胚胎血管生成的可视化和定量分析热带非洲爪蟾

该程序的总体目标是可视化非洲爪蟾蝌蚪的脉管系统。这种方法可以帮助回答心血管生物学领域的关键问题，例如血管生成是如何调节的。该技术的主要优点是可以通过简单的荧光染料注射来观察完整孔型胚胎中的血管。

首先使用微量装载器向锥形玻璃微量移液器中填充大约 5 微升的透明 diI 乙酰化 LDL 溶液，注意不要加载沉淀颗粒。在解剖显微镜下，使用一对 55 号细镊子夹住移液器的尖端以调整上传的复合物的体积，并将压力控制注射系统设置为每次注射喷射约 5 纳升溶液。然后将移液器吸头浸入 0.04% MS-222 中的 0.1X 改良 Barth 盐水或 MBS 中，溶于定制的 Sylgard 模具中。

接下来，将非洲爪蟾胚胎转移到 Sylgard 模具中，并确认完全镇静，对背鳍刺激没有反应。在解剖显微镜下，将胚胎腹侧向上加载到模具的 V 形压痕中，以略微倾斜的位置。将两个 0.1 毫米的细小针紧固定在针架上，并使用一个针刺穿心脏上方的皮肤，心脏应该有明显的搏动。

将针插入心脏和皮肤之间空间的孔中，不要刺穿心脏，并将插入的尖端定位在将要切开的区域内。然后将第二个针与插入的针擦，形成线性切口，并同时使用两个针轻轻加宽切口，露出心脏。要注射 DiI 乙酰化 LDL 溶液，请将玻璃移液器吸头插入心脏，并在大约 50 次射血脉冲中注射 60 至 60 纳升 DiI 乙酰化 LDL。

当所有染料溶液都已递送后，确认心脏仍在跳动，并将胚胎转移到含有 0.1X MBS 的新培养皿中。5 到 10 分钟后，蝌蚪应该从麻醉中恢复并开始移动。注射适当数量的胚胎后，在荧光显微镜下目视筛选正确标记的麻醉胚胎，丢弃任何标记有其他器官的动物。

标记不充分的胚胎可以再次注射。然后捕获正确标记的胚胎的图像。为了对血管进行更彻底的成像，将重新麻醉的胚胎在 4% 多聚甲醛中固定一小时，在室温下避光，以便通过共聚焦显微镜进行可视化。

如果将足够量的 diI 乙酰化 LDL 注射到心脏中，则应在荧光显微镜下立即看到后红静脉或 PCV。肌间静脉或 ISV 从 PCV 背侧以前波到后波的形式出现，从 36 期开始，到 40 至 41 期左右结束，在 43 期周围变得轻微分支。PCV 和 ISV 以刻板的血管生成模式生长，受到严格的发育控制。

有趣的是，反义吗啡菌敲除 TIE-2 信号传导降低了 ISV 的长度和复杂性，而 TIE-2 组成型活性形式的表达诱导了过度的 ISV 分支。可以计算静脉复杂性指数来评估 ISV 的复杂性，并且可以生成渲染路径以可视化胚胎热带爪蟾脉管系统的整体结构。Levin 和 Colics 描述了原始方案用于使用非洲爪蟾，我们将其改编为热带非洲爪蟾。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一小时内完成。在此程序之前，可以进行遗传和药理学作以回答其他问题，例如哪些基因和信号通路调节血管发育。使用该程序，可以在完整的动物中实时成像标记的脉管系统，为研究血管发育的动力学提供了强大的工具。

看完这个视频后，你应该对如何将 diI 乙酰化 LDL 注射到非洲爪蟾蝌蚪的心脏以可视化它的脉管系统有一个很好的了解。