数字 PCR 在急性心肌梗死和心血管疾病中量化循环 MicroRNAs 的临床观察

这种方法可能有助于回答诊断领域的关键问题，例如 micro RNA 是否是心血管疾病的有效生物标志物。与实时定量 PCR 相比，数字 PCR 在定量循环中的 microRNA 方面表现出卓越的技术品质。由于样品被分成大约 20， 000 个液滴，因此不需要重复测量，也不需要标准曲线进行定量。

虽然这种方法可能提供对心血管患者 microRNA 定量的见解，但它也可以应用于其他患者和疾病，因为其他 microRNA 已显示出作为癌症进展生物标志物的前景，它也可以应用于肿瘤患者。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为产生的飞沫很脆弱，需要小心处理。从血清样品中分离 RNA 后，继续进行逆转录以获得更稳定的互补 DNA 用于 dPCR。

首先，在冰上解冻逆转录试剂盒。然后将酶和引物向下旋转。接下来，按照文本方案中的说明准备预混液。

在 96 孔板的每个孔中混合 10 μL 预混液和 5 μL 提取的 RNA。然后将板在 2， 000xg 和 4 摄氏度下离心 2 分钟。按照文本协议中的详细说明进行逆转录。

首先，在冰上解冻市售的 dPCR 混合物、cDNA 和 PCR 引物，并在使用前立即离心。然后按照文本方案中的说明准备预混液。将 1.33 微升体积的逆转录产物添加到 18.67 微升体积的预混液中，并短暂离心。

使用移液管，将 20 微升样品转移到 8 孔盒的中等行的每个孔中。然后将 70 微升液滴生成油移入盒的油井中。接下来，在暗盒顶部放置垫圈并将其放入液滴发生器中。

关闭液滴发生器并等待三个指示灯呈绿色常亮。使用移液管，小心地将 40 μL 液滴状样品转移到 96 孔板的单独孔中。然后用 180 摄氏度的 dPCR 箔密封板 4 秒钟。

将密封的 PCR 板放入循环仪中，并按照文本实验步骤中概述的循环说明进行作。从热循环仪中取出板并将其转移到板架的底座上。然后将板支架的顶部放在 PCR 板上。

最后，启动市售 dPCR 软件。在该方案中，数字 PCR 用于定量心血管疾病患者血清中的 microRNA。从经皮介入前、经皮干预后 8 小时和之后 16 小时的 16 例患者身上采集样本。

与稳定冠状动脉疾病患者相比，ST 段抬高型心肌梗死患者的 miR-499 水平显著增加。一旦掌握，如果作正确，该技术可以在大约一个小时内完成，以形成 96 个样品的液滴。在尝试此过程时，请务必记住小心处理飞沫。

观看此视频后，您应该对如何通过正确的液滴形成、循环、读取和分析来正确进行数字 PCR。