Name: 电化学发光免疫法测定血清心肌肌球蛋白结合蛋白-C敏感而特异的定量方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习使用电化学发光免疫法同时定量检测血清中心肌肌球蛋白结合蛋白C和心肌肌钙蛋白I。该方法具有高灵敏度和特异性，可用于心肌梗死患者的临床诊断与生物标志物分析。

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本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为 R01HL105826 和 K02HL114749（Sadayappan 博士），以及美国心脏协会中西部博士后奖学金：11PRE7240022（Barefield 先生）和 13POST14720024（Govindan 博士）。作者衷心感谢 Jimmy Page 博士、Jill Clampit 和 MSD 的 John Hudson 博士在建立检测方法过程中提供的出色技术与文献支持。

1. 单重 cMyBP-C 检测
<ol>
	<li>实验前一天，用捕获抗体包被96孔MSD裸标准板。对于cMyBP-C，使用30 μl小鼠单克隆抗cMyBP-C抗体（无明胶）溶液，以5 μg/ml的浓度用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后进行包被。</li>
	<li>由于孔壁具有疏水性，应将溶液移液至孔的底部角落，然后轻敲板子的侧边，使溶液覆盖整个孔表面。</li>
	<li>用板封膜封板后，在4 °C下避光孵育过夜（O/N），不振荡。</li>
	<li>通过将板倒置在水槽上方轻敲，去除捕获抗体溶液，随后在纸巾堆上轻拍以吸干残留液体。每孔加入150 μl含5%（w/v）阻断剂A（高纯度BSA）的PBS溶液，以封闭板上的非特异性结合位点。</li>
	<li>封板后，在室温（RT）下以700 rpm振荡孵育1小时。</li>
	<li>在封闭的同时，准备标准品和样品。将重组cMyBP-C蛋白片段（氨基酸1–271）用含1%（w/v）阻断剂A的PBS溶液稀释至起始浓度2,000 ng/ml，作为标准品起始液；然后在含1%（w/v）阻断剂A的PBS中按5倍系列稀释。共使用7个标准品浓度加1个空白对照（仅含1%（w/v）阻断剂A/PBS）。</li>
	<li>去除封闭液后，每孔用150 μl含0.05%（v/v）Tween-20的PBS洗板3次。每次洗板时，将板倒置在水槽上方倾去洗涤液。第三次洗涤后，用力在水槽上方甩板，并在纸巾层上用力拍打直至完全干燥。此步骤至关重要，因后续孵育体积较小，残留洗涤液会显著稀释下一孵育步骤的试剂。</li>
	<li>向各孔中加入25 μl标准品或样品溶液，封板后在室温下以700 rpm振荡孵育1小时。</li>
	<li>将检测抗体溶液用含1%阻断剂A的PBS稀释至1 μg/ml后使用。检测抗体为定制的cMyBP-C抗体（表位为氨基酸2–14），已标记MSD SULFO-TAG。MSD提供SULFO-TAG标记试剂盒，可方便地对任意抗体进行标记。</li>
	<li>重复步骤1.4中所述的洗涤步骤。</li>
	<li>每孔加入25 μl检测抗体溶液，封板后在设定为700 rpm的板式振荡器上室温孵育1小时。</li>
	<li>在孵育期间，运行MSD提供的演示板（带LED灯的板）以确认Sector Imager及软件功能正常（参见试剂部分）。同时，将MSD提供的读板缓冲液按1:4稀释：将5 ml 4x读板缓冲液加入15 ml去离子水中。</li>
	<li>重复步骤1.4中所述的洗涤步骤。</li>
	<li>使用多通道移液器向每孔加入150 μl读板缓冲液。注意避免产生气泡（反向移液是一种合适的方法）。加入读板缓冲液后，立即在Sector Imager中扫描该板。</li>
</ol>
2. 三重 cMyBP-C、CK-MB 和 cTnI 检测
<ol>
	<li>使用前，将96孔3重检测板和稀释液在室温下平衡至室温。该板由MSD预先包被针对cMyBP-C、CK-MB和cTnI的捕获抗体。</li>
	<li>向每孔中加入25 μl的1%（w/v）阻断剂A/PBS。轻敲板的侧面，确保溶液完全覆盖整个孔壁。</li>
	<li>用封板膜密封板孔，将板置于板式振荡器上，以700 rpm振荡30分钟。</li>
	<li>在此期间，准备各校准品的系列稀释液。由于每孔含有三种捕获抗体，因此在使用前需将三种校准品混合并进行连续稀释。将重组cMyBP-C、CK-MB（MSD）和cTnI（MSD）共同溶于1%（w/v）阻断剂A/PBS中，配制成含2,000 ng/ml cMyBP-C、100 ng/ml CK-MB和25 ng/ml cTnI的混合样品（样品A）。</li>
	<li>每个标准品至少准备100 μl的终体积。为完成标准曲线系列，以5倍比例对样品进行连续稀释。取25 μl样品A加入100 μl 1%（w/v）阻断剂A/PBS中制备样品B；再取25 μl样品B加入100 μl 1%（w/v）阻断剂A/PBS中制备样品C，依此类推。本研究使用了来自16名心肌梗死患者和16名对照个体的人血清样本，用于检测cMyBP-C、CK-MB和cTnI水平。这些样本以1%（w/v）阻断剂A/PBS进行2倍稀释。</li>
	<li>向3重检测板各孔中已存在的25 μl溶液中加入25 μl标准品或稀释后的样本。务必同时设置空白对照孔（仅含稀释液）。为建立检测方法，样本应设置技术重复三份；其他情况下，重复两份已足够。</li>
	<li>再次密封板孔（封板膜可重复使用），在室温下置于板式振荡器上以700 rpm孵育2小时。</li>
	<li>在孵育即将结束前，准备检测抗体溶液。所用稀释液为含1%（w/v）阻断剂A的PBS。将三种SULFO标记的检测抗体共同稀释至每种终浓度为1 μg/ml。检测抗体通常以50倍浓缩液形式提供。</li>
	<li>对于完整的96孔板，共需2,700 μl稀释后的检测抗体溶液（包含移液误差）。将每种检测抗体各54 μl加入2,538 μl 1%（w/v）阻断剂A/PBS中。</li>
	<li>孵育2小时后，在水槽上方用力甩动板以去除孔内液体。用含0.05% Tween-20的PBS洗板3次，每次150 μl。使用多通道移液器向每孔加入25 μl检测抗体溶液，并轻敲板的侧面，确保溶液完全覆盖整个孔壁。</li>
	<li>密封板孔，在700 rpm振荡条件下孵育1小时。</li>
	<li>在孵育期间，运行MSD的演示板（带LED灯的板）以确认Sector成像仪及软件功能正常。同时，将MSD提供的读板缓冲液进行稀释：将5 ml 4倍浓缩读板缓冲液加入15 ml蒸馏水中。</li>
	<li>重复步骤2.8中所述的洗涤步骤。</li>
	<li>使用多通道移液器向每孔加入150 μl读板缓冲液。避免产生气泡至关重要（反向移液是一种合适的方法）。加入读板缓冲液后，立即在Sector成像仪中扫描该板。</li>
</ol>

<ol><li>Thygesen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third+universal+definition+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Third universal definition of myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).</li>
<li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).</li>
<li>Thompson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+electrochemiluminescence+wash+and+no-wash+immunoassays+for+detection+of+serum+antibodies+to+smooth+Brucella+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains.</a> Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).</li>
<li>Kingsmore, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+measurement%3A+technologies+and+applications+of+protein+and+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).</li>
<li>Altan, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-acting+tumor+necrosis+factor+alpha-binding+protein+demonstrates+activity+in+both+in+vitro+and+in+vivo+models+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).</li>
<li>Patel, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+cytokine+detection+in+acute+coronary+syndrome+reveals+up-regulation+of+interferon+gamma+and+interleukin-10+post+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction.</a> Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).</li>
<li>Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiplex+immunoassay+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiplex immunoassay platforms.</a> Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).</li>
<li>Mahajan, V. S., Jarolim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+interpret+elevated+cardiac+troponin+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">How to interpret elevated cardiac troponin levels.</a> Circulation. 124, 2350-2354 (2011).</li>
<li>Govindan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myosin+binding+protein-C+is+a+potential+diagnostic+biomarker+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).</li>
<li>Barefield, D., Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+and+function+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).</li>
<li>Kuster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myosin+binding+protein+C+phosphorylation+in+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).</li>
<li>Sadayappan, S., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myosin+binding+protein-C%3A+redefining+its+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function.</a> Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).</li>
<li>Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myosin+binding+protein-C%3A+a+potential+early-stage%2C+cardiac-specific+biomarker+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury.</a> Biomark Med. 6, 69-72 (2012).</li>
<li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid%3A+a+multicenter+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li>
<li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li>
</ol>

一项完整的专利申请正在审理中（申请序列号 13/464,466，公开号 US 2012/0282618 A1，日期：2012年5月4日），用于确定与cMyBP-C降解及其释放到人体体液中相关的风险因素，并定量检测人体体液中cMyBP-C的水平。

在本研究中，我们展示了多重免疫分析法在检测患者血清中多种心脏生物标志物方面的适用性。该技术相较于传统的ELISA具有多项优势。首先，试剂盒采用电化学发光（ECL）而非比色法进行检测。在ECL中，电信号刺激局部产生待测信号（光），从而将刺激事件与信号读出分离，降低了背景干扰14。因此可实现高灵敏度，如表2所示。
多重检测该指标不会导致cMyBP-C检测灵敏度的下降，这一点可以从图2和表2中看出。单重检测所测得的cMyBP-C灵敏度和检测范围与同时检测CK-MB和cTnI13时测得的cMyBP-C相当。同时检测可显著减少检测所需的样本体积，在处理稀有生物样本时这一点尤为关键，同时也减少了运行多个单重检测所需的时间。
与任何免疫测定一样，该检测结果高度依赖于所用抗体的质量。捕获抗体和检测抗体的亲和力、特异性和亲合力是决定检测灵敏度的主要因素15。应尝试不同的抗体组合，...

在临床患者管理和基础科学研究中，对血清等复杂生物样本中微量蛋白质的检测正变得越来越重要。例如，在临床环境中，血清中心脏生物标志物（如肌钙蛋白I）水平的升高与急性心肌梗死（MI）相符1。为了检测血清样本中的蛋白质，标准的酶联免疫吸附测定法（ELISA）是最常用的技术，因其具有高灵敏度，并可实现对分析物的绝对定量。然而，传统的ELISA需要相对较多的样本量（通常为100 μl），在某些生物液体中背景信号较高，且每次ELISA仅能检测一种分析物2。	
最近，一种新的免疫测定技术被引入，可克服上述诸多缺点。这种由MSD开发的改良检测方法采用电化学发光（ECL）进行信号检测，具有极低的背景信号和更高的灵敏度，因而能够使用极小的样本体积。电化学发光基于报告分子三联吡啶钌（II），该分子被标记在检测抗体上。当对96孔板底部施加电刺激时，该报告分子在620 nm处发出光信号，而孔板底部集成了碳电极3。此外，通过点阵包被技术，可在同一孔内包被多种捕获抗体（在96孔板上最多可达10种），从而实现单个样本中多种蛋白质的同步定量4。该技术最近已被用于检测血清中的促炎性细胞因子谱5,6。MSD的多重检测板与其他多重检测平台相比具有显著优势7。
以MSD作为主要检测平台，我们进一步开发了一种定制的三重检测板，可同时定量心脏肌球蛋白结合蛋白C（cMyBP-C）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）和心脏肌钙蛋白I（cTnI）的水平，并将结果与cMyBP-C的单重检测进行比较。CK-MB和cTnI是心肌梗死（MI）公认的生物标志物。然而，这些生物标志物的升高也可能由非MI的其他病理状况引起，例如心肌炎或肾功能衰竭8。这提示有必要增加额外的生物标志物以提高MI诊断的特异性。我们近期已证实cMyBP-C也是MI的潜在生物标志物9。cMyBP-C是一种与粗肌丝相关的蛋白，在心脏中表达10-12，但在骨骼肌或平滑肌中不表达。因此，循环系统中cMyBP-C水平的升高是心肌损伤的特异性指标13。
在本研究中，我们比较了单重检测cMyBP-C与使用定制的三重检测法对MI患者血清中cMyBP-C、CK-MB和cTnI水平的测定。未来，该特征性技术或可用于急诊室中以胸痛就诊的患者诊断心肌梗死（MI）。
芝加哥洛约拉大学的机构审查委员会（IRB）批准了本研究使用去标识的人类样本及免疫测定方法（LU# 20392）。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>含表面活性剂的MSD Read-Buffer T (4X)</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>R92TC-2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Acros</td><td>9005-64-5</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MSD Blocker A</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>R93BA-1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，10X</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399-4</td><td>使用前过滤</td></tr><tr><td>肌球蛋白结合蛋白C抗体，小鼠单克隆（E7），无明胶</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-137180L</td><td>用于包被时，抗体必须不含明胶</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;耗材与设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Multi-Array 96孔标准板</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>L15XA-3</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>一种原型3重检测、四点式96孔板，含cMyBP-C、cTnI和CK-MB</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>N452A-1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ThermaSeal封板膜</td><td>Life Science Products Inc.</td><td>ST-3098</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MSD SECTOR Imager 2400A</td><td>Meso Scale Discovery</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MTS 2/4数字微孔板振荡器</td><td>IKA</td><td>3208001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

一种通过电化学发光免疫分析法测定血清心脏肌球蛋白结合蛋白-c的高灵敏度和高特异性定量方法

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

生物标志物在临床决策和基础科学研究中正变得越来越重要。心肌梗死（MI）的诊断主要依赖于检测患者血清或血浆中的心肌特异性蛋白，以作为心肌损伤的指标。我们近期已证实，心肌肌球蛋白结合蛋白-C（cMyBP-C）在心肌梗死后可在血清中被检测到，因此我们提出其作为心肌梗死的潜在生物标志物。生物标志物的检测通常采用传统的夹心法酶联免疫吸附测定（ELISA）。然而，该技术需要较大的样本量，动态范围较小，且每次只能检测一种蛋白质。	
本文展示了一种多重免疫测定方法，可同时高灵敏度地检测三种心脏蛋白。单独检测cMyBP-C，或与肌酸激酶同工酶MB及心肌肌钙蛋白I联合检测，均表现出相当的灵敏度。该技术结合了Meso Scale Discovery（MSD）的96孔板多重检测平台与电化学发光检测法。该方法仅需少量样本体积，即可实现高灵敏度和宽动态范围。利用该技术，我们检测了16名心肌梗死（MI）患者血清样本中cMyBP-C、肌酸激酶同工酶MB和心肌肌钙蛋白I的水平，并与16名对照受试者的结果进行了比较。我们能够在这些样本中成功检测到全部三种标志物，并发现三种生物标志物在心肌梗死后均升高。因此，该技术适用于血清样本中心脏生物标志物的高灵敏度检测。

3重检测的基本原理和工作流程如图1所示，整体工作流程在表1中进行了描述。单重检测的工作原理与此相同，唯一的区别是整个孔底仅包被一种捕获抗体。信号检测通过电化学发光（ECL）实现，即在孔底部施加电信号，从而引发读取缓冲液与检测抗体上的SULFO-TAG标记发生化学反应，局部产生光信号。这一机制使该检测方法具有背景信号低、灵敏度高的特点。在图2中，比较了单重检测与3重检测中cMyBP-C的标准曲线。两种检测方法均表现出极高的灵敏度和宽广的动态检测范围。检测限和定量限见表2，在单重和3重检测中具有可比性。cTnI和CK-MB的检测水平也显示在图3和表2中。通过两名不同操作人员对相同样本（n = 2，每个样本3次技术重复）进行检测，评估了操作者间的变异，结果表明变异程度较低（CV为8.5%）。通过将三种校准品各自的单个标准曲线分别与单一检测抗体孵育，研究了检测抗体与其他两种校准品之间的交叉反应性（图4）。结果显...

在复杂的生物样本中检测生物标志物正日益指导临床决策。本文介绍一种高灵敏度的方法，可同时检测心肌梗死患者和健康对照者血清样本中的心肌肌球蛋白结合蛋白-C、肌酸激酶同工酶MB以及心肌肌钙蛋白I。

一种通过电化学发光免疫分析法测定血清心脏肌球蛋白结合蛋白-C的高灵敏度和高特异性定量方法

生物标志物在临床决策以及基础科学研究中正变得越来越重要。诊断心肌梗死（MI）是……

本实验的总体目标是同时定量血清样本中的心肌肌球蛋白结合蛋白 C 和心肌肌钙蛋白 I。首先，使用心肌肌球蛋白结合蛋白 C 抗体包被 96 孔板以进行单重检测，或采用预编码的三重检测方法。第二步中，将包被好的酶标板与校准品和血清样本共同孵育。最后一步加入标记的检测抗体，产生化学发光信号，由酶标仪检测。最终，可通过单重或多重免疫测定法确定血清样本中心脏蛋白的含量。实验前一天，将30微升不含明胶的小鼠单克隆抗心肌肌球蛋白结合蛋白C抗体用移液器加入96孔微尺度发现裸标准板每个孔的底部角落。然后轻敲平板边缘，使抗体溶液均匀覆盖每个孔的底部。密封后，在4°C下静置孵育过夜，不摇动。次日早晨，将溶液在水槽上方倒出，随后倾倒于一叠纸巾上。然后每孔加入150微升含1% blocker A的PBS溶液，以阻断非特异性结合。将酶标板密封，在室温下以700转/分钟振荡孵育1小时进行封闭。在此期间，将重组心肌肌球蛋白结合蛋白C片段用含1% blocker A的PBS溶液稀释至起始浓度为2000纳克/毫升，随后以此溶液为起始，按5倍比进行连续稀释，共制备7个标准品。现在按照刚刚演示的方法移除封闭液，然后用150微升含0.05%吐温20的PBS溶液洗涤平板三次。第三次洗涤后，用力在水槽上方甩动平板，随后将平板牢固地轻拍在一层纸巾上，直至完全干燥。接着，将每种标准品和样品各25微升加入相应的孔中。然后，在密封板于室温下在摇床上孵育一小时的同时，将自制的、用磺基罗丹明标记的心肌肌球蛋白结合蛋白C检测抗体用含1%阻断剂A的PBS稀释至1微克/毫升。按照前述方法仔细洗涤平板后，向每孔加入25微升检测抗体溶液，随后将密封板在室温下振荡孵育一小时；在孵育期间，运行带有LED灯的示教板，以确保sector成像仪及软件功能正常，同时稀释Reid缓冲液。按照之前所述方法仔细洗涤平板后，使用多通道移液器向每孔加入150微升Reid缓冲液，注意避免产生气泡，然后立即在sector成像仪中扫描平板，再开始三重检测实验。将96孔三重检测板和稀释液在室温下平衡。然后向板中加入25微升含1% blocker A的PBS溶液，确保溶液完全覆盖每个孔，并将密封的板在室温下振荡孵育30分钟。在此期间，将重组心肌肌球蛋白结合蛋白C、CK-MB和心肌肌钙蛋白I共同用含1% blocker A的PBS溶液稀释，配制标准品，其中包含2000纳克/毫升的心肌肌球蛋白结合蛋白C、100纳克/毫升的CK-MB和25纳克/毫升的心肌肌钙蛋白I。随后，将此混合物进行五倍系列稀释，每份标准品稀释后的终体积至少为100微升；将稀释后的标准品用含1% blocker A的PBS溶液稀释两倍。接下来，取2份25微升的技术重复样，包括标准品和待测样本，加入到三重检测板各孔中已含25微升封闭缓冲液的孔内，并设置仅含稀释液的空白对照孔。将密封后的酶标板在振荡条件下孵育两小时后，将三种SUL oag检测抗体共同稀释至每种抗体终浓度为1微克/毫升，稀释液为含1% blocker A的PBS溶液。按照前述方法洗涤酶标板，然后使用多通道移液器向每个孔中加入25微升检测抗体溶液。将密封的酶标板在孵育期间以 700 RPM 振荡，充分孵育一小时。运行示范板，并按照刚刚演示的方法稀释 Reid 缓冲液。然后用含 0.05% Tween 20 的 PBS 洗涤酶标板，使用多通道移液器向每孔加入 150 µL Reid 缓冲液，避免产生气泡，并立即在 Sector 成像仪中扫描酶标板。在此图中，对比了单重检测法与三重检测法中心肌肌球蛋白结合蛋白 C 的标准曲线。两种检测方法均表现出极高的灵敏度和宽广的动态范围。检测范围以灰色区域表示，适用于单重和三重检测法。心肌肌球蛋白结合蛋白C的标准曲线相似。在二联和三联检测中，其检测下限、定量下限和定量上限水平均具有可比性。这些图表显示了三联检测板中心肌肌钙蛋白I和CKMB的标准曲线。两种校准品均表现出高灵敏度和宽动态范围。检测区域在图中以灰色显示。通过将三种校准品各自的单个标准曲线分别与单一检测抗体孵育，研究了检测抗体与其他两种校准品之间的交叉反应性；结果显示，CKMB校准品与心肌肌钙蛋白I及心肌肌球蛋白结合蛋白C的检测抗体之间仅存在少量交叉反应性。尽管作为该检测方法适用于心脏损伤检测的证据，其他校准品与检测抗体之间未观察到交叉反应性，但仍通过三重检测板比较了16名心肌梗死患者的血清水平与对照组。测定了心脏肌球蛋白结合蛋白C-C-K-M-B和心脏肌钙蛋白I的血清水平。与对照组相比，心肌梗死患者的这三种生物标志物水平均升高。

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电化学发光免疫法测定血清心肌肌球蛋白结合蛋白-C敏感而特异的定量方法

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本文介绍了使用电化学发光（ECL）检测法检测人胰岛自身抗体的方法。该方案可用于预测1型糖尿病，也可拓展用于检测其他自身免疫性疾病的自身抗体。...

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使用竞争性酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测固体组织中的环磷酸鸟苷（cGMP）

学习使用电化学发光免疫法同时定量检测血清中心肌肌球蛋白结合蛋白C和心肌肌钙蛋白I。该方法具有高灵敏度和特异性，可用于心肌梗死患者的临床诊断与生物标志物分析。

一种通过电化学发光免疫分析法测定血清心脏肌球蛋白结合蛋白-C的高灵敏度和高特异性定量方法

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