常光透射法定量测定人血清中的心脏标志物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 了解基于超常光透射原理的生物传感器制造方法，用于人血清中心肌肌钙蛋白I的定量检测。该技术无需复杂光学或电气设备，可在临床即时检测场景中实现可靠的心血管标志物监测。

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AP 感谢新加坡国立大学纳米科学与纳米技术计划主任 T Venkatesan 教授以及新加坡国立大学副校长办公室（R-398-000-084-646）提供的支持。CLD 感谢新加坡卫生部国家医学研究委员会临床科学家资助计划（NMRC/CSA/035/2012）以及新加坡国立大学的支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

1. 传感器的制备与数据采集
<ol>
	<li>镍模具的制备
	<ol>
		<li>在基底上涂覆一层220 nm厚的负性电子束抗蚀剂 600 µm- 厚度为4英寸的硅晶圆。使用电子束光刻系统在该晶圆上写入设计的纳米孔阵列。
		<ol>
			<li>为加快电子束写入速度，每个图案使用20k的低点阵密度（N）进行写入 300 µm 视野大小（A）(即， 每个图上绘制了4亿个点 300 µm2 区域，每个点根据图案设计决定是否被电子束曝光）。设置电子束抗蚀剂的曝光剂量，以适用于该抗蚀剂 110 µC 厘米−2 并以800 pA的电流（I）进行记录。 
			注意：在电子束光刻中，曝光剂量（D）由每个点的曝光时间（T）控制点），通过计算得出 <img alt="静力平衡方程：T_dot = (D × (A/N)^2) / I，适用于物理学研究。" src="/files/ftp_upload/55597/55597eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1">. 对于暴露剂量在 110 µC cm−2，电子束在每个曝光点上的停留时间为 0.5 µs12. 由于该阵列捕获的区域为1.8 mm2，共有36个300-µm2 将多个区域拼接在一起，形成一个大面积的金纳米孔阵列。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将4英寸硅片浸入显影液中10秒进行显影，随后让硅片在空气中自然干燥。</li>
		<li>在硅晶圆上沉积一层金属种子层，例如镍、铜或铝。</li>
		<li>在镀镍磺胺酸浴中，使用电镀系统对晶圆进行电镀。电镀过程分两步进行。第一步持续95分钟，采用0.7 A dm⁻²的电流密度。−2；这将使镍完全填充纳米图案。在第二步中，持续125分钟，使用12 A dm⁻²−2 以达到 300 µm 最终镍模具厚度（20 nm）。确保pH值为3.5 - 3.8，温度为52 - 54 °C.</li>
		<li>通过施加轻微的机械力将镍模具从硅基底上分离。将镍模具浸泡在约100 mL的正性光刻胶去除剂中过夜，以清除电子束光刻胶的残留物。</li>
		<li>将镍模具放入烘箱中干燥 100 °C 3 h。在等离子体刻蚀系统中用O₂清洗。2 气体以10 sccm流速和100 W功率处理3分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>金纳米结构的制备
	<ol>
		<li>包被 150 µL 十七氟-1,1,2,2-四氢癸基三氯硅烷（FDTS）在自组装单分子层（SAM）镀膜机中对镍模具的处理 80 °C. 
		注意：这将形成一层防粘附层，可在纳米压印步骤完成后实现模具与光刻胶的分离（“脱模”）。汽化时间应为 180 s，反应时间应为 900 s。</li>
		<li>使用纳米压印机在已涂覆300 nm厚光固化纳米压印光刻胶的4英寸玻璃晶圆上压印纳米图案，压印压力为10 bar，温度为 40 °C 10 分钟</li>
		<li>将模具、光刻胶和玻璃晶圆转移至紫外光固化系统中，以75 mW cm⁻²的光强进行光固化-2 紫外线照射30秒。 
		注意：如果所有步骤均正确执行，镍模具应能轻松从光刻胶上脱模。</li>
		<li>在反应离子刻蚀（RIE）系统中，对玻璃基底上的光刻胶进行空白刻蚀，使用氧气2 以 10 sccm 的气体流量，在 50 W 条件下处理 2 秒，以暴露凹陷区域的玻璃。</li>
		<li>在电子束沉积设备中，在玻璃晶圆上沉积一层 5 nm 厚的铬（Cr）以增强金属附着力，并沉积一层 100 nm 厚的金（Au）作为等离子体传感器。采用 1 Å/s 的沉积速率。−1 对于 Cr 为 2 Å s−1 用于 Au。</li>
		<li>通过 O 进行光刻胶的剥离2 等离子体刻蚀3分钟，随后在丙酮中进行15秒的超声处理。</li>
		<li>将样品切成 5 mm × 5 mm 的小片。纳米孔阵列将占据芯片中央的 2 mm × 2 mm 区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集
	<ol>
		<li>搭建光学测量装置，使白光光束从发射端光纤末端射出后被准直，并以一定角度入射到传感器表面（纳米孔阵列）上 90°. 
		注意：光会穿过整个纳米孔阵列。</li>
		<li>使用接收光纤收集透射信号，并用波长范围为300至1,000 nm的紫外-可见分光光度计记录信号。</li>
		<li>将每帧的采集时间设置为20 ms，对100帧进行平均以获得最终光谱，从而降低测量中的噪声。</li>
		<li>使用绘图软件，基于先前已确定的传输峰（采用基于洛伦兹的方法）对数据进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 传感器体相灵敏度测试
<ol>
	<li>将折射率（RI）从1.31到1.39的标准RI液体注入液体池中。</li>
	<li>将传感器芯片浸入标准RI液体中，并与白光光束对准，获取透射光谱。</li>
	<li>每次测量后，使用表面活性清洗剂清洁传感器芯片，并用氮气吹干。</li>
</ol>
3. 传感器表面修饰
<ol>
	<li>在进行任何化学修饰之前，将传感器芯片依次浸入异丙醇、丙酮和去离子水中进行清洗。在室温下用干燥氮气流吹干。</li>
	<li>将传感器芯片浸入含有0.4 mM 10-羧基-1-癸硫醇和1.6 mM 1-辛硫醇的乙醇溶液中，在室温下孵育12小时。 
	注意：这将形成一种可与胺基反应的自组装单分子层（SAM）。</li>
	<li>用乙醇充分冲洗，并在室温下干燥。</li>
	<li>配制含有75 mM 磺基-N-羟基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）和15 mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）的混合溶液。将芯片浸入该混合液中15分钟。 
	注意：这将活化SAM中的羧基。</li>
	<li>在传感器表面点加50 µL pH 4.5醋酸缓冲液配制的200 µg/mL抗肌钙蛋白抗体溶液，孵育30分钟。</li>
	<li>将传感器芯片浸入1 M 乙醇胺盐酸盐溶液中15分钟，以封闭未反应的酯基。</li>
	<li>用去离子水冲洗芯片，并在室温下用干燥氮气流吹干。</li>
</ol>
4. cTnI 检测
<ol>
	<li>通过在表面点样 100 µL 的 1% 牛血清白蛋白（BSA）溶液，封闭任何非特异性结合位点。孵育 15 分钟。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）溶液将传感器芯片冲洗三次。将芯片插入测量池中，记录透射光谱。 
	注意：此为参考光谱。</li>
	<li>在芯片表面点样 50 µL 的 cTnI 标准品溶液，在湿润环境中孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 PBS 溶液将传感器芯片冲洗三次，然后将其插入测量池中记录透射光谱。 
	注意：此为结合后光谱。</li>
	<li>将芯片浸入 50 mM 甘氨酸-HCl 缓冲液（pH 2）中 1 分钟，随后用 PBS 溶液冲洗三次，以再生芯片表面。在 PBS 中测量透射光谱，以验证再生步骤是否成功。</li>
</ol>
5. 表面等离子体共振（SPR）检测
<ol>
	<li>使用 PBS-T 缓冲液在 SPR 系统上运行多重 SPR 传感器芯片。 
	注：PBS-T 缓冲液的组成为 20 mM 磷酸钠、150 mM 氯化钠和 0.05% 吐温-20，pH 为 7.4。</li>
	<li>使用步骤 4 中所述的 cTnI 标准品和抗体。</li>
	<li>用 EDC（0.2 M）和 sulfo-NHS（0.05 M）混合液活化 6 个可用通道中的 3 个，持续 5 分钟。随后进行 50 µg/mL 抗体 560 的 5 分钟注射，以及 1 M 盐酸乙醇胺溶液的 5 分钟注射。</li>
	<li>将传感器芯片旋转 90°，然后注入不同浓度的 cTnI 标准品（75、30、7.5 和 2.5 ng/mL）。</li>
	<li>通过 SPR 读数实时观察芯片上相互作用位点处抗体与目标物的结合情况。</li>
	<li>注入 50 mM 盐酸甘氨酸（pH 2）溶液 1 分钟，以再生芯片。</li>
</ol>

<ol><li>Ebbesen, T. W., Lezec, H. J., Ghaemi, H., Thio, T., Wolff, P. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v391/n6668/abs/391667a0.html">Extraordinary optical transmission through sub-wavelength hole arrays.</a> Nature. 391 (6668), 667-669 (1998).</li>
<li>Krishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0030401801015589">Evanescently coupled resonance in surface plasmon enhanced transmission.</a> Optics Comm. 200 (1), 1-7 (2001).</li>
<li>Yang, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+optical+transmission+mediated+by+localized+plasmons+in+anisotropic%2C+three-dimensional+nanohole+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Enhanced optical transmission mediated by localized plasmons in anisotropic, three-dimensional nanohole arrays.</a> Nano letters. 10 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Kim, J. H., Moyer, P. J. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.2355468?journalCode=apl">Transmission characteristics of metallic equilateral triangular nanohole arrays.</a> Appl Phys Lett. 89 (12), 121106(2006).</li>
<li>Liu, H., Lalanne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+theory+of+the+extraordinary+optical+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microscopic theory of the extraordinary optical transmission.</a> Nature. 452 (7188), 728-731 (2008).</li>
<li>Shon, Y. -S., Choi, H. Y., Guerrero, M. S., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s11468-009-9079-1">Preparation of nanostructured film arrays for transmission localized surface plasmon sensing.</a> Plasmonics. 4 (2), 95-105 (2009).</li>
<li>Xiang, G., Zhang, N., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+surface+plasmon+resonance+biosensing+with+large+area+of+gold+nanoholes+fabricated+by+nanosphere+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Res+Lett%22%5BJournal%5D)">Localized surface plasmon resonance biosensing with large area of gold nanoholes fabricated by nanosphere lithography.</a> Nanoscale Res Lett. 5 (5), 818(2010).</li>
<li>Valsecchi, C., Brolo, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+metallic+nanostructures+as+plasmonic+chemical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Periodic metallic nanostructures as plasmonic chemical sensors.</a> Langmuir. 29 (19), 5638-5649 (2013).</li>
<li>Gates, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+nanofabrication%3A+molding%2C+printing%2C+and+other+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques.</a> Chem Rev. 105 (4), 1171-1196 (2005).</li>
<li>Guo, L. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.200600882/abstract">Nanoimprint lithography: methods and material requirements.</a> Adv Mater. 19 (4), 495-513 (2007).</li>
<li>Wong, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+and+high+yield+nanofabrication+of+precisely+designed+gold+nanohole+arrays+for+fluorescence+enhanced+detection+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput and high yield nanofabrication of precisely designed gold nanohole arrays for fluorescence enhanced detection of biomarkers.</a> Lab on a Chip. 13 (12), 2405-2413 (2013).</li>
<li>Deng, J., Wong, T. I., Sun, L. L., Quan, C., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167931716303975">Acceleration of e-beam lithography by minimized resist exposure for large scale nanofabrication.</a> Microelect Eng. 166, 31-38 (2016).</li>
<li>Wu, L., Bai, P., Li, E. P. <a target="_blank" href="https://www.osapublishing.org/josab/abstract.cfm?uri=josab-29-4-521">Designing surface plasmon resonance of subwavelength hole arrays by studying absorption.</a> JOSA B. 29 (4), 521-528 (2012).</li>
<li>Ding, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+a+cardiac+biomarker+in+human+serum+using+extraordinary+optical+transmission+%28EOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Quantification of a cardiac biomarker in human serum using extraordinary optical transmission (EOT).</a> PloS one. 10 (3), 0120974(2015).</li>
<li>Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanohole-based+surface+plasmon+resonance+instruments+with+improved+spectral+resolution+quantify+a+broad+range+of+antibody-ligand+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics.</a> Anal Chem. 84 (4), 1941-1947 (2012).</li>
<li>Bhagawati, M., You, C., Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+imaging+of+protein-protein+interactions+by+LSPR+detection+with+micropatterned+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time imaging of protein-protein interactions by LSPR detection with micropatterned gold nanoparticles.</a> Anal Chem. 85 (20), 9564-9571 (2013).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

模拟入射光与纳米结构之间的相互作用，可以确定透射光谱中合适的特征峰，其峰位偏移可记录为分析物浓度的函数。需要注意的是，相对于传感器结构的能带局域化特性，对于选择可用于追踪分析物的合适能带至关重要。这种可视化可通过模拟实现，对设计能够实现生物传感的最优结构也具有关键意义。如图所示，能带 I 和 III 局域在玻璃-金界面处，因此不适合用于生物传感。而能带 II 表现出显著的局域表面等离子体共振（LSPR）成分，具有较短的衰减长度，并局域于纳米孔边缘，因此非常适合用于检测分析物浓度。整个阵列中所制备纳米结构的质量也对采集光谱的质量至关重要，结构不均匀会引入伪影。
散射和不可避免的吸收会在水相测量中产生伪影。水相介质的存在也会干扰整体的信噪比。如果存在多个可用于监测生物传感信号位移的合适谱带，则必须考虑以下几点。在波长低于600 nm时，观测到的透射光谱会显著受到蛋白质吸收和颗粒散射的影响。另一方面，使用大于900 nm的波长可能会掩盖来自结合事件的重要底层信号，从而造成干扰，因为在该区域水的吸收随波长增加而增强。因此，对于在水相环境中检测分析物，谱带II在波长位置上处于最优范围。在谱带...

自埃贝森首次报道纳米孔阵列的异常光学透射（EOT）现象以来，基于纳米孔阵列的化学传感器已成为众多研究的课题 等 1998年1当光照射到亚波长尺度的纳米孔周期性阵列时，会在特定波长处出现增强的透射现象。这种现象发生在入射光与布洛赫波表面极化激元（BW-SPP）和/或局域表面等离激元（LSP）发生耦合时。2.
利用此类周期性阵列进行生物传感时所依赖的基本物理原理十分简单。当分子吸附到金属界面或其附近时，会改变与金属接触的介质的介电常数，从而导致光谱中透射带位置发生偏移。通过纳米级的结构设计，可对纳米结构的形状、尺寸及间距进行调控，进而调节光谱特性3,4,5。基于异常光学透射（EOT）的传感器在设计上具有特定的光谱特征峰，便于在研究分子结合事件时进行明确指认6,7,8，这一特性相较于市面上现有的表面等离子体共振（SPR）平台具有显著优势。
使用EOT的传感器通常需要一个光学对准的光源，使准直光束照射到传感表面。用于制备大面积纳米孔表面的技术，如共聚物模板法、干涉光刻法和纳米球光刻法，其重复性较差9。由于在精确制备表现出EOT现象的大面积表面方面存在这些限制，因此需要使用光学显微镜来准确定位光源和探测器。为了简化该技术，采用了高质量的纳米压印光刻技术（NIL）10，从而实现了大面积传感器表面11（毫米级）的制备，不再需要借助显微镜在芯片上寻找传感区域。相反，该传感器可轻松与标准光纤电缆连接。
由于该纳米孔阵列的透射峰位于可见光到近红外区域（NIR），因此非常适用于在水相环境中检测生物分子的结合事件。研究人员对该纳米孔阵列预期的光学行为进行了模拟，并通过标准折射率（RI）液体的实验研究验证了模拟结果。随后，利用该阵列在人血清的复杂背景下检测了心肌肌钙蛋白I（cTnI）的浓度。cTnI是临床诊断急性心肌梗死的金标准。
利用该传感器，可在人血清中检测并定量心肌肌钙蛋白I（cTnI），检测限（LOD）为0.55 ng/mL，具有临床相关性。该检测速度明显快于该领域最常用的酶联免疫吸附测定（ELISA）技术。此外，传感表面易于再生，因而可重复使用。因此，本研究展示了纳米孔阵列作为在复杂生物流体中进行生物传感的一种可行的即时检测（POC）技术的前景。

<table><tbody><tr><td>电子束光刻设备</td><td>Elionix ELS 700</td><td></td><td></td></tr><tr><td>邻二甲苯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95662</td><td></td></tr><tr><td>电子束光刻胶</td><td>住友化学</td><td>NEB-22A2</td><td></td></tr><tr><td>显影液试剂</td><td>Shipley 公司</td><td>Microposit MF 321</td><td></td></tr><tr><td>电镀设备</td><td>Technotrans AG RD 50</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光刻胶剥离剂&amp;nbsp;</td><td>Rohm and Haas 电子材料&amp;nbsp;有限责任公司</td><td>Microposit Remover 1165</td><td></td></tr><tr><td>刻蚀系统</td><td>Trion Phantom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>十七氟-1,1,2,2-四氢癸基三氯硅烷&amp;nbsp;</td><td>Gelest (宾夕法尼亚州, 美国)</td><td>78560-44-8</td><td></td></tr><tr><td>自组装单分子层涂覆仪&amp;nbsp;</td><td>Sorona 公司</td><td>AVC 150M</td><td></td></tr><tr><td>光固化纳米压印光刻胶</td><td>micro resist technology GmbH</td><td>mr-UVCur21-300nm</td><td></td></tr><tr><td>光固化系统</td><td>Dymax&amp;nbsp;</td><td>Model 2000 Flood</td><td></td></tr><tr><td>电子束蒸发设备</td><td>Denton Explorer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见光谱仪&amp;nbsp;</td><td>Ocean Optics HR2000+ (佛罗里达州邓迪, 美国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准折射率液体&amp;nbsp;</td><td>Cargill 公司 (新泽西州雪松格罗夫, 美国)</td><td>18032</td><td></td></tr><tr><td>绘图软件</td><td>Origin</td><td>Origin Pro 9</td><td></td></tr><tr><td>10-羧基-1-癸硫醇&amp;nbsp;</td><td>Dojindo 实验室 (日本)</td><td>C385-10</td><td></td></tr><tr><td>1-辛硫醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, 密苏里州, 美国</td><td>471386</td><td></td></tr><tr><td>磺基-N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺&amp;nbsp;</td><td>BioRad (加利福尼亚州, 美国)</td><td>1762410</td><td></td></tr><tr><td>抗肌钙蛋白抗体 560</td><td>Hytest (芬兰)</td><td>4T21</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺盐酸盐溶液</td><td>BioRad (加利福尼亚州, 美国)</td><td>1762450</td><td></td></tr><tr><td>表面等离子体共振设备</td><td>BioRad XPR36 (以色列海法)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多通道 SPR 芯片</td><td>BioRad</td><td>GLC</td><td></td></tr><tr><td>人cTnI标准品</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>EK -311-05</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸盐酸盐</td><td>BioRad (加利福尼亚州, 美国)</td><td>1762221</td><td></td></tr></tbody></table>

利用超常光学透射技术定量检测人血清中的心脏生物标志物

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

为了使生物传感平台在即时检测（POC）环境中具有临床相关性，检测的灵敏度、可重复性以及在人血清背景中可靠监测分析物的能力至关重要。
纳米压印光刻技术（NIL）被用于低成本制备面积达1.5 mm × 1.5 mm的传感区域。传感表面由高保真度的纳米孔阵列构成，每个纳米孔的面积约为140 nm2NIL 的高度可重复性使得在 12 个独立制造的表面上采用“单芯片、单次测量”策略成为可能，芯片间的差异极小。这些纳米压印局域表面等离子体共振（LSPR）芯片在复杂生物流体（此处为人类血清）背景下，对浓度范围为 2.5 至 75 ng/mL 的生物分析物进行了广泛测试，验证了其可靠检测能力。NIL 的高保真特性可实现大面积传感区域的制备，从而无需使用显微镜，因为该生物传感器可轻松与实验室常见的光源耦合。这些生物传感器对血清中心肌肌钙蛋白的检测具有高灵敏度，检出限（LOD）达 0.55 ng/mL，具有临床相关性。同时，芯片间变异率低（归因于高质量的制备工艺）。检测结果与广泛使用的酶联免疫吸附测定（ELISA）法相当，但该技术仍保留了基于 LSPR 传感平台的各项优势。即， 易于微型化和多重检测，使其在即时检测（POC）应用中更具可行性。

用于进行测量的光学装置如图1A所示。实际纳米孔阵列的图像见图1B。为了理解驱动传感过程的物理机制，使用COMSOL仿真软件模拟了水环境中等离激元场的分布情况，并将仿真结果与实际测量结果进行了关联。此前已发表的研究中包含了仿真所采用的假设和参数的详细信息11,13。用于模拟纳米孔阵列等离激元场的物理尺寸如下：p = 400 nm，D = 150 nm，T = 100 nm。在计算透射光谱时，还考虑了吸收和散射效应14。图1C中对比了仿真光谱与实验测得的光谱。仿真和实测光谱均显示出在450至850 nm范围内存在四个吸收带。位于495 nm处的吸收带对应于金的带间跃迁。随后的三个吸收带按波长递增顺序分别称为I-III带，其位置分别为56...

本研究描述了一种纳米压印光刻技术，用于制备基于异常光学透射原理的高质量传感阵列。该生物传感器成本低、稳定性好、操作简便，可在临床相关浓度下检测血清中的心肌肌钙蛋白I（99th 百分位数截断值 ∼10–400 pg/mL，具体取决于检测方法。

要使生物传感平台在即时检测（POC）环境中具有临床相关性，检测方法需具备高灵敏度、可重复性以及可靠监测……

该技术的总体目标是在临床相关浓度下，在即时检测环境中测量复杂生物液体背景中的生物标志物，而无需复杂的光学或电学装置。该方法有助于推动基于异常透射的生物传感器在即时检测场景中的实际应用。该技术的主要优势在于不需要任何复杂的电学或光学设置。在我们的实验中，该传感器能够可靠地检测临床相关浓度的生物标志物。传感器芯片的制备需在洁净室中进行，无法进行拍摄，因此此处以动画形式展示该过程。制备镍模具时，将一层厚度为220纳米的负性电子束抗蚀剂涂覆在厚度为600微米的四英寸硅片上。使用电子束光刻系统在该硅片上写入设计的纳米孔阵列。为加快电子束写入速度，每个300微米的场尺寸采用20,000的低点阵图进行图案写入。将四英寸硅片浸入显影液中显影10秒，随后让硅片在空气中自然干燥。在硅片表面沉积一层金属种子层，如镍、铜或铝。然后在镀镍-磺基乳酸盐镀液中，通过电镀系统分两步对硅片进行电镀。通过施加轻微的机械力，将镍模具从硅基底上分离。接着，使用纳米压印机将纳米图案压印到已涂覆300纳米厚光固化纳米压印光刻胶层的四英寸玻璃晶圆上。将模具、光刻胶和玻璃晶圆转移至紫外光固化系统中进行光照固化。如果所有步骤均正确执行，镍模具应能轻松从光刻胶上脱模。在玻璃基底上的玻璃晶圆进行光刻胶的空白刻蚀后，使用电子束沉积设备沉积一层铬以增强金属附着力，并沉积一层金用于等离子体传感器。通过氧气等离子体刻蚀三分钟去除光刻胶，随后在丙酮中超声处理15秒。然后，将样品切成5毫米×5毫米的芯片。纳米孔阵列将位于芯片中央的2毫米×2毫米正方形区域内。为获取数据，搭建光学测量装置，使白光光束从发射端光纤末端出射后经准直，垂直（90度）入射到传感器表面。光穿过整个纳米孔阵列。使用接收光纤收集透射信号，并用紫外-可见分光光度计记录，其工作波长范围为300至1,000纳米。进行传感器体相灵敏度测试时，将折射率在1.31至1.39之间变化的标准折射率液体注入液相池中。将传感器芯片浸入标准折射率液体中，并与白光光束对准，然后获取透射光谱。每次测量后，使用表面活性清洗剂清洁传感器芯片，并用氮气吹干。进行传感器表面修饰时，首先将传感器芯片依次浸入异丙醇、丙酮和去离子水中清洗，然后再进行任何化学修饰。随后，在室温下用干燥的氮气流吹干传感器芯片。接下来，将传感器芯片在乙醇溶液中于室温下孵育12小时。这将形成一种胺基反应性自组装单分子层。孵育后，使用乙醇彻底冲洗芯片，并在室温下干燥。接着，将芯片浸入含有75毫摩尔的磺基-羟基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）和15毫摩尔的EDC的混合溶液中，反应15分钟。这将激活自组装单分子层的羧基。然后在传感器表面点样50微升用pH 4.5醋酸盐缓冲液配制的200微克/毫升抗三联体抗体溶液。孵育30分钟后，将传感器芯片浸入1摩尔的乙醇胺盐酸盐溶液中15分钟，以封闭未反应的酯基。最后，用去离子水冲洗芯片，并在室温下用干燥氮气流吹干。在传感器芯片表面点加100微升1%牛血清白蛋白溶液，以阻断非特异性结合，孵育15分钟。用磷酸盐缓冲液冲洗传感器芯片三次。将芯片插入测量池中，记录透射光谱，此为参考光谱。然后将50微升心肌肌钙蛋白I标准品点样到芯片表面。将芯片置于湿润环境中孵育30分钟。用PBS溶液将传感器芯片清洗三次后，将其插入测量池中以记录透射光谱。这是结合后的光谱。接下来，将芯片浸入50毫摩尔的甘氨酸盐酸溶液中1分钟，然后用PBS溶液冲洗3次，以再生芯片表面。在PBS中测量透射光谱，以验证再生步骤是否成功。图中显示了生物传感器在与血清中浓度为30纳克/毫升的人类心肌肌钙蛋白相互作用后，其透射光谱的变化。蓝色曲线代表相互作用前的光谱，红色曲线代表相互作用后的光谱。虚线圆圈标示了被追踪的谱带。图中显示了在肌钙蛋白浓度分别为 2.5 纳克/毫升、7.5 纳克/毫升、30 纳克/毫升和 75 纳克/毫升时，第二波段波长的变化情况。误差棒表示标准偏差。该图展示了纳米孔生物传感器芯片在再生后所观测到的波段波长偏移。条带二的位置重新移回其原始位置，表明再生步骤成功。一旦掌握，若操作得当，测量可在一小时内完成。采用该方法检测生物分析物时，必须使用新鲜配制的试剂。请务必确保将耗材充分溶解。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备基于异常光学透射原理的生物传感器，并可在复杂背景下监测生物分析物。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为制备高保真度的纳米孔阵列具有挑战性，而这种阵列正是实现芯片与光纤直接连接的关键，无需使用显微镜，并可选用可重复使用的树脂材料。该技术可实现连续测量，在医疗环境中至关重要。芯片的制备在很大程度上保证了测量结果的可重复性。在基本平台保持不变的情况下，该技术的进一步改进将来源于采用更高分辨率的技术以提高灵敏度，以及运用信号处理方法来获得更优的信噪比。该技术的应用意义在于，可在实时、即时检测的条件下，针对血清复杂背景监测多种生物分析物。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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