从成年大鼠心脏中同时分离高质量心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞

本实验的总体目标是从大鼠心脏中同时分离出具有活性的心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞，用于各自的体外分析。该方法有助于回答心血管领域中关于心肌肥厚、缺血再灌注损伤、内皮功能及心肌纤维化相关信号转导机制的关键问题。该技术的主要优势在于可同时分离心脏中的所有主要细胞类型，从而可能降低相关研究成本并减少实验动物使用数量。

用一蒸馏水和50毫升Powell培养基冲洗后，更换为80毫升新鲜Powell培养基，并使用玻璃刻度吸管从玻璃筒中持续用碳氧混合气（carbogen）灌注培养基。接着，用两把细弯镊子将新鲜获取的大鼠心脏通过主动脉安装到Langendorff灌流系统上，并将灌流系统套管末端置于第一主动脉分支与主动脉瓣之间。用鳄嘴钳固定主动脉。

打开套管阀门，然后用手术缝线固定心脏。让35毫升灌注液以滴状流经心脏，以清除残留血液。将收集漏斗置于心脏下方，启动蠕动泵，使灌注液从收集漏斗循环回储液器。

向灌注液中加入胶原酶溶液，并用循环的胶原酶溶液灌注心脏30分钟。消化结束后，用剪刀将心脏从兰格多夫系统中取出，置于玻璃培养皿中。随后去除心脏的两个心房以及任何残留的脂肪组织。

为避免上皮细胞污染，使用两把镊子小心剥离心包膜。将心脏沿中线剪开，把两半放入组织切碎器中。将心脏组织切碎两到三次，然后将组织碎片转移至含有12毫升Langendorff灌流消化缓冲液的15毫升锥形管中。

将组织碎片置于水浴中消化5至10分钟，期间偶尔使用5毫升一次性塑料移液管混匀。随后将细胞悬液通过100微米筛网过滤至50毫升锥形管中。用至少1升蒸馏水冲洗灌注系统，接着用100毫升0.1 N氢氧化钠冲洗30分钟，再用另外2至3升蒸馏水冲洗系统，最后用气流冲洗干燥仪器。

通过离心收集过滤后的细胞，使用一次性移液管小心地将含有内皮细胞和成纤维细胞的上清液转移至新的50毫升离心管中。将沉淀重悬于6毫升钙溶液一中。1分钟后，再次离心收集细胞，并将沉淀重悬于6毫升钙溶液二中。

一分钟后，加入12毫升钙溶液三，稀释细胞悬液，并通过轻轻倾斜充分混匀。再次离心后，将沉淀重悬于20毫升预热的CCT培养基中。然后将一毫升细胞悬液分装至20个预先包被层粘连蛋白的无菌35毫米细胞培养皿中，每皿一毫升，并将细胞置于无二氧化碳的细胞培养孵育箱中。两小时后，更换为两毫升新鲜CCT培养基，以去除任何死细胞。

现在将含有内皮细胞和成纤维细胞的上清液离心，并将沉淀重悬于1.5毫升内皮细胞分离缓冲液中。将细胞转移至2毫升样品管中，加入小鼠抗大鼠CD31抗体，于4°C条件下旋转孵育30分钟。孵育结束后，加入Pan抗小鼠IgG磁珠，于4°C条件下继续旋转孵育20分钟。

珠子孵育结束后，将细胞置于磁力架上静置两分钟，使用1毫升移液器小心移除含有大部分成纤维细胞的上清液。将成纤维细胞接种至含有10毫升成纤维细胞培养基的10厘米培养皿中，并将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养箱中孵育1小时。接着，向内皮细胞管中加入1毫升洗涤缓冲液，并盖紧管盖。

轻轻振荡细胞四到五次以重悬磁珠。然后将离心管放回磁力架上，静置1分钟后吸除洗涤缓冲液。最后一次洗涤后，将洗涤缓冲液替换为1毫升MV2内皮细胞培养基，并将内皮细胞接种至12孔板的一个孔中，在细胞培养孵育箱中过夜培养。

成纤维细胞孵育结束后，用适当体积的预热 PBS 洗涤贴壁细胞 2 至 3 次。随后向细胞中加入预热的新鲜成纤维细胞培养基，并将成纤维细胞放回细胞培养孵育箱中。次日早晨，将内皮细胞培养物中的上清液更换为新鲜的内皮细胞培养基，并将细胞放回孵育箱中，每 2 至 3 天更换一次培养基，直至细胞达到半融合状态。

然后用新鲜预热的PBS洗涤已贴壁的成纤维细胞培养物（方法如前所述），并用新鲜预热的培养基喂养细胞。心肌细胞分离步骤可获得纯度为70%至80%、具有活性、呈杆状且有横纹的心肌细胞群体。随后可对负载fura AM的分离心肌细胞进行细胞内钙振荡分析，以检测其对心肌细胞缺血再灌注的响应；同时，也可在加入ATP后，分析磁珠分离的内皮细胞和成纤维细胞中钙信号的变化。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在三小时内完成。在进行该操作时，重要的是要记住正确搭建灌注系统，并在心脏准备好后立即将其固定于系统中。该技术建立后，为心血管研究领域的研究人员探索不同心血管病理生理过程中涉及的信号通路奠定了基础。

观看本视频后，您应该对心肌细胞分离与培养的基本原理有充分的理解。请务必注意，使用手术器械和细胞培养试剂可能存在极高风险，因此在操作过程中必须采取预防措施，例如谨慎使用器械并佩戴手套。