通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠 关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

本实验方案的总体目标是描述通过卵母细胞显微注射成功制备转基因小鼠所需的操作步骤。该方案可为从事小鼠制备领域以及基因靶向研究的研究人员和技术人员提供帮助。该技术的主要优势在于，它依赖于对小鼠卵母细胞的直接注射，既可用于随机整合，也可用于基因靶向，从而可在短短六周内获得基因修饰小鼠。

为了制备一条单导向RNA，在选定所需的两个靶序列并根据文本方案设计引物后，通过将PX330质粒稀释至无核酸酶水中，使其浓度为每微升10纳克，来合成线性DNA模板。配制预混液，并在最后加入聚合酶，置于冰上保存。随后将混合液混匀并均分为八份，分装至八根PCR管中。

每管加入一微升 PXR330，并运行以下程序。接着，使用 PCR 纯化试剂盒、多通道装置和真空源纯化 PCR 产物。向一份体积的 PCR 样品中加入五份体积的结合缓冲液，并混匀。

将硅胶膜离心柱放置于真空装置上。为结合DNA，将全部八个样本在真空条件下加入离心柱中。为洗涤样本，向离心柱中加入0.75毫升洗涤缓冲液，并进行真空抽滤。

然后，以12,000 × g离心柱子60秒，以去除残留的乙醇。将柱子放入一个洁净的1.5毫升微量离心管中，然后在膜的中心加入30微升无核酸酶的水，以洗脱DNA。让柱子静置1分钟，再以12,000 × g离心60秒。

然后使用分光光度计测定DNA浓度。使用T7 RNA合成试剂盒进行体外转录时，配制预混液，并在37°C的恒温循环仪中孵育反应3小时。加入28微升无核酸酶水和2微升DNase I，再将反应孵育15分钟。

为了纯化RNA，将所提供的离心柱中的粉末溶解于650微升无核酸酶的显微注射缓冲液中。小心去除所有气泡，盖上管盖，并在室温下水化溶液5至15分钟。取下底部的蓝色盖帽，将柱子放入一个2毫升的离心管中。

然后在室温下以750 × g离心2分钟。随后将柱子放入一个新的1.5毫升离心管中，并将50 µL RNA溶液逐滴加入柱子中心，注意不要接触柱壁。接着在750 × g下离心2分钟。

根据文本方案测定RNA浓度并评估RNA质量。使用无核酸酶的显微注射缓冲液，将Cas9 mRNA稀释至50纳克/微升，将sgRNA稀释至12.5纳克/微升，用于基因敲除实验。对于基于同源定向修复的基因组编辑，加入浓度为200纳克/微升的供体模板，并置于冰上保存。

使用移液管吹吸装置，用四滴新鲜的酪蛋白氨基酸溶液清洗卵母细胞，并将其转移至一滴覆盖石蜡油的酪蛋白八号培养基中。在体视显微镜下进行原核显微注射以实现随机整合时，使用移液管吹吸装置将约50个卵母细胞转移至一滴覆盖石蜡油的M2培养基中，该液滴将作为注射腔室使用。

将注射腔室转移至倒置显微镜下，向受精卵中注射数皮升的注射混合液。若注射成功，原核将出现肿胀。进行细胞质注射以实现基因靶向，使用口控装置将约50枚卵母细胞转移至含有细胞松弛素B（5微克/毫升）的casome A液滴中，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5分钟。

将卵子转移到注射室中，然后在极低压力下，使用自动显微注射仪的补偿压力（如可能），向细胞质内注入数皮升的注射混合液。注射完成后，用嘴控装置将卵母细胞转移回一滴氨基酸溶液中。

将它们置于37°C和5%二氧化碳条件下培养，直至准备移植到假孕雌鼠的输卵管中。根据文本方案麻醉一只已交配的雌性小鼠后，在无菌条件下进行移植操作：使用手术刀沿背部中线平行方向做一长约1厘米的切口，暴露生殖道；然后用剪刀剪开肌肉层，并用镊子夹住脂肪垫。

轻轻将卵巢拉出，直至其相连的输卵管和子宫清晰可见。然后使用血管夹固定脂肪垫。在体视显微镜下，用一对显微剪在壶腹部上游几毫米处的输卵管壁上剪开一个切口。

此外，在体视显微镜下，将25个显微注射后的卵子加载到与吹管相连的玻璃毛细管中。然后将玻璃毛细管插入输卵管，并推出卵子，直至在壶腹部可见气泡。为确保再移植成功，必须检查壶腹部是否存在气泡，该气泡可证明所有卵子均已准确排出至目标位置，且无任何卵子残留在玻璃毛细管中。

轻轻取出玻璃毛细管，将生殖道放回腹腔内。然后使用3-0非吸收性外科缝线缝合切口，再用伤口夹闭合皮肤。将小鼠置于加热垫上以防止低体温，并皮下注射镇痛剂。

持续观察小鼠直至其完全恢复。最后，根据文本方案进行基因组分型和测序。该图显示了用于分析的凝胶，证明了转基因纯化和sgRNA合成的质量，这两者对于成功制备基因修饰小鼠至关重要。

此处显示的是随机整合显微注射实验的典型结果。基因型鉴定引物应位于转基因序列上，并设计为扩增出200至800个碱基对的片段。在此基因靶向实验结果中，所选引物与基因组DNA中最终被两个同源臂切除区域之外的序列互补结合。

该策略可直接鉴定杂合子和纯合子基因敲除创始人小鼠。如图所示，当优化实验方案的每一步时，转基因仔鼠的比例应达到10%至25%（随机整合），与CRISPR组分编辑小鼠基因组的能力相比，这一比例相对较低。使用CRISPR进行基因靶向时，创始人小鼠的比例通常更高，可达25%至100%；利用CRISPR编辑时，获得整窝仔鼠均成功实现纯合子的情况并不少见。

该技术开发完成后，可使神经科学或癌症等领域的研究人员利用新的掩模模型来发现病理机制，并最终将其转化为治疗策略。