生成和动脉病变的小鼠的三维定量使用光学投影层析成像

本实验的总体目标是展示如何利用光学投影断层扫描技术对小鼠体内的动脉粥样硬化和新生内膜病变进行可视化及三维定量分析。首先，通过手术方法或对易发生动脉粥样硬化的易感小鼠饲喂高胆固醇饮食，诱导小鼠体内形成动脉病变；随后，分离目标动脉，并采用光学投影断层扫描技术对其进行扫描。

最后的步骤包括进行图像重建、识别病灶以及测量病灶体积。最终结果可显示病灶的解剖学重建图像，并通过图像分析对病灶体积和动脉狭窄程度进行定量。我们课题组致力于研究导致动脉狭窄并引发心肌梗死和脑卒中等危及生命并发症的病灶形成机制。

这种光学投影断层成像技术的应用由我们团队的 Nicholas Kirkby 博士与 Lucy Lowe 博士合作开发，将由在我们实验室工作的博士后科学家 Jung Shi Wu 博士进行演示。该技术相较于组织学和免疫组织化学等现有方法的主要优势在于，其劳动强度更低，并且能够实现三维而非二维的分析。诱导股动脉损伤的这一技术，是在 R 公司和 Sada 公司所建立的方法基础上改进而来的。

该文字方案介绍了通过饮食调控诱导动脉粥样硬化病变的方法。选用10至12周龄、体重在25至30克之间的C57 black six小鼠。麻醉后，将小鼠置于保温垫上以维持其体温，并通过鼻罩以2%至3%的异氟烷维持麻醉。

当小鼠对脚趾夹捏无反应时，按每千克0.1毫克的剂量给予布托啡诺。接着，将小鼠仰卧位固定，并剃除左侧后肢腹侧的毛发。然后做切口，暴露左后肢上部肌肉，范围介于腘动脉分叉处与腹壁之间。

在整个操作过程中，采用钝性分离法将股神经从股动脉和股静脉中分离出来。用1%（重量/体积）利多卡因保持组织湿润。接下来，在靠近腹壁处以及紧邻腘动脉分支的下方，分别在股动脉和股静脉上放置临时的6.0号丝线结扎线。

这些操作用于控制血流。然后分离腘动脉，在股动脉分支远端2至5毫米处，在腘动脉下方结扎腘动脉。再放置第二个结扎线。

现在，在腘动脉上靠近与股动脉分支远端的位置做一个小切口，用于导丝插入。对近端临时结扎处施加压力，以防止血液从切口处流入股动脉并流向腹壁。插入一根直径为0.014英寸的导丝，插入深度约为1至1.5厘米。

保持原位30秒，然后将其移除。接着使用结扎线结扎切口上方的腘动脉。注意避免闭塞股动脉。

现在移除临时结扎线。使用5.0美兰线进行间断缝合关闭切口。然后涂抹EMLA乳膏。

将动物放回饲养笼之前，需在恢复笼中等待其意识和运动功能恢复。术后腿部可能出现两到三天的跛行，但这并不意味着必须将小鼠隔离。对于光学投影断层成像（OPT），需对小鼠实施安乐死，可通过戊巴比妥诱导终末麻醉。

然后进行经心脏灌注固定并放血。现在分离股动脉或主动脉弓及其分支。在此过程中去除任何多余的周围组织。

然后将组织在10%中性缓冲福尔马林中固定过夜。次日，可将组织保存于70%乙醇中，或继续将动脉包埋于过滤的1.5%LMP琼脂糖中。将组织轻轻放入约40摄氏度的熔融琼脂糖中。

修剪气凝胶以形成圆锥形。随后将样品在100%甲醇中至少脱水12小时。脱水完成后，用苯甲醇与苯甲酸苄酯按1:2比例配制的混合液对组织进行透明处理。

将容器在此溶液中孵育12至24小时。第二天，将澄清的样品装入已预先校准的断层扫描仪中。分辨率为1024。

通过1024像素设置感兴趣区域的放大倍数。Z轴将自动设置为相同的分辨率。

体素大小约为 200 微米。接下来，使用明场通道将样品定位，使其在视野中心围绕自身轴线旋转。使用 GFP 单一滤光发射通道，设置焦距并调整曝光，以最大化图像的动态范围。

避免过度饱和。现在仅使用 0.9 度步进在 GFP 的单个发射通道中扫描容器。样品随后应返回至 100% 甲醇中，于包埋入石蜡前至少保存 24 小时。

进行组织学分析时，在 n recon 软件或类似的数据查看软件中打开获取的图像。检查图像重建的质量，优化图像质量，调整图像强度，并使用软件校正样本相对于理想旋转轴的任何错位。针对每次扫描，定义包含病灶的垂直感兴趣区域。

每第50条扫描线上，勾画出血管中膜与内弹力板位置之间的边界。软件随后可在所有其他扫描线中对边界进行插值，手动检查这些插值结果，并根据需要进行修正。现在生成一组二值图像，其中白色像素代表新生内膜，黑色像素代表通畅管腔。

这是通过定义强度阈值来实现的。一旦完成此步骤，目标物体体积即为总病灶体积，管腔体积则为总体积减去目标物体体积。因此，可评估病灶和管腔沿轴向长度的分布情况。

在导丝诱导或结扎诱导损伤后28天，获取小鼠股动脉。在重建的二维切片的发射投影中可见明显的新生内膜增厚，可区分出同心圆状的新生内膜病变。

通过光学投影断层成像技术获得的载脂蛋白E缺陷小鼠完整主动脉弓发射图像，显示了主动脉弓内侧曲、无名动脉以及左颈总动脉和左锁骨下动脉起始处的预期病变。同一病变被分割并以红色呈现。为了强调斑块在原始图像上叠加时的分布情况，可在横截面图像中区分中膜和管腔，显示这些病变为偏心性病变。

此处，随着扫描沿这些分支远端移动，病变首先在锁骨下动脉逐渐减轻并消失，随后在颈动脉，最后在头臂动脉消失。有趣的是，当头臂动脉分叉为右侧颈动脉和右侧锁骨下动脉时，该处的病变会移行至血流分隔处。在完成OPT操作后，还可进行组织学和免疫组织化学等其他方法，以回答更多问题，例如病变的组成成分是什么？

因此，在该技术发展之后，为从事血管研究领域的科学家们提供了研究内皮受体、凝集素以及类固醇代谢酶在新生内膜和动脉粥样硬化病变形成中作用的新途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用光学投影断层扫描技术获取并分析小鼠动脉中的病变。