生成和动脉病变的小鼠的三维定量使用光学投影层析成像

该程序的总体目标是展示光学投影断层扫描如何用于小鼠动脉粥样硬化和新内膜病变的可视化和三维定量。这是通过首先在小鼠中产生动脉病变来实现的，无论是通过手术还是通过给易患动脉粥样硬化的小鼠喂食高胆固醇饮食。下一步是隔离目标动脉并使用光学投影断层扫描对其进行扫描。

最后的步骤是进行图像重建，识别病灶，并测量病灶体积。最终，结果可以通过图像分析显示病变的解剖重建以及病变体积和动脉狭窄的量化。我们小组对了解导致动脉狭窄导致危及生命的并发症（如心脏病发作和中风）的病变形成的潜在机制感兴趣。

光学投影断层扫描的这种应用是由 Nicholas Kirkby 博士与 Lucy Lowe 博士合作在我们小组开发的，并将由在我们实验室工作的博士后科学家 Jung Shi Wu 博士进行演示。与现有方法（如组织学和免疫组织化学）相比，该技术的主要优点是劳动强度较低，并且允许三维分析而不是二维分析。这种诱导股动脉病变的技术是从 R 和 Company 以及 Sada 和 Company 的技术修改而来的。

文本协议解释了如何通过饮食作诱导动脉粥样硬化病变。从一只 10 到 12 周大的 C 57 black six 小鼠开始，体重在 25 到 30 克之间。麻醉后，将鼠标放在温暖的垫子上以保持其体温，并通过鼻锥提供 2% 至 3% 的氟。

当鼠标对脚趾捏没有反应时，以每公斤 0.1 毫克的剂量施用丁丙诺啡。接下来，将鼠标放在它的背上，剃掉左后肢的腹面。然后做一个切口，露出腘动脉分叉和腹壁之间的上后肢肌肉。

在整个手术过程中进行钝器解剖，将股神经与股动脉和静脉隔离开来。保持组织湿润，用 1% 重量的 li canine 。接下来，在靠近腹壁的股动脉和静脉周围和腘动脉分支正下方放置临时 6.0 Mers 丝结扎线。

这些是为了控制血液流动。然后用股动脉隔离腘动脉，在分支远端 2 到 5 毫米处，并结扎腘动脉下的腘动脉。放置第二个连字。

现在，在紧邻股动脉分支远端的腘动脉中做一个小切口。对近端临时结扎线施加压力，以防止出血通过切口进入股动脉，朝向腹壁。插入一根 0.014 英寸的 G 线，大约 1 到 1.5 厘米。

将其留在原位 30 秒，然后将其取下。然后使用结扎结扎术，切口上方的腘动脉。小心避免阻塞股动脉。

现在删除临时连字。使用 5.0 mercal 用不连续的缝合线闭合伤口。然后涂抹 EMLA 乳膏。

让动物在恢复笼中恢复意识和运动，然后再将其送回家笼。预计这条腿会在两三天内出现跛行，但这并不意味着必须隔离老鼠。对于 OPT，必须对小鼠实施安乐死，从戊巴比妥诱导终末麻醉。

然后进行经心脏灌注固定和放血。现在隔离股动脉或主动脉弓及其分支。在此过程中去除任何无关的外围材料。

然后将组织后固定在 10% 中性缓冲福尔马林中过夜。第二天，将组织储存在 70% 乙醇中，或将动脉包埋在过滤的 1.5% LMP aeros 中。在大约 40 摄氏度下轻轻地将组织放入熔融的空气中。

修剪 Aero 以形成圆锥形。现在将此制剂在 100% 甲醇中脱水至少 12 小时。脱水后，用苯并醇和苯并苯酸盐的一到两种混合物清理血管。

让容器在此溶液中孵育 12 至 24 小时。第二天，将清除的样品加载到断层扫描中，该断层扫描应进行预校准。分辨率设置为 1024。

按 1024 像素。设置感兴趣区域的放大倍数。Z 轴将自动设置为相同的分辨率。

体素大小约为 200 微米。接下来，使用 Brightfield 通道定位样本，使其在视野中心绕自己的轴旋转。使用 GFP 单滤镜发射通道，设置焦距并调整曝光度，以最大化图像的动态范围。

避免过度饱和。现在仅以 0.9 度的步长扫描 GFP 单发射通道中的容器。然后，在包埋到蜡中之前，应将样品放回 100% 甲醇中至少 24 小时。

对于组织学分析，使用数据查看器软件在 n recon 软件或类似软件中打开采集的图像。检查图像重建的质量，提高图像质量，调整图像强度，并让软件补偿样品与其理想旋转轴的任何错位。对于每次扫描，定义包含病变的垂直感兴趣区域。

在每 50 条扫描线中，跟踪介质之间的边界和内部弹性层的位置。然后，软件可以在所有其他扫描中插入边界，手动检查这些插值并根据需要进行更正。现在生成一个二进制图像集，其中白色像素代表新内膜，黑色像素代表漆膜内腔。

这是通过定义强度阈值来实现的。完成此作后，物体体积是总病变体积，管腔体积是总体积减去物体体积。因此，评估了病变和管腔沿眼轴长度的分布。

股动脉在 Wire 诱导或结扎诱导损伤后 28 天收获。新内膜增厚在重建的二维载玻片的发射投影中很明显。可以区分同心性新内膜病变。

APOE 缺陷小鼠的整个主动脉弓的光学投影断层扫描发射图像确定了主动脉弓小曲率、头臂动脉以及左颈动脉和锁骨下动脉起源的预期病变。相同的病灶被分割并呈现为红色。为了强调叠加在原始图像上时斑块的分布，可以在横截面图像中区分介质和管腔，表明这些是偏心病变。

在这里，随着扫描沿着这些分支向远端移动，病变逐渐减少并消失，首先在锁骨下动脉，然后在颈动脉，最后在头臂动脉。有趣的是，当该血管分为右颈动脉和右锁骨下动脉时，头臂动脉中的这个病变会转移到分流器。在 OPT 程序之后，可以执行其他方法，如组织学和免疫组化，以回答其他问题，例如病变的组成是什么？

因此，在它发展之后，这项技术为在血管研究领域工作的科学家们研究内皮受体、凝集素和类固醇代谢酶在新内膜和动脉粥样硬化病变发展中的作用铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何使用光学投影断层扫描从 rine 动脉获取和分析病变有很好的了解。