Name: 测试环境线索对交配行为的影响的方法黑腹果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学习量化环境化学线索对黑腹果蝇交配行为影响的行为学检测方法。该技术通过加压空气系统或食物介质传递化合物，结合24小时视频监测，可系统分析嗅觉和味觉信号对繁殖行为的调控机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢布卢明顿 果蝇 果蝇品系保藏中心提供果蝇品系；C. Gahr、J. T. Alkema 和 S. van Hasselt 在开发加压空气检测方法初期所作的尝试；Jasper Bosman 在酵母培养方面的建议；Rezza Azanchi 和 Joel Levine 在最初开发延时监测技术方面的贡献 黑腹果蝇 交配行为。J.A. Gorter 获得了神经科学研究学院 BCN/NWO 研究生项目资助。本工作部分由荷兰科学研究组织（NWO）（编号：821.02.020）资助，项目负责人为 J.C. Billeter。

1. 环境可控的交配箱
<ol>
	<li>为确保测试区域受控且易于清洁，按图1A所示设置一个尺寸为120 cm x 64 cm x 85 cm的不锈钢厨房柜。
	<ol>
		<li>在柜子后壁天花板正下方钻一个孔，在两侧壁上各钻四组孔，每组四个，孔径均为2 cm。在箱体两侧各钻第一组四孔，距箱底高度为7 cm，孔间距为12.5 cm。另两组四孔位于箱体两侧，距箱底高度为35 cm。 
		注意：四组四孔用于摄像头电源线和气泵管路进出柜体。后壁的孔用于灯板的电源线穿过。</li>
		<li>制作一块灯板，共18行，每行40个交替排列的白色和红色发光二极管（LED），每个灯之间间距为2.5 cm。将白色和红色LED接入电路并连接电源。每个LED串联一个阻值为560 Ω、功率0.25 W、误差5%的电阻。 
		注意：红光发射波长范围为590–661 nm，在627 nm处有尖锐峰值。实验区域内的光照强度在两种光源全开时约为900 lux，仅红光开启时约为90 lux；该数值使用智能手机光照计应用程序测得。</li>
		<li>将灯板固定在不锈钢柜顶部，并使电源线从后壁孔中穿过。</li>
		<li>将白色LED的适配器连接至一个电源控制定时器，以便在实验的黑暗阶段关闭白色LED。将果蝇无法感知的红光光源适配器25连接至常规电源，使其在整个实验过程中持续开启。</li>
		<li>在箱体内侧距底部50 cm高度处，安装一根110 cm和两根54 cm长的金属支架，支架宽度均为0.5 cm。将一块磨砂玻璃扩散板（尺寸为119.0 cm x 54.5 cm x 0.5 cm）放置于这些支架上。</li>
		<li>在灯板与玻璃板之间添加三层滤纸（120 cm x 50 cm），以扩散光线并减少交配区域表面的反光（交配区域见第4节描述）。使用磁铁将两片滤纸沿120 cm长的木条长边固定在一起（置于侧面），并吸附在金属柜内壁上；重复此操作共三次。</li>
		<li>在箱体两侧安装四个风扇，以产生持续通风的气流。在灯板与玻璃板之间安装第一组8 cm风扇，进气口位于箱体左侧，出风口位于右侧，以最大限度减少灯板产生的热量积聚。</li>
		<li>在柜体底部上方25 cm处安装第二组12 cm风扇，以产生向外的气流，排出柜内空气并使其稳定冷却至26 °C。将风扇的出风口连接至抽气软管，并将气流导出室外，防止柜内空气循环。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置两个高度约为48 cm的支架，每个支架上安装两个夹具，分别位于距支架底部28 cm和30 cm处。将网络摄像头固定在每个夹具上。将4个摄像头连接至运行监控软件的计算机。</li>
	<li>在每个网络摄像头下方放置A4纸张。可使用未印刷的白纸，或预先印有7行5列、轴距4 cm的编号网格纸，以适配交配区域（见第4节描述）。 
	注意：一台具有78°广角视野和500万像素分辨率的高清网络摄像头可覆盖约21 cm x 30 cm的区域，相当于一张A4纸的面积，可同时监测20至35个交配区域。</li>
</ol>
2. 果蝇饲养与收集
<ol>
	<li>将20只雄性和20只野生型 Canton-S 果蝇放入含有45 mL富集果蝇培养基的果蝇培养瓶中（见第3节），饲养3至4天。通过轻敲使果蝇沉底后，将其转移至新的培养瓶中，共重复转移三次。
	<ol>
		<li>将培养瓶置于25 °C、12小时光照与12小时黑暗交替的培养箱中，光照于09:00开启（即昼夜节律时间（ZT）0）。约10天后将出现新一代果蝇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用二氧化碳垫对新羽化的果蝇进行麻醉，时间不超过5分钟，并用毛笔将其收集至果蝇培养管中。
	<ol>
		<li>从野生型 Canton-S 培养瓶中收集处女（新羽化）雌蝇和处女雄蝇，放入含有6.5 mL富集果蝇培养基的2.5 cm × 9.5 cm果蝇培养管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将果蝇按性别分组，每组20只，置于果蝇培养管中，在25 °C、12小时光照与12小时黑暗交替、光照于09:00开启（ZT 0）的条件下饲养5至8天。</li>
	<li>在实验前一天，将果蝇转移至新的果蝇培养管中。</li>
</ol>
3. 食物培养基的制备
<ol>
	<li>按以下步骤制备1 L富营养果蝇培养基。
	<ol>
		<li>将1 L自来水倒入带有磁力搅拌子的2 L玻璃烧杯中，并将烧杯置于磁力加热板上。保持不搅拌状态，将加热温度调至300 °C，直至达到沸腾温度。 
		注意：在后续步骤的长时间煮沸过程中，部分水会蒸发，但结合所添加的成分，本方案在约22 °C室温下制备时最终可得到1 L富营养果蝇培养基。</li>
		<li>开启搅拌，设定转速为500转/分钟（rpm），并将以下成分加入沸腾的水中：10 g琼脂、30 g葡萄糖、15 g蔗糖、15 g玉米粉、10 g小麦胚芽、10 g大豆粉、30 g糖蜜、35 g活性干酵母。待酵母充分起泡后，将加热板温度调低至120 °C。</li>
		<li>10分钟后，将加热板温度降至30 °C，继续搅拌直至混合物冷却至48 °C。通过将温度计直接插入培养基中监测温度。</li>
		<li>将2 g对羟基苯甲酸甲酯（Tegosept，100%）溶解于10 mL 96%乙醇中。将此溶液与5 mL 1 M丙酸一同加入混合物中，搅拌3分钟。</li>
		<li>将果蝇培养基倒入实验区域（见第4节描述）中，使底部形成厚度为0.3 cm的培养层。
		<ol>
			<li>可使用200 mL玻璃烧杯进行倾倒。当需精确控制体积时，使用10 mL血清移液管。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备不含酵母的果蝇培养基，步骤完全同3.1.1至3.1.5，但在步骤3.1.2中省略酵母的添加。</li>
	<li>通过将10 g琼脂和35 g蛋白胨加入1 L沸水中混合，制备含或不含蛋白胨的培养基，并执行步骤3.1.4至3.1.5。</li>
</ol>
4. 交配区域准备
<ol>
	<li>使用加热至发红的接种针（在本生灯上加热）或电烙铁，在一个3.5 cm × 1.0 cm的塑料培养皿上侧打一个直径约0.3 cm的小孔。</li>
	<li>在制备含有气味化合物的培养基时，首先用移液器将30 µL目标化合物（占最终培养基体积的1%，例如100%冰醋酸）加入其中一半实验用培养皿中；另一半培养皿保持空白，用于对照比较。 
	注意：采用此处描述的装置，最多可同时检测140个实验区域。</li>
	<li>使用10 mL血清移液管，将3 mL培养基加入培养皿底部并覆盖目标化合物。用纱布覆盖皿口以防止污染，并在室温下静置约1小时，使培养基凝固。</li>
	<li>将培养皿盖上盖子，并在两侧用胶带封紧。通过将石蜡膜卷成厚约0.2 cm的条状，再切成约0.5 cm长的小段，制备小型石蜡膜塞，用于封堵培养皿上的小孔。</li>
</ol>
5. 用于气味研究的酵母培养
<ol>
	<li>在14.0 cm × 2.06 cm的培养皿中，使用酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂培养干活性酵母。此步骤中需佩戴手套以防止污染。
	<ol>
		<li>通过将10 g酵母提取物、20 g蛋白胨、22 g葡萄糖（0(+)-葡萄糖一水合物）和15 g琼脂（纯品）加入1 L沸腾的超纯水中来制备YPD琼脂平板。待所有成分溶解后，倒入培养皿底部，并将平板倒置存放于4 °C冰箱中，最多可保存2个月。</li>
		<li>取少量干酵母颗粒撒在YPD培养基平板上，使其溶解，然后使用无菌接种环在平板上划线。将平板置于30 °C培养箱中过夜培养。之后将菌种置于冰箱中保存，保存时间不超过1周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在1 L的玻璃瓶中制备YPD液体培养基：向1 L超纯水中加入10 g酵母提取物、20 g蛋白胨、22 g葡萄糖（0(+)-葡萄糖一水合物）以及一个搅拌子。
	<ol>
		<li>在120 °C、1 bar压力下高压灭菌25分钟。灭菌后，将瓶子置于4 °C冰箱中保存，最多可保存2个月，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在开口瓶盖（4.5 cm）上安装厚度为0.32 cm的硅胶隔垫。
	<ol>
		<li>在隔垫上打两个小孔，以便紧密安装带凸缘的贯通接头。将小段聚氯乙烯（PVC）管（外径0.8 cm，内径0.5 cm）连接至从瓶中引出的两个出口，以及仅一个进入瓶内的入口。参见图1B示意图。</li>
		<li>用铝箔包裹已装配好的瓶盖和管路，在120 °C、1 bar压力下高压灭菌25分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>此步骤中需佩戴手套以防止污染。使用无菌的100 µL移液器吸头蘸取YPD琼脂平板上的一个酵母菌落（见步骤5.1），然后将其滴入已灭菌的YPD液体培养基瓶中。
	<ol>
		<li>将接种酵母的YPD液体培养基瓶以及一个未接种酵母的YPD培养基对照瓶（空白对照），均用已灭菌并装配有进气口和出气口的瓶盖（见步骤5.3）密封。将两个瓶子分别置于磁力搅拌器上，在室温下以100 rpm转速搅拌24小时，以使酵母菌种充分生长，为实验开始做准备。</li>
		<li>将两个瓶子的进气口分别连接至独立的水族泵，以向酵母培养物供气。确保将实验组酵母瓶的出气口连接至一根通气管，将酵母气味排出实验房间，以避免对实验造成干扰。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 气泵设置
<ol>
	<li>将大号PVC管（外径1.2 cm，内径0.9 cm）连接至加压空气源，并通过两个装有活性炭至800 mL刻度线的1 L玻璃锥形瓶，以净化空气。可使用实验室常见的加压空气作为气源，也可将管道连接至空气泵（本实验中使用加压空气）。 
	注意：应根据挥发性物质的化学性质选择管路材料，并进行测试以防止挥发性物质吸附在管路内壁（例如聚四氟乙烯、尼龙或不锈钢）。</li>
	<li>用两个15 mL离心管和各三个1,000 µL枪头制作两个空气分流器。
	<ol>
		<li>制作三个直径约1 cm的孔。首先，使用在本生灯上加热至发红的接种针，在15 mL离心管盖下方紧邻处灼烧两个相邻的孔。然后通过切除管底制备第三个孔。</li>
		<li>用胶水将1,000 µL枪头插入孔中，窄端朝外。剪去枪头末端以增大空气流通。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将大号PVC管的一端连接至装有活性炭的锥形瓶出口，另一端连接至15 mL管底部的移液管尖端。在两个水平放置的移液管尖端分别连接小号PVC管出口，并将它们分别引导至对照瓶和实验瓶。</li>
	<li>为防止微生物污染YPD培养基，将小段导管通过塑料穿板管接头（直插式）连接至无菌注射式滤器（孔径0.45 µm）的进样端，并使用螺纹式塑料穿板管接头连接滤器的出样端。随后，将导管连接至YPD培养瓶的进样口（参见 图1B).</li>
	<li>为防止培养瓶中的酵母气溶胶进入实验区域，使用短段软管将一根玻璃管（长6.5 cm，外径 = 0.5 cm，内径 = 0.3 cm）连接至每瓶YPD培养液的出口。将PVC软管连接至玻璃管的另一端，并引导其通向实验箱两侧的下方孔洞（在箱体两侧钻孔）。
	<ol>
		<li>用玻璃纤维填充试管，使用前进行高压灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在实验箱两侧的小型PVC管上各连接一个15 mL三通管（见第6.2节），使两根管子分别通入实验箱的实验侧（靠近风扇气流出口，右侧）和对照侧（靠近风扇气流入口，左侧）。</li>
	<li>准备8支25 mL的血清学移液管，每支带有10个出口，用于同时检测80对交配组合。 即 每种空气条件下40个
	<ol>
		<li>在移液管上灼烧出10个直径约0.8 cm、间距2 cm的孔。</li>
		<li>将1 mL注射器的外管部分截成一段短（2.5 cm）和一段长（5 cm）的管口。</li>
		<li>用热熔胶将这些出口固定在孔洞中。</li>
		<li>用一小段塑料石蜡膜包裹出口末端，并连接一个1,000 µL的移液器吸头。吸头开口直径为0.1 cm。每次实验均使用洁净的吸头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用外径≥0.5 cm的T型分流器和短段小型PVC管，将两支血清学移液管分别连接至两侧的两个出口。用胶带将移液管平贴固定在白纸片上（位于钢箱内摄像头下方）。</li>
	<li>使用气流监测仪调节气流，使1000 µL移液器吸头出口处的气流速度为0.5 m/s。此速度相当于每吸头0.0017 L/s的气流量。</li>
</ol>
7. 交配行为的监测
<ol>
	<li>使用口吸移液管（如参考文献中所述）26在15:00（ZT 6）将一只实验雌性个体放入一个小培养皿（见第4节）中，使其有1小时时间适应交配环境。</li>
	<li>按照以下步骤设置实验箱（见第1节描述）：
	<ol>
		<li>打开灯光， 即 白光LED以12小时光照：12小时黑暗循环连接定时器，光照在09:00（ZT0）开启，同时使用持续的红光LED以便在实验的黑暗阶段观察果蝇。开启风扇以减少光源对培养柜的加热，并确保多余的气味被排出测试区域外。</li>
		<li>将网络摄像头连接到计算机，并使用监控软件启动摄像头以进行图像监测。</li>
		<li>为每台相机，在监控软件中设置焦距、亮度和缩放。
		<ol>
			<li>右键点击摄像头屏幕，打开 &#34;相机属性，&#34; 并取消勾选 &#34;自动对焦&#34; 调节 &#34;焦点&#34; 以清除纸张上的网格线或任何文字。如有必要，可进行调整 &#34;亮度&#34; 和 &#34;放大&#34;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将监控软件的程序设置为每2分钟拍摄1张图片。右键单击每个摄像头屏幕并选择 &#34;编辑相机&#34; 然后 &#34;操作&#34; 选项。点击以开始操作 &#34;定期&#34; 并更改时间为 &#34;2分钟。&#34; 选择 &#34;拍照&#34; 选择要执行的操作，最后点击 &#34;好的。&#34;</li>
		<li>右键单击每个摄像头屏幕并选择 &#34;开始监测。&#34;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 小时后（ZT 7），用口吸管将一只野生型雄性个体转移至培养皿中，将培养皿置于网络摄像头下的 A4 纸上，然后点击 &#34;开始监测&#34; 孵育24小时。对于气泵实验，将培养皿放置妥当，使移液管出口与交配区域的入口孔相连。</li>
	<li>为分析该对个体的交配行为，请执行以下步骤。
	<ol>
		<li>在图像浏览软件中选择并打开所有图片，按时间顺序逐页查看。</li>
		<li>在电子表格的同一行中记录日期、实验编号、培养皿编号和开始时间。每个实验区域的开始时间以将其放置在 webcam 摄像头下的时刻为准。根据图片记录时间戳。</li>
		<li>在电子表格的同一行中标记每次交配的开始时间。当雄性个体爬上雌性个体且两者保持相对静止并以相同姿势持续至少五个连续帧（10分钟）时，计为一次交配事件。 
		注意：该标准基于报道的交配时长，范围为12至27分钟 D. melanogaster，以及观察发现持续10分钟或更长时间的交配具有生育能力27,28.</li>
		<li>在电子表格中统计每行的交配次数，以确定交配频率。或者，用每次交配发生的时间减去实验开始时间，作为交配潜伏期的测量指标；也可用第二次交配发生的时间减去第一次交配发生的时间，作为再交配潜伏期的测量指标。
		<ol>
			<li>为计算再次交配潜伏期，需在电子表格软件中将首次与第二次交配的日期定义为连续的日期。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用统计软件（见材料表），采用混合效应模型分析数据，假设数据呈正态分布，并将实验日期作为随机因子，以确定自变量——培养基类型、气体种类及其交互作用——的统计学显著性，方法如前所述。5.</li>
		<li>通过使用对数似然比检验及相应的赤池信息量准则（Akaike information criterion），对不显著的自变量进行向后剔除，从而选择最优解释模型。运行模型后，目视检查数据残差以确认其正态性。使用Levene检验确认方差齐性。若方差齐性不满足，应对数据进行平方根转换。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+nutrition%2C+and+reproduction%3A+timing+is+everything%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).</li>
<li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).</li>
<li>Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2409235?seq=1#page_scan_tab_contents">Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster.</a> Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).</li>
<li>Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+nutritional+status+determines+the+magnitude+and+sign+of+responses+to+a+male+ejaculate+signal+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster.</a> J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).</li>
<li>Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nutritional+and+hedonic+value+of+food+modulate+sexual+receptivity+in+Drosophila+melanogaster+females%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females.</a> Sci. Rep. , 1-10 (2016).</li>
<li>Wigby, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signalling+regulates+remating+in+female+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Insulin signalling regulates remating in female Drosophila.</a> Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).</li>
<li>Ribeiro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dilemmas+of+the+gourmet+fly%3A+the+molecular+and+neuronal+mechanisms+of+feeding+and+nutrient+decision+making+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila.</a> Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).</li>
<li>Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmating+circuitry+modulates+salt+taste+processing+to+increase+reproductive+output+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila.</a> Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).</li>
<li>Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptides+modulate+female+chemosensory+processing+upon+mating+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila.</a> PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).</li>
<li>Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+seminal+fluid+proteins%3A+identification+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Insect seminal fluid proteins: identification and function.</a> Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).</li>
<li>Laturney, M., Billeter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenetics+of+female+reproductive+behaviors+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BS%3AADGEN%22%5BJournal%5D)">Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster.</a> BS:ADGEN. 85, Elsevier. 1-108 (2014).</li>
<li>Liu, H., Kubli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-peptide+is+the+molecular+basis+of+the+sperm+effect+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).</li>
<li>Ram, K. R., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+post-mating+response+in+Drosophila+melanogaster+requires+multiple+seminal+fluid+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+gen%22%5BJournal%5D)">Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins.</a> PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).</li>
<li>Yapici, N., Kim, Y. -J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+receptor+that+mediates+the+post-mating+switch+in+Drosophila+reproductive+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour.</a> Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).</li>
<li>Yang, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+postmating+behavioral+switch+in+Drosophila+females+by+internal+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons.</a> Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).</li>
<li>Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neurons+in+the+Drosophila+genital+tract+regulate+female+reproductive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior.</a> Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).</li>
<li>Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuitry+underlying+Drosophila+female+postmating+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses.</a> Curr. Biol. , 1-11 (2012).</li>
<li>Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+mediate+the+sex-peptide-regulated+switch+in+female+Drosophila+reproductive+behaviours%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours.</a> Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).</li>
<li>Krupp, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+experience+modifies+pheromone+expression+and+mating+behavior+in+male+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster.</a> Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).</li>
<li>Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+females+change+mating+behaviour+and+offspring+production+based+on+social+context%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.l+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context.</a> Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).</li>
<li>Krupp, J. J., Billeter, J. -C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigment-dispersing+factor+modulates+pheromone+production+in+clock+cells+that+influence+mating+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila.</a> Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).</li>
<li>Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mating+in+wild+Drosophila+melanogaster+revisited+by+microsatellite+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis.</a> Mol. Ecol. , 915-917 (1998).</li>
<li>Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+paternity+in+two+natural+populations+%28orchard+and+vineyard%29+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).</li>
<li>Becher, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2435.2012.02006.x/abstract">Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development.</a> Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).</li>
<li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+visual+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila visual transduction.</a> Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).</li>
<li>Ejima, A., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+courtship+suppression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Prot%22%5BJournal%5D)">Assay for courtship suppression in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575(2011).</li>
<li>Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+Dopaminergic+and+GABAergic+Neurons+Control+the+Duration+and+Persistence+of+Copulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila.</a> Cell. 155 (4), 881-893 (2013).</li>
<li>Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+responses+of+male+Drosophila+melanogaster+to+the+level+of+sperm+competition+increase+male+reproductive+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness.</a> Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).</li>
<li>Dukas, R., Jongsma, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003347212003727">Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies.</a> Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).</li>
<li>Yorozu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sensory+representations+of+wind+and+near-field+sound+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain.</a> Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益需要披露。

本方案描述了一种在24小时内检测交配行为的实验方法，同时持续控制交配对体被假定用于决定交配频率的环境线索。当培养基中含有酵母时，通过加压空气系统输送酵母气味可提高交配频率（图2B）。此外，在成分简化的食物培养基中，仅含有琼脂、蛋白胨以及直接添加于培养基中的乙酸气味时，也可观察到类似的交配频率响应（图3B）
通过此处展示的实验，仅能得出关于果蝇配偶整体交配行为的结论，因为雌雄个体均处于相同的环境条件下。然而，根据以往的研究可知，交配频率变异的47%由雌性决定，而雄性的贡献仅占变异的11%20。因此，观察到的交配频率的大部分变化很可能是由雌性性接受度所导致的。即使雄性求偶行为增加，交配是否发生仍取决于雌性是否接受或拒绝，因为成年黑腹果蝇（D. melanogaster）雌性能成功回避交配尝试29。为了得出确切结论，并将交配频率的差异明确归因于雌性性接受度，有必要进一步测试额外的交配组合，其中保持雄性基因型不...

生殖行为通常具有较高的能量消耗，尤其是对于雌性个体而言，由于其产生的配子比雄性更大，且必须谨慎选择适宜的环境来抚育发育中的后代。由于存在能量消耗，生殖与营养状况密切相关也就不足为奇了。这一点在大多数（即使不是全部）动物中均成立，包括哺乳动物——其青春期可能因营养不良而延迟，性欲也可能受到食物限制的负面影响1。
遗传模式生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的繁殖也受到营养条件的影响。雄性在食物挥发物存在时求偶行为增强2，而雌性在酵母存在时性接受度更高，酵母是卵子产生和后代存活的主要营养来源3,4,5。这种在进化上保守的对食物的生殖响应，为在遗传上易于操作且实验周期短的生物体中研究环境食物可获得性与有性生殖之间联系的机制提供了机会。事实上，对黑腹果蝇（D. melanogaster）的研究已表明，胰岛素信号通路是食物与交配行为之间关联的重要调控因子6。研究还发现，交配行为本身会改变雌性的食物偏好及其相关的化学感受神经元7,8,9。

显然，食物线索会影响黑腹果蝇（D. melanogaster）的繁殖行为。这些影响似乎主要作用于雌性个体，尤其是已经交配过的雌蝇5。然而，为了检测环境条件的急性效应，传统上用于研究雌性交配行为的实验方法可能并不十分合适，原因是交配事件之间的间隔时间过长。在传统的再交配实验中，一只处女雌蝇首先与一只雄蝇交配，随后立即被隔离，并在24至48小时后被提供另一只新的雄蝇。这种传统实验方法已被成功用于鉴定精液中能够改变雌蝇行为及其反应的组分12,13,14,15,16,17,18。因此，本文所展示的连续交配实验是对传统交配实验的一种补充，可用于研究环境条件对繁殖行为的急性影响。
通过本文所述的持续交配行为检测方法，我们先前发现，暴露于酵母的一对果蝇在24小时的观察期内会多次重新交配5,19,20,21，而未接触食物的果蝇仅会重新交配一次5。这一发现似乎与大量关于黑腹果蝇（D. melanogaster）的文献相矛盾，因为这些文献表明雌性在初次交配后数天内不会再次交配（参见文献10,11的综述）。然而，这种差异可通过实验条件加以解释：在这些研究中，雌性通常被隔离一至数天后才提供新的交配机会。如果在长达一小时的观察期间内未发生交配，则该雌性被视为不具备交配接受性。此外，野生果蝇的数据表明，其雌性储精器官中含有来自4至6只雄性的精子，这说明雌性在自然条件下本就会多次重新交配22,23，因此高频交配现象并不令人意外。

在此，我们演示如何利用这种持续交配实验来揭示果蝇如何感知并整合环境条件信息，以调节其交配频率。该实验方法可用于遗传学研究中相对大量交配对的检测，并可用于评估挥发性和非挥发性环境线索的影响。该实验通常持续24小时，但可延长至48小时，从而能够检测如明暗循环（LD循环）等周期性环境线索的影响。我们通过在加压空气系统中测试酵母培养物释放的挥发性线索，同时结合食物基质中非挥发性酵母营养物质的可获得性，来演示该实验方法的应用。
加压空气系统持续将挥发性信号泵入交配区域，该区域包含食物基质和一对测试果蝇（其交配行为被监测）。为了进一步确定酵母影响交配行为的具体机制，我们测试了酵母的一种主要挥发性化合物——乙酸24，并结合蛋白胨（来源于动物蛋白酶解的氨基酸）形式提供的、与酵母中氨基酸含量相当的氨基酸成分，添加至食物基质中。这些实验共同展示了如何利用该检测方法研究环境信号对黑腹果蝇（D. melanogaster）交配行为的影响。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;机柜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>不锈钢厨房柜</td><td>Horecaworld</td><td>7412.0105</td><td></td></tr><tr><td>白色LED灯</td><td>Lucky Light</td><td>ll-583wc2c-001</td><td>冷白光，20 mAmp，2 V</td></tr><tr><td>红色LED灯</td><td>Lucky Ligt</td><td>ll-583vc2c-v1-4da</td><td>波长625 nm，20 mAmp，6 V</td></tr><tr><td>电阻器</td><td>Royal Ohm</td><td>CFR0W4J0561A50</td><td>560 欧姆，0.25 W，250 V，5% 容差</td></tr><tr><td>智能手机光强计应用</td><td>Patrick Giudicelli</td><td></td><td>Light/Lux Meter FREE，版本 1.1.1</td></tr><tr><td>电源定时器</td><td>Alecto</td><td>TS-121</td><td></td></tr><tr><td>金属支架</td><td></td><td></td><td>锐角 5×5 mm，&amp;nbsp;2 根长 5450 mm，1 根长 1100 mm</td></tr><tr><td>磨砂玻璃板</td><td></td><td></td><td>1190 × 545 × 5 mm</td></tr><tr><td>滤纸片</td><td>LEE filters</td><td>220</td><td>白色磨砂</td></tr><tr><td>小型风扇</td><td>Nanoxia Deep silence</td><td>4260285292828</td><td>80 mm 超静音电脑风扇，1200 RPM</td></tr><tr><td>大型风扇</td><td>Nanoxia Deep silence</td><td>4260285292910</td><td>120 mm 超静音电脑风扇，650–1500 RPM</td></tr><tr><td>网络摄像头</td><td>Logitech</td><td>950270</td><td>B910 HD WEBCAM OEM，视角：78度，分辨率：500万像素&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>摄像头软件</td><td>DeskShare</td><td></td><td>Security monitor pro</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;果蝇饲养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>果蝇饲养瓶</td><td>Flystuff</td><td>32-130</td><td>6盎司果蝇品系瓶</td></tr><tr><td>果蝇培养皿（Flypad）</td><td>Flystuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>野生型果蝇</td><td></td><td></td><td>Canton-S</td></tr><tr><td>果蝇饲养管</td><td>Dominique Dutscher</td><td>789008</td><td>果蝇管，窄型，25×95 mm</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Sanyo</td><td>MIR-154</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌加热板</td><td>Heidolph</td><td>505-20000-00</td><td>MR Hei-Standard</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Caldic Ingredients B.V.</td><td>010001.26.0</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Gezond&amp;amp;wel</td><td>1019155</td><td>右旋糖/葡萄糖</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Van Gilse</td><td></td><td>砂糖</td></tr><tr><td>玉米粉</td><td>Flystuff</td><td>62-100</td><td></td></tr><tr><td>小麦胚芽</td><td>Gezond&amp;amp;wel</td><td>1017683</td><td></td></tr><tr><td>大豆粉</td><td>Flystuff</td><td>62-115</td><td></td></tr><tr><td>糖蜜</td><td>Flystuff</td><td>62-117</td><td></td></tr><tr><td>活性干酵母</td><td>Red Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酸甲酯（Tegosept）</td><td>Flystuff</td><td>20-258</td><td>100%</td></tr><tr><td>蛋白胨（bacto）</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Merck</td><td>1000631000</td><td>冰醋酸，100%</td></tr><tr><td>小型培养皿</td><td>Greiner bio-one</td><td>627102</td><td>35 × 10 mm，带通气孔</td></tr><tr><td>石蜡膜</td><td>Bemis NA</td><td></td><td>Parafilm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;酵母与加压空气装置&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大型培养皿</td><td>Gosselin</td><td>BP140-01</td><td>140 × 20.6 mm</td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Millipore corporation</td><td></td><td>MiliQ</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>琼脂（纯）</td><td>BD</td><td>214530</td><td>bacto</td></tr><tr><td>葡萄糖（0(+)-葡萄糖一水合物）&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>18270000004</td><td></td></tr><tr><td>开放式瓶盖</td><td>Schott</td><td>29 240 28&amp;nbsp;</td><td>GL45</td></tr><tr><td>硅胶隔垫</td><td>VWR</td><td>548-0662</td><td></td></tr><tr><td>带倒刺的穿板接头</td><td>Nalgene</td><td>6149-0002</td><td></td></tr><tr><td>大口径PVC管</td><td></td><td></td><td>直径：外径1.2 cm，内径0.9 cm</td></tr><tr><td>小口径PVC管</td><td></td><td></td><td>直径：外径0.8 cm，内径0.5 cm</td></tr><tr><td>15 ml离心管</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水族泵</td><td>Sera precision</td><td></td><td>Sera air 110 plus，交流 220–240 V，50/60 Hz，3 W，压力 &gt;100 mbar</td></tr><tr><td>活性炭</td><td>Superfish</td><td>A8040400</td><td>Norit 活性炭</td></tr><tr><td>一次性滤器</td><td>Whatman</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>移液管（血清学）</td><td>VWR</td><td>612-1600</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>热熔胶</td><td>Pattex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Whatman</td><td></td><td>FP 30/孔径 0.45 mm CA-S</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>统计分析软件</td><td>R</td><td></td><td>lme4 软件包</td></tr></tbody></table>

一种检测环境线索对交配行为影响的方法 黑腹果蝇

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

个体的性驱动力受基因型、经历和环境条件的影响。这些因素如何相互作用以调控性行为，目前仍知之甚少。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，环境线索（如食物的可获得性）会影响交配活动，这为研究调控性行为的机制提供了一个易于操作的系统。在黑腹果蝇（D. melanogaster）中，环境线索通常通过化学感受的味觉和嗅觉系统被感知。本文介绍了一种检测环境化学线索对交配行为影响的方法。该实验包含一个小型交配区域，其中含有培养基和一对交配个体，持续监测每对果蝇在24小时内的交配频率。本文展示了该实验方法的应用，既可通过加压空气系统引入外部来源的环境化合物，也可直接在交配区域内操控环境成分。使用加压空气系统特别适用于测试高挥发性化合物的影响，而直接在交配区域内操控成分则有助于确认化合物的存在效应。该实验方法可被调整用于探究遗传和环境线索对交配行为、繁殖力以及其他雄性和雌性生殖行为的影响。

利用这种连续测定方法，可在实验环境条件下测定特定的交配行为和交配频率。为了控制环境条件，我们将一个不锈钢厨房柜改造为测试区域，配备独立的光源和漫射装置，确保交配实验区顶部具有充足的光照并最大限度减少眩光（图1A）。内部测试区域完全由不锈钢和玻璃封闭，可使用有机溶剂（如正己烷或乙醇）进行清洁。此外，柜体上设有孔洞，作为管道入口，将加压空气系统中的挥发性信号导入测试区域（见图1A和图1B）。该加压空气系统经过调整以适配酵母气味，其气流在进入测试区域前先通过液体酵母培养物，随后经4个移液管分流器分配，每个分流器含10个出口（图1C）。整个系统为密闭结构，并在气流进入和离开酵母培养物前后均配备多个颗粒过滤器，以最大限度减少干扰性气味的污染（图1B）。
为了演示本实验方法的应用，我们检测了酵母培...

我们展示了一种用于分析影响果蝇Drosophila melanogaster交配行为的环境与遗传因素的实验方法。

个体的性驱动力受基因型、经验和环境条件的影响。这些因素如何相互作用以调节性行为……

本行为实验的总体目标是量化环境因素对求偶和交配等生殖行为的影响。该方法有助于回答行为生物学和神经遗传学领域中的一些关键问题，例如遗传和环境因素对生殖行为的影响，以及调控这些行为的机制。该技术在测试影响繁殖的各种环境信号时具有快速和灵活的优势，并且能够进行大量重复实验。本次实验操作将由我实验室的研究生 Jenke Gorter 进行演示。实验开始前，先准备一升富集型果蝇培养基。取一升自来水倒入带有磁力搅拌子的两升玻璃烧杯中，并将烧杯置于磁力加热搅拌器上。关闭搅拌，将温度升至300摄氏度，直至达到沸腾温度。开启搅拌，转速设为500 rpm，将成分加入沸水中。等待酵母剧烈起泡。然后将加热板温度调至120摄氏度。10分钟后，将加热板温度降至30摄氏度，并继续搅拌混合物，直至其冷却至48摄氏度。通过将温度计直接插入食物中来监测温度。将两克Tegosept溶解于10毫升96%乙醇中。将该混合物与5毫升1摩尔丙酸加入烧杯中。搅拌三分钟。将一根针在本生灯上加热至红热，然后在一个3.5厘米×1.0厘米的塑料培养皿上侧打一个直径为0.3厘米的孔。制备含有气味化合物的培养基时，首先将30微升目标化合物用移液器加入实验所用培养皿的一半中。另一半培养皿保持空白，用于对照比较。使用5毫升血清移液管，向每皿中加入3毫升食物培养基，覆盖培养皿底部。用纱布覆盖以防止污染，并在室温下静置一小时，使培养基凝固。接着，将皿盖盖上，并用胶带在两侧封住皿盖。通过将石蜡膜卷成直径 0.2 厘米的细卷，制备小型石蜡膜塞，用于封堵皿上的孔洞。然后将其切成0.5厘米长的片段。在隔膜上打两个小孔，以便紧密安装带倒刺的穿舱接头。将4.5厘米的瓶盖开口端装上厚度为0.32厘米的硅胶隔膜。将小段PVC管连接到从瓶中引出的两个出口以及进入瓶中的一个进口。接着，使用小段软管将玻璃管连接到每个YPD培养瓶的出口，并在管中填充玻璃纤维。使用前进行高压灭菌。将匹配的瓶盖和管路用铝箔包裹，并在120摄氏度、1个大气压条件下高压灭菌25分钟。用无菌的100微升移液器吸头蘸取YPD琼脂平板上的一个酵母菌落，并将其滴入已灭菌的YPD液体培养基瓶中。将此含有酵母的YPD液体培养基瓶，以及一个不含酵母的YPD培养基对照瓶，均用已灭菌的瓶盖密封，并置于出液口内。为防止YPD培养基被微生物污染，将小段管路连接至一个0.45微米的无菌注射式滤器，使用塑料推入式管路接头连接管路与滤器，管路朝向滤器方向。以及一个从滤器引出的塑料舱壁螺纹接头。然后将管路连接到YPD培养瓶的进样口。将培养瓶分别放置在不同的磁力搅拌板上。实验开始前，在室温下以 100 rpm 的速度搅拌溶液 24 小时。将两个瓶子的进气口连接至压缩空气管路。确保将实验用酵母瓶的出气口连接至排气管，将酵母气味排出实验室外，以避免对实验造成干扰。将PVC管连接到玻璃管的出口端，并将其引向实验箱的下方孔洞。使用外径大于或等于0.5厘米的T型分流接头以及短段小型PVC管，将两支血清学移液管分别连接至两侧的两个出口。用胶带将移液管平整地固定在钢箱内摄像头下方的白纸表面。在ZT 6时，使用口吸管将一只实验雌蝇放入一个小培养皿中，并让果蝇在交配区域适应一小时。一小时后，在ZT 7时，将一只野生型雄蝇转移至该培养皿中。并点击开始监测24小时。对于气泵实验，将培养皿放置在适当位置，使移液管出口连接到交配区域的入口孔。为分析该对个体的交配行为，选择在图像查看软件中全部打开所有图片。按时间顺序翻阅记录。将日期、实验编号、培养皿编号和开始时间填写到电子表格的同一行中。每个实验区域的开始时间以将其放置在网络摄像头下时为准。根据图片记录时间戳。将每次交配的开始时间标记在电子表格的同一行中。当雄性个体爬上雌性个体且两者保持相对静止并维持相同姿势至少连续五帧时，计为一次交配事件。对分离自培养基的酵母气味进行分析表明，当培养基中不存在酵母时，果蝇交配对不会对酵母气味产生响应；但当培养基中添加了酵母时，它们在酵母气味环境中的交配频率会增加。乙酸的存在可提高雌性果蝇的接受性。但只有当培养基中含有蛋白胨时才会出现此现象，表明果蝇需要同时感知氨基酸和乙酸，才能提高交配频率。一旦掌握，该技术可在六小时内完成建立，若操作得当，行为学分析可在五小时内完成。

a-method-to-test-effect-environmental-cues-on-mating-behavior

Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

测试环境线索对交配行为的影响的方法<em&gt;黑腹果蝇</em

Drosophila melanogaster 是一种遗传和行为上易于操作的模式生物系统，一个多世纪以来已被用于研究许多重要生命过程的分子与细胞基础1。Drosophila...

Drosophila 行为测定方法

本视频介绍了一种经典的条件化检测方法，用于测试学习与记忆能力...

Drosophila 求偶条件化：一种检测果蝇学习与记忆能力的方法

在本视频文章中，我们描述了一种自动化检测方法，用于测量饥饿或饱腹状态对成年果蝇Drosophila...

一种用于果蝇觅食行为的单体检测方法 果蝇

我们介绍了一种利用Y型迷宫实验揭示气味物质对Drosophila行为影响的选择实验。...

测试 果蝇 使用Y迷宫实验进行嗅觉测试

本文介绍了一种用于量化受胁迫个体回避行为的实验方案。该范式具有强大功能且操作简便，可用于评估基因和环境对黑腹果蝇（Drosophila...

社会回避定量检测的简易实验方法 黑腹果蝇

本方案描述了一种简单且经济高效的方法，用于对个体进行单独识别 果蝇 或其他昆虫。针对三个物种的交配成功率进行研究的示范数据 果蝇 表明该方法与使用CO相比具有相当或更优的效果2...

为行为实验染色昆虫：麻醉状态下昆虫的交配行为 果蝇

为了鉴定影响机械感知的新型突变，我们设计了一种检测方法，用于测量通过MARCM方法产生的突变克隆果蝇刚毛对触觉刺激的行为反应。该技术组合能够鉴定出原本可能导致致死的机械敏感性突变。...

基于MARCM克隆的机械感知行为检测方法 黑腹果蝇

本文介绍了一种利用黑腹果蝇（Drosophila...

测量与调控雄性交配驱动力 黑腹果蝇

本方案描述了一种名为求偶条件化的行为学实验，用于研究黑腹果蝇（Drosophila）的学习与记忆能力。该经典实验基于雄性果蝇在被不接受交配的已交配雌蝇拒绝后，其求偶行为会减弱的自然现象。这种天然的行为可塑性可用于检测学习能力、短期记忆和长期记忆。...

Drosophila 求偶条件化作为学习与记忆的检测指标

内分泌干扰物（EDCs）对生物体及自然环境构成了严重问题。Drosophila melanogaster...

Drosophila melanogaster中内分泌干扰检测方法

自闭症谱系障碍（ASD）与社交和沟通行为受损以及重复性行为的出现相关。本文描述了在黑腹果蝇（Drosophila）模型中研究ASD相关基因与行为缺陷之间相互关系的五种行为范式，用于检测社会间距、攻击性、求偶、理毛以及习惯化行为。...

自闭症谱系障碍的Drosophila模型中的行为评估范式

学习量化环境化学线索对黑腹果蝇交配行为影响的行为学检测方法。该技术通过加压空气系统或食物介质传递化合物，结合24小时视频监测，可系统分析嗅觉和味觉信号对繁殖行为的调控机制。

一种检测环境线索对交配行为影响的方法黑腹果蝇

探索更多视频

一种检测环境线索对交配行为影响的方法 黑腹果蝇

探索更多视频

一种检测环境线索对交配行为影响的方法黑腹果蝇