电化学发光免疫法测定血清心肌肌球蛋白结合蛋白-C敏感而特异的定量方法
August 8th, 2013
测量越来越复杂的生物样品中的生物标志物指导临床决策。我们描述一个高度敏感的方法同时测量心肌肌球蛋白结合蛋白C，肌酸激酶MB，心肌肌钙蛋白I与心肌梗死和健康对照组受试者的血清样本。
该程序的总体目标是同时定量血清样品中的心肌肌球蛋白结合蛋白 C 和心肌肌钙蛋白 I。这是通过首先用心肌肌球蛋白结合蛋白 C 抗体包被 96 孔板进行多重检测，或使用预先编码的三重检测来实现的。在第二步中，将包被板与校准品和血清样品一起孵育。
接下来，在最后一步添加标记的检测抗体，产生化学发光信号，由读板器检测。最终，血清样品中存在的目标心脏蛋白水平可以通过单一或多重免疫测定来确定。实验前一天，将 30 微升无明胶小鼠单克隆抗心肌肌球蛋白结合蛋白 C 抗体移液到 96 孔味噌规模发现裸标准板的每个孔的底角中。
然后轻敲板的侧面，将抗体溶液涂抹在每个孔的底部。密封后，将板在 4 摄氏度下孵育过夜，不要摇晃。第二天早上，将溶液在水槽上敲出，然后倒在一堆纸巾上。
然后向每个孔中加入 150 μL 的 1% 阻断剂 A 的 PBS 溶液，以阻断非特异性结合。在封闭步骤中，将密封板在室温下孵育 1 小时，同时以 700 RPM 摇动，在 PBS 中的 1% 阻断剂 A 中将重组心肌肌球蛋白结合蛋白 C 片段稀释至 2000 ng/mL 的起始浓度。然后将该溶液连续稀释 5 倍，共得 7 个标准品。
现在如刚才所示去除封闭溶液，然后用 150 微升 0.05%吐温 20 的 PBS 溶液洗涤板 3 次。第三次洗涤后，在水槽上用力弹盘子，然后用力拍打盘子在一层纸巾上，直到它完全干燥。接下来，将每种标准品和样品移液 25 μL 放入适当的孔中。
然后，当密封板在摇床上室温孵育 1 小时时，在 PBS 中的 1% 阻滞剂 A 中将用 sul oag 标记的定制心肌肌球蛋白结合蛋白 C 检测抗体稀释至 1 μg/mL。如刚才所示仔细洗涤板后，向每个孔中加入 25 微升检测抗体溶液，然后在室温下将密封板孵育 1 小时，同时在孵育期间摇动，用 LED 灯运行演示板，以确保扇形成像仪和软件的正常工作此时也稀释 Reid 缓冲液。如前所述仔细清洗板后，使用多通道移液器向每个孔中加入 150 微升 Reid 缓冲液，注意避免气泡，然后在开始三重检测之前立即在扇形成像仪中扫描板。
让 96 孔三重板和稀释剂溶液平衡至室温。然后向板中加入 25 微升 1% 阻断剂 A 的 PBS 溶液，确保整个孔被溶液覆盖，并在室温下摇动密封板孵育 30 分钟。同时，将重组心肌肌球蛋白结合蛋白 C-C-K-M-B 和心肌肌钙蛋白 I 一起稀释在 PBS 中的 1% 阻滞剂 A 中，制成含有 2000 ng/mL 心肌肌球蛋白结合蛋白 C、100 ng/mL/mL CKMB 和 25 ng/mL 心肌肌钙蛋白
的标准品。然后，我将该混合物连续稀释 5 倍，每个标准稀释样品的最终体积至少为 100 微升，用 1% 阻断剂 A 的 PBS 溶液稀释两次。接下来，将 2 个 25 微升标准品和样品的技术重复物添加到三个重板孔中已经存在的 25 微升封闭缓冲液中，仅在摇动密封板后加入稀释剂空白，两小时后在 1% 溶液阻滞剂 A 和 PBS 中将三种 SUL oag 检测抗体一起稀释至每毫升 1 微克/毫升的最终浓度。如刚才所示洗涤板，然后使用多通道移液器向每个板中加入 25 μL 检测抗体溶液。
将密封板孵育 1 小时，同时在孵育期间以 700 RPM 振荡。运行演示板并稀释 Reid 缓冲液，如刚才所示。然后在 PBS 中用 0.05%吐温 20 洗涤板后，使用多通道移液器向每个孔中加入 150 微升 Reid 缓冲液，避免气泡，并立即在扇形成像仪中扫描板。
在该图中，将 plex 测定中心肌肌球蛋白结合蛋白 C 的标准曲线与 3 重测定中心肌肌球蛋白结合蛋白 C 的标准曲线进行了比较。两种分析均显示出非常高的灵敏度和高动态范围。检测的检测区域以灰色、plex 和 3 plex 显示。
心肌肌球蛋白结合蛋白 C 标准曲线相似。多重和三重检测的检测下限、定量下限和定量水平上限相当。这些图表显示了三重板的心肌肌钙蛋白 I 和 CKMB 标准曲线。
两种校准品均表现出高灵敏度和大动态范围。检测的检测区域显示为灰色。通过将所有三种校准品的单个标准曲线与单一检测抗体一起孵育来研究检测抗体与其他两种校准品的交叉反应性，CKMB 校准品与心肌肌钙蛋白 I 和心肌肌球蛋白结合蛋白 C 检测抗体之间仅观察到少量交叉反应性。
虽然在校准品和检测抗体之间没有观察到交叉反应性，证明该测定法适用于检测心脏损伤，但使用心肌肌球蛋白结合蛋白 C-C-K-M-B 和心肌肌钙蛋白的三个重板血清水平将 16 名心肌梗死受试者的血清水平与对照组进行了比较。我确定与对照组相比，心肌梗死患者的所有三种生物标志物均增加。
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概述
本文介绍了一种用于同时测量血清样本中心脏生物标志物的敏感方法。重点关注心肌肌球蛋白结合蛋白-C、肌酸激酶MB和心脏肌钙蛋白I，特别是在心肌梗死的背景下。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏病学
- 生物标志物测量
- 临床诊断
背景
- 生物标志物在临床决策中起着至关重要的作用。
- 测量心脏蛋白质可以帮助诊断心肌梗死。
- 现有的方法可能缺乏敏感性或特异性。
- 本研究旨在改进心脏生物标志物的检测。
研究目的
- 开发一种用于定量心肌肌球蛋白结合蛋白C和心脏肌钙蛋白I的方法。
- 评估患者和健康对照的血清样本中这些蛋白质的水平。
- 提高心肌梗死诊断的准确性。
所用方法
- 用心肌肌球蛋白结合蛋白C抗体涂覆96孔板。
- 使用校准标准和血清样本进行孵育。
- 添加标记的检测抗体以产生化学发光信号。
- 利用单重或多重免疫分析进行分析。
主要结果
- 成功量化血清样本中的心脏生物标志物。
- 证明了检测方法对心肌梗死的灵敏度。
- 比较患者和健康对照之间的生物标志物水平。
- 验证了该方法在临床环境中的有效性。
结论
- 开发的方法为测量心脏生物标志物提供了可靠的方法。
- 它可以显著帮助临床评估心肌梗死。
- 未来的应用可能包括更广泛的临床诊断和研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables sensitive, multiplexed detection of cardiac biomarkers in serum, supporting early and accurate assessment of myocardial injury. By quantifying cMyBP-C alongside CK-MB and cTnI, it improves biomarker panel reliability for target validation in cardiovascular drug development. The electrochemiluminescence platform offers high sensitivity and broad dynamic range with minimal sample volume, facilitating preclinical and translational research workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac injury pathways through simultaneous measurement of multiple biomarkers.
- Operational Value: Reduces sample consumption and assay time by multiplexing three proteins in a single well.
- Predictive Value: Provides quantitative, reproducible readouts that support target confidence and mechanistic de-risking in cardiovascular target validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative biomarker readouts suitable for assay qualification and screening readiness.
- Operational Value: Uses MSD electrochemiluminescence platform compatible with high-throughput 96-well formats.
- Scalability: Enables reproducible standard curve generation across plex and threeplex configurations for consistent compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery biomarker measurement to preclinical validation by detecting MI-induced elevation in cMyBP-C, CK-MB, and cTnI.
- Disease-Relevant System: Uses human serum samples to reflect clinically relevant biomarker dynamics post-MI.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by confirming target engagement and pathway modulation in injury models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling biomarker measurement from early hypothesis testing through lead optimization and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation by quantifying biomarker release in injury models.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs for evaluating compound effects on cardiac injury pathways.
- Analytics: Provides chemiluminescence-based quantitative readouts with defined LLOQ and ULOQ for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by detecting biomarker changes in human serum that mirror clinical MI presentation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunoassay platform for cardiovascular biomarker panels across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence through specific, sensitive detection of cardiac injury biomarkers.
- Operational Value: Ensures standardization, low sample volume requirement, and multiplex capability.
- Strategic Value: Improves biomarker panel reliability, reducing false negatives in target validation assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified advancement by confirming on-target biological activity in injury models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoassay optimization and electrochemiluminescence detection.
- Dependent on MSD sector imager and plate reader infrastructure.
- Necessitates standardized blocking, washing, and incubation protocols across sites.
- Adaptable to other cardiac or non-cardiac biomarkers with antibody pair validation.
- Limited by antibody availability and potential cross-reactivity requiring empirical testing.
