Name: 生成和动脉病变的小鼠的三维定量使用光学投影层析成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 学习使用光学投影层析成像技术对小鼠动脉病变进行三维可视化和定量分析。该方法可精确测量动脉粥样硬化及内膜增生性病变的体积，为心血管疾病机制研究提供重要工具。

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本工作获得了爱丁堡大学（NSK）和卡内基信托基金（LL；Henry Dryerre 计划）提供的学生奖学金，以及英国心脏基金会（PWFH、BRW、DJW；RG/05/008；PG/05/007；PG/08/068/25461）和惠康信托基金（JRS、BRW、DJW；08314/Z/07/Z）的资助。作者感谢英国心脏基金会资助的研究卓越中心授予心血管科学中心的支持，为本研究工作提供了帮助。
作者特别感谢德岛大学的Masataka Sata教授以及西奈山医学院Ernane Reis研究组的Igor Chersehnev博士在建立新生内膜损伤手术模型方面提供的建议。由Sata制作并提供的视频 等（http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm）特别有用。

1. 小鼠股动脉新生内膜病变的手术诱导
<ol>
	<li>涉及动物的实验应按照国家和机构的伦理要求进行。所有手术均应采用适当的无菌技术操作。新生内膜病变的诱导采用 Roque 等12 和 Sata 等13 所描述技术的改良方法。</li>
	<li>称量雄性 C57Bl6/J 小鼠（年龄 10–12 周，体重 25–30 g），然后将 4–5% 异氟烷通入诱导室以进行麻醉。麻醉诱导后，将小鼠转移至加热垫上，以维持体温在 37 °C。通过面罩持续给予异氟烷（2–3%）。</li>
	<li>当达到适当的麻醉深度（对足趾夹捏无反应）时，给予丁丙诺啡（0.1 mg/kg-1）作为镇痛覆盖。然后将小鼠置于仰卧位，并剃除左侧后肢腹侧的毛发。</li>
	<li>做切口以暴露后肢上部肌肉，并在腘动脉分叉处与腹壁之间，使用钝性分离法将股动脉和股静脉与股神经分离。根据需要使用 1% w/v 利多卡因冲洗伤口。</li>
	<li>在股动脉和股静脉上放置近端（靠近腹壁）和远端（腘动脉分支下方立即处）的临时结扎线（6/0 Mersilk），以控制血流。然后分离腘动脉（从股动脉分支处远端约 2–5 mm 范围），并在远端结扎。在腘动脉下方放置第二根未打结的结扎线。</li>
	<li>在腘动脉上做一小切口（动脉切开术），位置紧邻股动脉分支的远端，通过压迫近端临时结扎线防止出血。将一根直的弹簧式 0.014” 导丝沿股动脉向腹壁方向推进 1–1.5 cm，并留置 30 秒（图 1A）。</li>
	<li>取出导丝，使用预先放置的结扎线在动脉切开部位上方结扎腘动脉，注意避免阻塞股动脉。 
	注：用于结扎诱导的损伤。通过结扎股动脉或腘动脉可诱导产生无管腔内损伤的新生内膜重塑（图 1B 和 1C）。为此，请执行步骤 1.1–1.5，但不要进行动脉切开术（跳过步骤 1.6），而是（i）在股动脉分支处紧邻远端结扎腘动脉，或（ii）在腘动脉分支点处结扎总股动脉。然后继续执行步骤 1.8。</li>
	<li>移除临时结扎线，使用间断外缝线（5/0 Mersilk）关闭切口，并涂抹 EMLA 乳膏（2.5% 利多卡因，2.5% 丙胺卡因）。让动物恢复意识（通常需 5–10 分钟），并在放回饲养室前确认其能在笼内自由活动（患肢可能出现轻微跛行，但应在术后前 2–3 天内缓解）。术后小鼠无需单笼饲养。</li>
	<li>让动物恢复最多 3 个月。小型病变将在导丝损伤后约 7 天开始出现，并在约 21–28 天后达到稳定的最大尺寸。</li>
</ol>
2. 载脂蛋白 E-/- 小鼠动脉粥样硬化病变的诱导
<ol>
	<li>给6周龄雄性ApoE基因敲除小鼠（本实验室繁育）喂食西方饮食（0.2%胆固醇；Research Diets，美国）持续12周。</li>
	<li>动脉粥样硬化病变通常可在主动脉弓及其主要分支的大体检查中观察到（图2）。</li>
</ol>
3. 使用光学投影断层扫描技术（OPT）分析动脉病变
注意：使用光学投影断层扫描仪获取小鼠股动脉和主动脉弓样本中病变的 OPT 图像。
<ol>
	<li>在终末麻醉（戊巴比妥钠 80 mg/kg）下，通过经心灌注固定并放血处死小鼠，先使用含肝素（10 U/ml）的磷酸盐缓冲液（PBS），随后使用10%中性缓冲甲醛溶液。</li>
	<li>根据需要分离股动脉或主动脉弓及其主要分支（左颈总动脉、左锁骨下动脉、头臂干），并去除多余的外膜周围组织。用10%中性缓冲福尔马林固定过夜，随后转移至70%乙醇中保存，待用。</li>
	<li>将动脉嵌入经Whatman 113 V滤纸预过滤的1.5%低熔点琼脂糖中。使用氰基丙烯酸酯胶将每个样本固定于磁性OPT载具上，确保血管轴线与载具轴线对齐。修整多余琼脂糖，呈圆锥形。在100%甲醇中脱水至少12小时。</li>
	<li>通过将样本浸入苯甲醇与苯甲酸苄酯（1:2 v/v）的混合液中 12–24 小时以实现组织透明化。</li>
	<li>将透明化处理后的样本置于校准后的断层扫描仪中。设置分辨率为1024 × 1024，并选择适当的光学放大倍数，以确保整个目标区域均可见。OPT体积数据为各向同性，z轴重建至相同分辨率即，1,024 × 1,024 × 1,024），体素尺寸约200 µm。此分辨率可能被高估，因为可能存在重建伪影。调整样品位置，使其在明场透射通道中围绕自身轴线在视场中心旋转。</li>
	<li>在GFP1滤光片发射通道（激发滤光片：425 nm，带宽40 nm；发射滤光片：475 nm长通）中，对样本进行聚焦，并调整曝光时间以最大化所得图像的动态范围（避免过饱和）。仅在GFP1发射通道中以0.9°的旋转步长扫描血管。</li>
	<li>完成扫描后，使用 DataViewer 软件确认数据采集质量。将样本从扫描仪中取出。</li>
	<li>为便于后续进行组织学分析，将样本置于100%甲醇中 &#62;24小时后按常规方法进行石蜡包埋处理。</li>
</ol>
4. 图像重建与分析
使用 NRecon 软件或类似软件，通过滤波反投影进行断层重建。重建可无人值守地批量进行。
<ol>
	<li>通过校正错位并调整图像强度水平来提高图像质量。</li>
	<li>使用 DataViewer 软件检查图像重建的质量。</li>
	<li>确定用于分析的样本适当区域。如果需要记录管腔尺寸，则不同样本之间的该长度应保持一致。</li>
	<li>通过手动勾画每50个重建横截面中1个的适当边界，来定义病灶的轮廓。</li>
	<li>检查每个交错的横截面，以确保计算机生成的插值结果正确。在必要时手动调整边界。</li>
	<li>设置灰度阈值，使仅病变区域被选中，并导出测量数据。</li>
	<li>每次扫描时，定义一个包含病灶的垂直感兴趣区域，并勾画出中膜与新生内膜之间的边界（即，每隔50个位置记录内弹性膜的位置）th 扫描线。在软件中对交错的扫描线进行内膜/中膜边界的插值，并在需要时验证和校正拟合结果。进一步根据手动设定的强度阈值对该已定义的三维体积进行分割，生成二值图像集，其中白色像素代表新生内膜，黑色像素代表通畅管腔。</li>
	<li>测量指标包括：病灶总体积（物体体积）、管腔体积（总体积减去物体体积），以及病灶和管腔横截面积沿所研究血管轴向长度的分布情况。</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

三维分析在替代或补充目前仍作为动脉病变形成研究主流的二维组织学技术方面具有巨大潜力。本文展示了该技术在小型鼠动脉中的应用（其中鼠股动脉可能是使用此技术成功分析的最小血管）。然而，该技术同样适用于其他物种的动脉（及病变）分析，包括中小型人类血管；本课题组已成功应用该技术分析兔主动脉中的病变（Bezuidenhout et al.；未发表数据）。与传统组织学相比，光学投影断层成像技术（OPT）有望实现更快的分析速度并提供更丰富的结构信息，且其优势在于不会影响后续对样本进行组织学和免疫组织化学分析。
采用 OPT 技术生成的图像提供了详细的解剖学信息，能够显示病变形成的位置以及这些区域病变的大小。本研究所用的动脉可能接近该技术分辨率的极限，因此图像质量在一定程度上受到伪影的影响（可能源于旋转错位、组织透明不完全、琼脂糖尖端处的反射/折射以及聚焦问题）。尽管如此，所需的关键细节（即，血管壁各层结构）仍然清晰可辨，因此该技术对于各血管壁层的定量分析极为有用。事实上，可快速且可重复地对图像进行定量分析，以获取血管中斑块所在节段的病变体积和管腔体积，以及在选定位置处病变和管腔的横截面积。本方法已成功用于分析大（主动脉）和中等尺寸（股动脉、颈动脉、锁骨下动脉）的小鼠动脉——这些血管通常是研究小鼠动脉粥样硬化和内膜增生病变的标准分析对象。事实上，我们已利用 OPT 技术验证了药物干预和基因操作对动脉粥样硬化及内膜增生病变大小的影响。例如，内皮素受体阻断可改变内膜增生病变的形成，而特异性剔除血管内皮上的内皮素 B 受体则无此效应15。在易发动脉粥样硬化的小鼠模型中，剔除 11β-HSD116 或半乳糖凝集素 3（galectin 3）17 的基因可使动脉粥样硬化病变的体积减小。
病变体积的定量分析是光学投影断层成像（OPT）的一个明显优势。与传统的组织学方法相比，它能更全面地反映动脉中的总体病变负荷4。对整个病变区域进行分析，可减少因仅选取血管特定离散节段进行分析而不可避免产生的选择偏差和误差。OPT的另一优势在于能够生成纵向的病变轮廓图，这一点在不同类型损伤所诱导的病变比较中尤为突出13,16（图5）。例如，完全结扎和导丝插入均在股腘分叉附近引起近乎完全的闭塞。然而，导丝损伤所导致的病变沿扫描节段全长延伸，而动脉结扎诱导的病变则迅速缩小并最终消失。这种模式&#160;与血管成形术导丝插入造成的损伤范围更广相符。若采用组织学切片获得类似结果，则成本高昂、耗时且劳动强度大。
OPT 的优势包括其生成图像的质量以及相对较高的速度和操作简便性（我们通常每天可扫描 20 个样本）。其图像质量优于或至少与其他用于体外（ex vivo）生成三维图像的方法（如 MRI 和显微 CT）相当，但 OPT 扫描时间更短（本研究中每幅图像的积分时间通常为 1–2 秒/图像），且成本更低。样本制备过程持续数天，但所需人工较少，样本可批量处理，数据可在一次会话中完成采集。因此，通量较高，且无需长时间占用扫描仪。重要的是，OPT 的非破坏性特性使其可用于识别免疫组织化学检测中的感兴趣区域，从而减少所需的切片和染色工作量。未来高分辨率超声技术的发展可能为该尺寸动脉内病变的容积定量提供一种替代方法，但作者尚未知悉有任何文献报道了该技术在此方面的应用。
或许并不令人意外的是，OPT 的图像质量低于显微技术（当然，后者仅适用于较小的样本）。对数据重建方法的改进有望解决这一局限性，从而在未来提升图像质量19,20。另一个方法学上的问题是组织处理过程会改变样本的特性。例如，透明剂苯甲醇/苯甲酸苄酯（BABB）具有亲脂性，可能会去除动脉粥样硬化病变中的脂质，而先前的脱水步骤可能导致组织收缩（尽管当然，脱水和去脂步骤也是石蜡包埋样本制备过程中的常规操作）。本研究采用 BABB，是因为与亲水性透明剂（例如甘油21）相比，它引起的形态学变化较小。
OPT 的进一步发展和优化存在多种可能性，特别是关于追踪参与动脉重塑的关键细胞和信号因子的三维排列。动脉组织强烈的自发荧光在解剖图像生成中具有显著优势，但现有漂白方法无法消除这种自发荧光22，这可能限制荧光探针在RNA和蛋白质分布模式检测中的应用。采用比色探针（例如 β-半乳糖苷酶）并通过透射成像进行可视化，可能克服这一局限性。
总之，光学投影断层成像技术（OPT）在小鼠动脉内膜病变的三维成像方面具有巨大潜力。相较于通常耗时费力且无法有效反映整体病变体积的二维方法，OPT 技术是一项显著进步。该技术相对快速、便捷且具有非破坏性。图像分析领域的新进展有望进一步提升该技术的效能与应用价值。

动脉病变的形成是心血管疾病相关高发病率和高死亡率的核心问题1。目前认为，动脉损伤后不受控制的炎症反应是导致病变形成的原因2。动脉粥样硬化性病变是在动脉壁长期慢性损伤刺激下缓慢形成的，而再狭窄性病变则在急性机械性损伤（例如支架植入术后）后迅速发展。通过使用合适的动物模型，通常结合相关的遗传学操作，人们对动脉病变发生机制的理解已取得显著进展1。
病灶大小和成分的分析传统上在很大程度上依赖于 离体二维组织学（尽管随着更优方法的不断发展，这一状况正在改变） 体内 和 离体 小动物病变的检测与分析3）。动脉病变的组织学分析费时费力，且仅能提供有限的三维结构信息。例如，病变负荷通常通过测量病变横截面积（在随机选择的部位或在狭窄最严重的部位）来评估，这种方法无法全面反映整体病变负荷。整体封片三维成像技术为此问题提供了可能的解决方案，但迄今为止报道的适用方法却出乎意料地稀少。这可能主要归因于小鼠动脉的尺寸——其体积过大，无法适用于单光子共聚焦显微镜成像，但又过小，难以用于磁共振成像（MRI）。4 和X射线计算机断层扫描（CT）5. 应用 离体 磁共振成像和微型计算机断层扫描用于研究小鼠动脉粥样硬化病变时，即使在相对较粗大的动脉中，其分辨率也有限。此外，较长的图像采集时间进一步限制了通量（并增加了扫描成本）4,6.
新型光学成像技术（如光学相干断层扫描3,7和光声断层成像8）在改善小鼠动脉病变成像方面具有广阔前景。光学投影断层成像（OPT）也展现出类似潜力，该技术最初开发用于小鼠胚胎的分析。OPT适用于直径约为0.3–10 mm的样本成像9。透射成像通过记录半透明样本对多色可见光的不透明度，可用于识别解剖结构。发射成像则记录样本中内源性（例如，胶原蛋白、弹性蛋白）和外源性荧光团在特定波长激发后发出的光信号，也可提供解剖学信息（因为不同组织成分所含自体荧光物质的类型和密度可能存在差异）。此外，通过使用适当的荧光探针，还可确定免疫反应性或基因表达的分布情况10。在任一成像模式（透射或发射）下，光线均聚焦于电荷耦合器件，使样本在旋转过程中进行逐次图像采集（通常以0.9°为步进角采集400幅图像）。这些图像可通过标准断层重建方法（如滤波反投影法（采用锥形算法）或迭代重建法）用于体积计算。
本视频展示了我们对光学投影断层成像技术（OPT）的创新应用，用于快速、可量化且经济高效的动脉粥样硬化及新生内膜病变的三维分析，如Kirkby 等11先前所述。该技术已被证明适用于三种常用模型中的病变大小定量分析：（i）股动脉导丝损伤模型；（ii）股动脉结扎模型；以及（iii）载脂蛋白E缺陷（apoE-/-）小鼠的饮食诱导动脉粥样硬化模型。

<table><tbody><tr><td>手术显微镜</td><td>Zeiss, Germany</td><td></td><td>OPMI Pico i</td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>Vet Tech, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluovac</td><td>Harvard Apparatus UK</td><td>340387</td><td></td></tr><tr><td>Fluosorber</td><td>Harvard Apparatus UK</td><td>340415</td><td></td></tr><tr><td>珠式灭菌器</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>1800-45</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>21061-10</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>MS1602S</td><td>PB1502 或同等型号</td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Ethicon, UK</td><td></td><td>5/0 Mersilk</td></tr><tr><td>导丝</td><td>Cook Inc, USA</td><td>C-PMS-251</td><td>0.014&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>丝线缝合线</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>18020-60</td><td>6/0 Mersilk</td></tr><tr><td>手术器械</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>14058-09</td><td>Toughcut Iris 剪刀</td></tr><tr><td>Cohan-Vannas 弹簧剪刀</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>15000-01</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Moria 虹膜镊</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito 止血钳</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>微型动脉夹</td><td>Fine Science Tools, UK</td><td>18050-35</td><td></td></tr><tr><td>Bioptonics 3001 断层扫描仪&amp;nbsp;</td><td>Bioptonics, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁性 OPT 载物台</td><td>Bioptonics, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td>Dell Inc, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson</td><td>F117606</td><td>Minipuls 3</td></tr><tr><td>DataViewer 软件&amp;nbsp;</td><td>Skyscan, Belgium</td><td>v.1.4.4</td><td></td></tr><tr><td>NRecon 软件&amp;nbsp;</td><td>Skyscan, Belgium</td><td>v.1.6.8</td><td></td></tr><tr><td>CTan 软件</td><td>Skyscan, Belgium</td><td>v.1.12</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Merial Animal Health Ltd, UK</td><td>AP/Drugs/220/96</td><td>100% 吸入用蒸气，液态</td></tr><tr><td>医用氧气</td><td>BOC Medical, UK</td><td>UN1072</td><td></td></tr><tr><td>Vetergesic</td><td>Alstoe Animal Health Ltd, UK</td><td></td><td>0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>1% 利多卡因</td><td>Hamlen Pharmaceuticals, UK</td><td>LD1010</td><td>10 ml 安瓿</td></tr><tr><td>EMLA 乳膏</td><td>Astra Zeneca, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Ceva Animal Health Ltd, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>西方饮食</td><td>Research Diets, USA</td><td>D12079B</td><td>0.2% 胆固醇</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma UK</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>肝素（黏液型）</td><td>Leo Laboratories, UK</td><td>PL0043/003GR</td><td>250,000 单位</td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林</td><td>Sigma, UK</td><td>HT501128</td><td>10%</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR BDH Prolabo, UK</td><td>20821.33</td><td>无水分析纯&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Invitrogen, UK</td><td>16020050</td><td>低熔点</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>GE Healthcare, UK</td><td>113v</td><td>Whatman</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯粘合剂</td><td>Henkel, UK</td><td>4304</td><td>Loctite</td></tr><tr><td>苯甲醇</td><td>Sigma, UK</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸苄酯</td><td>Sigma, UK</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>VWR BDH Prolabo, UK</td><td>20856.296</td><td>100%</td></tr></tbody></table>

利用光学投影断层成像技术生成并进行小鼠动脉病变的三维定量分析

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

在合适的动物模型中生成和分析血管病变是心血管疾病研究的基石，可为病变形成的发病机制及新疗法的作用提供重要信息。利用易发生动脉粥样硬化的转基因小鼠、手术诱导病变方法以及饮食干预，已极大加深了人们对疾病发展机制的理解，并推动了新治疗方法的潜力研究。
传统上，病变分析通过离体（ex vivo）的二维组织学技术进行。本文介绍了光学投影断层扫描技术（OPT）在动脉病变三维定量分析中的应用。由于该技术具有非破坏性特点，可作为标准组织学和免疫组织化学分析的补充手段。
通过导丝插入或结扎小鼠股动脉诱导新生内膜病变，而动脉粥样硬化病变则通过给载脂蛋白E缺陷小鼠喂饲致动脉粥样硬化饮食来建立。
采用自体荧光发射的光学投影断层成像技术对病变进行检测，随后进行相应的组织学和免疫组织化学分析。光学投影断层成像可清晰区分病变与下方的血管壁。通过平面测量法在二维切片上计算病变大小，从而获得病变体积和最大横截面积。光学投影断层成像所生成的数据与组织学测量结果一致，证实了该技术的准确性及其作为传统分析方法补充（而非替代）的潜力。
本研究展示了光学投影断层成像技术（OPT）在动脉粥样硬化和新生内膜病变成像中的潜力。该技术提供了一种快速且亟需的离体（ex vivo）方法，可用于常规进行血管重构的三维定量分析。

对健康（未损伤）小鼠股动脉（n = 5）的初步扫描显示，透射成像无法提供有用图像。这是由于透明化处理后的动脉过于透明（而非过于不透明），不适合透射成像。然而，这对发射成像有利，因为发射信号不会被吸收或散射。相比之下，股动脉在发射通道中表现出强烈的自发荧光，其中在405–445 nm激发时信号最强（与弹性蛋白410 nm激发峰一致14）。由这些图像重建的二维切片可清晰区分中膜、管腔以及外膜与管腔。
在导丝损伤（n = 6）或结扎损伤（n = 5）后28天获取的小鼠股动脉中，非断层发射投影图像显示明显的新内膜增厚（图3A）。在重建的二维切片中，同心环状的新内膜病变因其较弱的发射信号而可与中膜区分开来（图3B 和 图S1）。
动脉弓及其主要分支的动脉粥样硬化小鼠全组织样本的OPT发射图像（n = 8）显示，病变分布符合预期的解剖学定位（即主动脉弓小弯侧、头臂动脉以及左颈总动脉和左锁骨下动脉的起始处图4A）。横截面图像显示，这些病灶通常为偏心性，可轻易与血管中膜和管腔区分开来（图4B, 图S2 和 S3).
在光学投影断层扫描（OPT）后对动脉进行组织学分析处理，证实了OPT的非破坏性特点，切片成功地使用组织学染色法（美国三色染色、苦味酸天狼星红）和免疫组织化学染色法（α-SMA、Mac-2）进行了染色（图3C 和 图4C）。
使用OPT测量病灶大小的结果与从同一动脉获取的组织学切片进行图像分析所得的测量结果一致11。
通过OPT与组织学获得的病灶面积平面测量值，在线性回归分析中显示出高度相关性，无论是导线诱导（R2 = 0.92）和结扎诱导（R2 = 0.89）的新生内膜病变，还是动脉粥样硬化斑块（R2 = 0.85）。OPT的一个重要优势在于其能够实现三维分析。通过该技术对病变进行体积定量，我们记录了导线损伤（0.1100 ± 0.0091 mm3；n = 6）和结扎损伤股动脉（0.0200 ± 0.0089 mm3；n = 5）以及动脉粥样硬化性锁骨下动脉（0.180 ± 0.018 mm3；n = 8）中的病灶体积。所有类型病变的测量结果均具有高度可重复性（变异系数分别为5.4%、11.4%和4.8%，n = 4）。导线损伤血管中的新生内膜病变明显大于结扎所致病变（p &lt;0.0001），这与前者造成的损伤程度更大相符。
所获得的数据还可表示为病灶图谱（图5），并可用于动态的定性评估（见图S1–图S3）。该方法清晰地展示了不同损伤操作所引起的病灶形成范围，并凸显了损伤血管中病灶分布的不均匀性。
<img alt="Arterial injury diagrams: wire injury, partial and complete ligation in femoral and popliteal arteries." src="/files/ftp_upload/50627/50627fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1： 小鼠股动脉损伤形成诱导方法 (A通过在腘动脉处进行动脉切开术，逆行插入血管成形术导丝至股动脉，可因牵拉损伤及内皮细胞去除而诱导病变形成。随后在血管受损节段恢复血流。B在不造成管腔内牵张、内皮剥脱或血流中断的情况下，可通过结扎诱导新生内膜增生 或者 股动脉或股动脉分叉处远端的腘动脉。C通过结扎股动脉和腘动脉在股总动脉分支点处，可诱导出更为严重的非剥脱性损伤/增殖反应。该技术还将阻断股动脉远端部分的血流。
<img alt="主动脉弓解剖图，标注动脉：锁骨下动脉、颈动脉、无名动脉、主动脉。" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠主动脉弓中动脉粥样硬化斑块的典型沉积。 易发生动脉粥样硬化的模型小鼠（载脂蛋白 E 缺陷小鼠）在喂食高胆固醇西方饮食 12 周后，其主动脉弓及其主要分支中会出现典型的病变沉积模式。如图所示，通过解剖显微镜下肉眼观察，可在主动脉弓、无名动脉以及左颈动脉和左锁骨下动脉的开口处观察到明显病变（箭头所示）。
<img alt="组织的OPT成像、断层重建、组织学比较、美国三色染色。" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：左股动脉结扎后病变形成。（A）非断层荧光发射图像（经反色处理以增强清晰度——深色区域对应更强的荧光信号）可识别内膜增厚（红色箭头所示）。（B）在断层重建图像中可区分不同的血管区域及管腔。（C）组织学分析（美国三色染色）突出了与OPT成像结果的高度相似性。（A-C）中的比例尺为200 µm。改编自Kirkby et al.11
<img alt="OPT成像、断层重建、组织学、免疫组织化学、动脉分析、显微镜检查" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4： 易发动脉粥样硬化小鼠主动脉弓中动脉粥样瘤的成像。（A）在主动脉弓的非断层图像中（图像已反转，使较暗区域表示更强的发射信号，从而提高清晰度），动脉粥样瘤（红色箭头）清晰可见，其位置与光学显微镜下观察所预测的粥样瘤分布区域一致（见图2）。（B）断层横截面图像进一步证实了该分布模式。（C）组织学染色（美国三色染色法）显示其与断层图像高度相似，而使用多种不同抗体进行的免疫组织化学染色则突出了OPT技术在病灶分析中与传统方法的互补性。（A–B）中的比例尺为1 mm；（C）中的比例尺为250 µm。RSA，右锁骨下动脉；RCA，右颈动脉；LCA，左颈动脉；LSA，左锁骨下动脉；BCA，头臂动脉；AAo，升主动脉；DAo，降主动脉。改编自Kirkby et al.11
<img alt="Graphs of neointima growth vs distance post-injury; uninjured, ligation, wire injury analysis." src="/files/ftp_upload/50627/50627fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5： 病灶和管腔轮廓分析表明，针对不同动脉损伤方法，新生内膜增生的程度存在差异。 光学投影断层扫描技术可沿股动脉长度方向绘制病灶和管腔横截面测量值。这清楚表明，与未受损动脉相比（A），部分结扎（B）产生较小且相对局限的病灶，而完全结扎（C) 在结扎部位产生完全闭塞，但病灶沿动脉延伸的距离较短。腔内钢丝损伤（D）导致的病灶几乎完全闭塞样本的远端，并沿扫描动脉节段的全长延伸。改编自 Kirkby 等.11
图 S1. 小鼠股动脉结扎损伤后获得的横断面图像的动画重建。 此类动画图像可用于定性与定量分析。随着动画从动脉近端向远端移动，可清晰观察到闭塞性内膜增生逐渐形成，并可与管腔及中膜区分开来。侧支易于识别，且随着病变增大，管腔闭塞和动脉向外重构现象明显。当到达结扎部位时，血管完全闭塞。改编自 Kirkby et al.11
图S2. 易发动脉粥样硬化小鼠主动脉弓横断面图像的动态重建。 动画首先显示升主动脉（左侧，最先出现）和降主动脉（右侧）的横断面。随着扫描向主动脉弓方向推进，升主动脉中开始出现小的病变。随后图像穿过主动脉弓，显示无名动脉（左侧）、左颈总动脉（中）和左锁骨下动脉（右侧）开口处严重的病变区域。当扫描沿这些分支远端移动时，病变逐渐减小并消失，首先在锁骨下动脉消失，随后在颈总动脉，最后在无名动脉消失。有趣的是，当无名动脉分叉为右颈总动脉和右锁骨下动脉时，其内的病变移至血流分叉处。改编自 Kirkby et al.11
图S3. 易患动脉粥样硬化小鼠主动脉弓的动画体积渲染图像。光学投影断层成像技术可生成三维图像，本例展示了载脂蛋白E缺陷小鼠主动脉弓中的病变分布情况。（A）动脉粥样硬化斑块出现在预期部位（头臂动脉全程、左颈总动脉和左锁骨下动脉开口处，以及主动脉弓的内侧弯曲处）。（B）对含病变（以红色显示）的横截面进行分割与渲染，并叠加于原始图像上，可更清晰地突出斑块的分布情况。改编自Kirkby et al.11

心血管疾病动物模型动脉病变的ex vivo分析传统上依赖于组织学和免疫组织化学技术，这些方法在三维病变中仅能提供二维测量结果。本文描述了利用光学投影断层成像技术生成动脉病变，以实现三维定量分析的方法。

在合适的动物模型中生成和分析血管病变是心血管疾病研究的基石，可产生……

本实验的总体目标是展示如何利用光学投影断层扫描技术对小鼠体内的动脉粥样硬化和新生内膜病变进行可视化及三维定量分析。首先，通过手术方法或对易患动脉粥样硬化的转基因小鼠饲喂高胆固醇饮食，诱导小鼠形成动脉病变；随后，分离目标动脉，并利用光学投影断层扫描技术对其进行扫描。最后的步骤包括进行图像重建、识别病灶以及测量病灶体积。最终结果可显示病灶的解剖学重建图像，并通过图像分析对病灶体积和动脉狭窄程度进行定量。我们课题组致力于研究导致动脉狭窄并引发心肌梗死和脑卒中等危及生命并发症的病灶形成机制。这种光学投影断层成像技术的应用由我们团队的 Nicholas Kirkby 博士与 Lucy Lowe 博士合作开发，本次演示由在我们实验室工作的博士后科学家 Jung Shi Wu 博士进行。该技术相较于组织学和免疫组织化学等现有方法的主要优势在于，其劳动强度更低，并且能够实现三维而非二维的分析。诱导股动脉损伤的这一技术，是在 R 公司和 Sada 公司等方法的基础上改进而来的。该文字方案详细说明了如何通过饮食调控诱导动脉粥样硬化病变。选用10至12周龄、体重在25至30克之间的C57BL/6小鼠。麻醉后，将小鼠置于保温垫上以维持其体温，并通过鼻罩以2%至3%的浓度供给异氟烷。当小鼠对脚趾夹捏无反应时，按每千克体重0.1毫克的剂量给予布托啡诺。接着，将小鼠仰卧位固定，并剃除左侧后肢腹侧的毛发。然后做切口，暴露自腘动脉分叉处至腹壁之间的后肢上部肌肉。在整个操作过程中，采用钝性分离法将股神经与股动脉和股静脉分离。用1%（重量/体积）利多卡因保持组织湿润。随后，在靠近腹壁处以及紧邻腘动脉分支的下方，分别在股动脉和股静脉上放置临时的6.0号Mersilk丝线结扎线。这些操作用于控制血流。然后分离腘动脉，在与股动脉分支远端2至5毫米处，在腘动脉下方结扎腘动脉。再放置第二个结扎线。现在，在腘动脉上紧邻股动脉分支的远端处做一个小切口，用于导丝插入。按压近端临时结扎线以防止血液从切口流出，并防止血液经股动脉流向腹壁。插入一根直径为0.014英寸的导丝，插入深度约为1至1.5厘米。保持原位30秒，然后移除。接着使用结扎线结扎切口上方的腘动脉。注意避免闭塞股动脉。现在移除临时结扎线。使用5.0美兰线进行间断连续缝合关闭伤口。然后涂抹EMLA乳膏。将动物放回饲养笼之前，应在恢复笼中让其恢复意识和活动能力。术后腿部可能出现两到三天的跛行，但这并不意味着必须将小鼠隔离。对于光学投影断层成像（OPT），必须对小鼠实施安乐死，可通过戊巴比妥诱导终末麻醉来完成。然后进行经心脏灌注固定并放血。现在分离股动脉或主动脉弓及其分支。在此过程中去除任何多余的周围组织。然后将组织在10%中性缓冲甲醛溶液中固定过夜。次日，可将组织保存于70%乙醇中，或继续将动脉包埋于过滤的1.5%LMP琼脂糖中。将组织轻轻放入约40摄氏度的熔融琼脂糖中。修剪气凝胶以形成圆锥形。然后将此样品在100%甲醇中至少脱水12小时。脱水完成后，用苯甲醇与苯甲酸苯酯按1:2比例配制的混合液透明处理。将容器在此溶液中孵育12至24小时。第二天，将澄清的样品装入已预先校准的断层扫描仪中。分辨率为1024。通过1024像素设置感兴趣区域的放大倍数。Z轴将自动设置为相同的分辨率。体素大小约为 200 微米。接下来，使用明场通道将样品定位，使其在视野中心围绕自身轴线旋转。使用 GFP 单一滤光发射通道，设置焦距并调整曝光，以最大化图像的动态范围。避免过度饱和。现在仅使用 0.9 度步进在 GFP 单一发射通道中扫描样本。在包埋于石蜡前，样本应返回 100% 甲醇中至少 24 小时。对于组织学分析，使用数据查看软件在 n recon 软件或类似软件中打开获取的图像。检查图像重建的质量，提高图像质量，调整图像强度，并让软件校正样本相对于其理想旋转轴的任何错位。对于每次扫描，定义包含病变的垂直感兴趣区域。每第50条扫描线上，勾画出血管中膜与内弹力板位置之间的边界。软件随后可在所有其他扫描线上自动插值生成该边界，手动检查这些插值结果，并根据需要进行修正。现在生成一组二值图像，其中白色像素代表新生内膜，黑色像素代表通畅管腔。这是通过定义强度阈值来实现的。一旦完成此步骤，目标物体体积即为总病灶体积，而管腔体积则为总体积减去目标物体体积。因此，可评估病灶和管腔沿轴向长度的分布情况。在导丝诱导或结扎诱导损伤后28天，获取小鼠股动脉。在重建的二维切片的发射投影中可见明显的新生内膜增厚，可区分出同心圆状的新生内膜病变。通过光学投影断层扫描发射图像，对载脂蛋白E缺陷小鼠的完整主动脉弓进行成像，结果显示在主动脉弓内弯侧、无名动脉以及左颈总动脉和左锁骨下动脉起始处存在预期的病变。同一病灶被分割并以红色呈现。为突出斑块在原始图像上叠加时的分布情况，可在横截面图像中区分中膜和管腔，从而显示这些病变为偏心性病变。在此，随着扫描从这些分支远端移动，病变首先在锁骨下动脉逐渐减轻并消失，随后在颈动脉，最后在头臂动脉消失。有趣的是，当头臂动脉分叉为右侧颈动脉和右侧锁骨下动脉时，该处的病变会延伸至血流分隔处。在完成OPT操作后，还可进行组织学和免疫组织化学等其他方法，以回答更多问题，例如病变的组成为何？因此，在该技术问世后，为从事血管研究领域的科学家们提供了研究内皮受体、凝集素以及类固醇代谢酶在新生内膜和动脉粥样硬化病变形成中作用的新途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用光学投影断层扫描技术获取并分析小鼠动脉中的病变组织。

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