数字PCR用于急性心肌梗死和心血管疾病中循环微小RNA的定量分析
2018年7月3日
循环microRNA作为心血管疾病和急性心肌梗死的生物标志物已展现出良好的应用前景。在本研究中，我们描述了一种用于从心血管疾病患者血清中提取miRNA、逆转录及数字PCR的实验方案，以实现对miRNA的绝对定量。
该方法可能有助于回答诊断领域中的关键问题，例如微小RNA（micro RNA）是否可作为心血管疾病的可靠生物标志物。与定量实时PCR相比，数字PCR在循环微小RNA的定量方面表现出更优的技术性能。由于样本被分割为约20,000个微滴，因此无需进行重复检测，也无需标准曲线即可实现定量。
尽管该方法可能为心血管疾病患者中microRNA的定量提供见解，但由于其他microRNA在癌症进展中也显示出作为生物标志物的潜力，因此该方法也可应用于肿瘤学患者。通常，初次接触该方法的研究者可能会遇到困难，因为生成的液滴较为脆弱，需要小心操作。从血清样本中分离RNA后，应继续进行逆转录，以获得更稳定的互补DNA用于数字PCR（dPCR）。
首先，将反转录试剂盒置于冰上解冻。然后离心收集酶和引物。接下来，按照文本方案中的描述配制预混液。
在96孔板的每个孔中，将10微升主混合液与5微升提取的RNA混合。然后在4°C下以2,000×g离心2分钟。随后按照文本方案中详述的步骤进行逆转录。
首先，将商用数字PCR混合液、cDNA和PCR引物置于冰上解冻，并在使用前立即离心。然后按照文本方案中所述配制主混合液。将1.33 µL逆转录产物加入到18.67 µL主混合液中，短暂离心。
使用移液器将20微升样品转移至八孔盒中间一排的每个孔中。然后向盒中的油孔加入70微升液滴生成油。接着，将密封垫放在盒的上方，并将其放入液滴生成仪中。
关闭液滴生成仪，等待三个指示灯均变为稳定的绿色。使用移液器，小心地将40微升液滴形成的样品转移至96孔板的不同孔中。然后在180摄氏度下用dPCR封板膜密封4秒。
将密封的 PCR 板放入 PCR 仪中，并按照文本方案中所述的扩增程序进行操作。从热循环仪中取出 PCR 板，转移至板架底座上，然后将板架的上盖盖在 PCR 板上。
最后，启动商用数字PCR软件。在本方案中，采用数字PCR对心血管疾病患者血清中的微小RNA进行定量分析。样本采集自16名患者，分别在经皮介入治疗前、术后8小时及术后16小时采集。
与稳定型冠心病患者相比，ST段抬高型心肌梗死患者的miR-499水平显著升高。一旦掌握该技术，若操作正确，可在约1小时内完成96个样本的液滴生成。在进行该操作时，需注意小心处理液滴。
观看本视频后，您应能够充分理解如何正确进行数字 PCR，包括正确的液滴生成、扩增循环、读取和数据分析。
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概述
本研究介绍了一种提取和定量循环微小RNA（miRNA）的实验方案，该miRNA可作为心血管疾病的潜在生物标志物。通过使用数字PCR技术，该方法旨在提高对心血管疾病患者血清样本中miRNA定量的准确性。
关键研究组成部分
科学领域
- 心血管疾病
- 生物标志物
- 微小RNA分析
背景
- microRNA 是参与基因调控的小型非编码 RNA。
- 它们已成为包括心血管疾病在内的多种疾病的潜在生物标志物。
- 与传统方法相比，数字 PCR 在 microRNA 定量方面具有优势。
- 了解 microRNA 表达谱有助于心血管疾病的诊断和管理。
研究目的
- 验证微小RNA作为心血管疾病生物标志物的有效性。
- 证明数字PCR在定量循环miRNA中的有效性。
- 为该领域研究人员提供可靠的实验方案。
使用的方法
- 从血清样本中提取miRNA。
- 逆转录合成互补DNA。
- 采用数字PCR对miRNA进行绝对定量。
- 数字PCR与实时定量PCR的比较。
主要结果
- 数字PCR在miRNA定量中表现出更高的准确性。
- 该方法可对数千个微滴进行分析，无需标准曲线。
- 该方法的潜在应用范围不仅限于心血管疾病，还可扩展至癌症等其他疾病。
- 对于该技术的新使用者而言，处理脆弱微滴存在操作上的挑战。
结论
- 该研究支持将循环microRNA用作心血管疾病的生物标志物。
- 数字PCR是实现miRNA精确定量的有力工具。
- 未来的研究可进一步拓展该方法在其他疾病中的应用。
常见问题
行业重要性概述
利用数字PCR定量循环microRNA为心血管疾病研究中的生物标志物验证提供了一种可重复且高灵敏度的方法。该方法通过实现无需标准曲线的绝对定量，支持靶点验证和检测开发，从而降低多中心研究中的变异性。该技术通过将miRNA表达与病理学关联，提高了早期发现阶段的预测可信度，有助于在治疗假设验证中做出继续或终止决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过定量急性心肌梗死（AMI）中疾病特异性的miRNA（如miR-499），实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：无需标准曲线即可提供miRNA的绝对拷贝数，提升多中心研究的可重复性。
- 预测价值：通过将miRNA水平与心血管病理关联，支持以生物标志物为导向的研发管线筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成经过验证的生物系统（来自血清RNA的cDNA），用于下游筛选工作流程。
- 操作价值：提供高线性度和低变异性的输出结果，适用于检测标准化。
- 可扩展性：掌握后可在约一小时内处理96个样本，支持中等通量筛选。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过与疾病相关的血清生物标志物，将发现阶段的miRNA定量与临床前验证相连接。
- 机制去风险化：通过将miRNA表达与心血管损伤相关联，降低靶点验证中的不确定性。
- 生物标志物一致性：通过定量具有高组织和疾病特异性的miRNA，支持转化型生物标志物的开发。
流程与工作流整合
该方法适用于从假设验证到先导物鉴定的整个发现流程，可提供定量的miRNA数据，用于评估靶点可信度和检测准备情况。
- 发现生物学：通过定量心血管细胞向循环系统释放的miRNA，支持假设验证。
- 筛选：生成可直接用于检测的标准化结果，具有高灵敏度，可用于评估生物标志物候选分子。
- 分析：通过绝对定量（无需标准曲线）实现不同条件下miRNA水平的直接比较。
- 转化研究：通过将循环miRNA谱与心血管病理关联，推动生物标志物的连续性研究。
- 企业级复用：建立可重复使用的定量平台，适用于心血管疾病和肿瘤学等多种适应症。
运营与企业影响
- 科学价值：通过低变异性、高灵敏度的miRNA定量，提高生物标志物有效性的预测置信度。
- 操作价值：利用基于液滴的分区技术消除重复测量，确保实验的可重复性与标准化。
- 战略价值：减少生物标志物与靶点之间关系的机制模糊性，从而优化决策流程中的“推进/终止”判断。
- 项目组合影响：通过定量的、与病理特征关联的miRNA数据，实现基于风险评估的推进策略。
实施注意事项
- 需要具备RNA提取、逆转录和液滴操作方面的专业知识，以防止样品损失。
- 需要液滴生成设备、PCR扩增仪和数字PCR软件以实现准确定量。
- 要求跨团队在液滴生成和封合操作流程上进行标准化，以确保结果的可重复性。
- 在将该方法应用于血清以外的其他样本类型（如血浆或组织裂解液）时，需考虑适应性调整。
- 存在实际操作限制，例如液滴较为脆弱，可能影响无经验操作者的通量表现。
