从成年大鼠心脏同时分离高质量心肌细胞，内皮细胞和成纤维细胞

该程序的总体目标是同时从大鼠心脏中分离活的心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞，用于它们的个体体外分析。该方法可以帮助回答心血管领域关于心脏肥大、缺血再灌注损伤、内皮功能和心脏纤维化所涉及的信号机制的关键问题。该技术的主要优点是可以同时分离所有主要的心脏细胞，从而可能减少相关的研究成本和实验动物数量。

冲洗一次蒸馏水和一次 50 毫升 Powell 培养基后，用 80 毫升新鲜的 Powell 培养基更换培养基，并使用玻璃圆筒中的玻璃巴斯德移液管连续灌注培养基。接下来，使用两对细的弯曲镊子通过主动脉将新鲜收获的大鼠心脏安装到 Langendorff 灌注系统上，并将灌注系统套管的末端放在第一主动脉分支和主动脉瓣之间。用鳄鱼夹固定主动脉。

打开套管的瓣膜，然后用手术缝合线固定心脏。让 35 毫升灌注培养基滴入心脏，去除任何残留的血液。将收集漏斗放在心脏下方，然后启动蠕动泵，将灌注培养基从收集漏斗再循环到储液槽。

将胶原酶溶液添加到灌注培养基中，用再循环胶原酶溶液灌注心脏 30 分钟。消化结束时，用剪刀从 Langendorff 系统中取出心脏，并将其放入玻璃培养皿中。现在从心脏中取出心房和任何残留的脂肪组织。

为避免上皮细胞污染，请使用两把镊子小心地剥开心包。从中间切下心脏，然后将两半放入组织切碎机中。将心脏切碎 2 到 3 次，然后将组织块转移到含有 12 毫升来自 Langendorff 灌注的消化缓冲液的 15 毫升锥形管中。

水浴中消化组织碎片 5 到 10 分钟，偶尔用 5 毫升一次性塑料移液管混合。然后通过 100 微米筛将细胞悬液过滤到 50 毫升锥形管中。用至少 1 升蒸馏水冲洗灌注系统，然后用 100 毫升 0.1 正常氢氧化钠冲洗 30 分钟，然后用另外 2 到 3 升蒸馏水冲洗系统，并用冲洗空气干燥设备。

通过离心收集过滤的细胞，并使用一次性移液器小心地将含有上清液的内皮细胞和成纤维细胞转移到新的 50 毫升试管中。将沉淀重悬于 6 毫升钙溶液 1 中。1 分钟后，通过第二次离心收集细胞，并将沉淀重悬于 6 mL 钙溶液 2 中。

1 分钟后，加入 12 毫升钙溶液 3 稀释细胞悬液，轻轻倾斜混合均匀。再次离心后，将沉淀重悬于 20 mL 预热的 CCT 培养基中。然后将 1 毫升细胞分装到 20 个预先包被层粘连蛋白的无菌 35 毫米细胞培养皿中，并将细胞置于无二氧化碳的细胞培养箱中，用 2 毫升新鲜 CCT 培养基替换培养基，以在两小时后去除任何死细胞。

现在离心含有内皮细胞和成纤维细胞的上清液，并将沉淀重悬于 1.5 mL 内皮细胞分离缓冲液中。将细胞转移至 2 mL 样品管中，向细胞中加入小鼠抗大鼠 CD31 抗体，在 4 摄氏度下首端旋转孵育 30 分钟。孵育结束时，加入 Pan 抗小鼠 IGG 微珠，在 4 摄氏度下孵育 20 次，端到端旋转。

磁珠孵育结束时，将细胞置于磁力架中 2 分钟，并使用 1 毫升移液器小心去除大部分含有成纤维细胞的上清液。在含有 10 毫升成纤维细胞培养基的 10 厘米培养皿上观察成纤维细胞，并将细胞置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的细胞培养箱中 1 小时。接下来，向内皮细胞管中加入 1 毫升洗涤缓冲液并盖上管子。

轻轻摇动细胞 4 到 5 次以重悬珠子。然后将试管放回磁力架上，并在 1 分钟后取出洗涤缓冲液。最后一次洗涤后，用 1 毫升 MV2 内皮细胞培养基替换洗涤缓冲液，并将内皮细胞接种到 12 孔板的单个孔中，以便在细胞培养箱中过夜培养。

在成纤维细胞孵育结束时，用适当体积的预热 PBS 洗涤贴壁细胞 2 至 3 次。然后，向细胞中加入预热的新鲜成纤维细胞培养基，并将成纤维细胞放回细胞培养箱中。第二天早上，用新鲜的内皮细胞培养基替换内皮细胞培养物上的上清液，然后将细胞放回培养箱中，每 2 到 3 天更换一次培养基，直到半汇合。

然后，如刚才所示，用新鲜的预热 PBS 洗涤附着的成纤维细胞的培养物，并用新鲜的预热培养基喂养细胞。心肌细胞分离程序产生 70% 至 80% 纯度、活的杆状横纹心肌细胞群。然后可以对载有 fura AM 的分离心肌细胞进行细胞内钙振荡分析，以响应心肌细胞中的缺血再利用，以及分析加入 ATP 后磁珠分离的内皮细胞和成纤维细胞中钙信号的变化。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三个小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住正确设置此灌注系统，并在准备好后立即将心脏固定在系统中。经过开发，这项技术为心血管研究领域的研究人员探索不同心血管病理生理学所涉及的信号传导铺平了道路。

看完这个视频，你应该对心脏细胞分离和培养的基本原理有了很好的了解。不要忘记，使用手术器械和细胞培养试剂可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如小心使用器械和使用手套。