Name: 通过显微注射卵母细胞生成转基因小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学习通过显微注射卵母细胞生成转基因小鼠的完整实验流程，掌握CRISPR基因靶向编辑与随机整合技术。本方案涵盖sgRNA制备、原核注射及基因型鉴定等关键步骤，约六周即可获得基因修饰小鼠，为发育生物学与疾病模型研究提供可靠技术支撑。

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作者感谢动物实验中心（BRC）工作人员的持续支持。本工作由国家卫生与医学研究理事会和澳大利亚研究理事会资助。

所有实验程序均已获得新南威尔士大学动物护理与伦理委员会的批准。
1. 转基因的制备（随机整合）
<ol>
	<li>分析性琼脂糖凝胶电泳
	<ol>
		<li>使用适当的限制性内切酶（孵育1小时）或快速消化酶（孵育15至30分钟），在PCR仪中按照制造商推荐条件对质粒进行消化，以切除目的转基因片段（参见 图2A 及其图注）。</li>
		<li>制备含0.5–1.0 µg/mL溴化乙锭（EtBr）的1%三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（TEA）琼脂糖凝胶。 
		注意：使用溴化乙锭（EtBr）时需谨慎，其为强效诱变剂。请使用适当的个人防护装备（参见材料安全数据表）。</li>
		<li>加载1 kb分子量标记物。</li>
		<li>加载线性化片段（即， 转基因和载体骨架</li>
		<li>以100 V电压电泳运行45分钟。</li>
		<li>在紫外（UV）透射仪上观察凝胶，以确认消化是否完全，并验证转基因片段的大小是否正确即， 7,338 bp；参见 图 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备型琼脂糖凝胶电泳
	<ol>
		<li>制备一块含低毒性凝胶染料的1% TAE琼脂糖凝胶。加入8份线性化转基因片段（每份1 µg），无需加入分子量标记物，于100 V电压下电泳运行45分钟。使用手术刀切下对应于线性化转基因的全部8条条带。</li>
		<li>使用凝胶回收试剂盒提取DNA，具体操作按照制造商的说明进行（参见 材料表).
		<ol>
			<li>在1.5 mL离心管中于50 °C下熔化凝胶碎片，至少15分钟。用异丙醇沉淀，然后加入结合缓冲液。</li>
			<li>将全部DNA通过移液操作合并至一个柱子中。用无核酸酶的显微注射缓冲液（8 mM Tris-HCl 和 0.15 mM EDTA）洗脱。经0.22 µm微型离心滤器过滤，于12,000 x g离心60秒。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用分光光度计测定DNA的浓度和质量。检查A260/A280比值是否约为1.8即， 无蛋白质污染），且A260/A230比值至少为2.0（即， 无有机溶剂污染）。用无核酸酶的显微注射缓冲液稀释至3 ng/µL，分装（20–50 µL），于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. CRISPR 组分的合成（基因靶向）
<ol>
	<li>Cas9 mRNA
	<ol>
		<li>稀释Cas9 mRNA（购自商业来源，参见材料清单） 材料表) 用无核酸酶的显微注射缓冲液稀释至浓度为 1 µg/µL。</li>
		<li>分装为2 µL，于-80 °C冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单导向RNA（SgRNA）。
	<ol>
		<li>使用计算设计工具筛选出理想的双靶点基因组序列（向导序列），确保其潜在的脱靶活性尽可能低17.
		<ol>
			<li>对于基因敲除，应系统性地选择两个位于目标基因起始密码子区域、相距数百个碱基对（bp）、方向相反的向导序列。 &#160;对于同源直接修复，应选择两个重叠的向导RNA（尽可能做到），&#160;相反方向 
			注意：例如，以下向导 RNA 最近已成功共注射，以破坏目标基因第一外显子 TPM4.2 基因： 
			引物1：5' CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3'； 
			引物2：5' CAGAACGATTGAGCTATGGC 3'</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按照以下描述订购一组引物 表1.</li>
		<li>合成线性DNA模板。
		<ol>
			<li>稀释 px33012 质粒用无核酸酶水稀释至10 ng/µL。</li>
			<li>按照指示制备主混合液 表1最后加入聚合酶，并将主混合液置于冰上。</li>
			<li>混合后分装至8个PCR管中（每管19 µL），每管加入1 µL的px330，按以下条件运行PCR：98 °C预变性1 min；98 °C变性10 s、64 °C退火30 s、72 °C延伸15 s，共40个循环；72 °C终延伸5 min，最后4 °C保存。</li>
			<li>使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物（参见 材料表），一个流体多通管以及一个真空源（用于加快处理速度）。应用最大真空强度（即， 8 mbar
			<ol>
				<li>向1体积的PCR样品中加入5体积（100 µL）结合缓冲液，并混匀。</li>
				<li>将（提供的）硅胶膜离心柱放入（提供的）2 mL收集管中用于离心，或置于真空装置上进行真空处理。为结合DNA，依次将全部8个样品加入离心柱中，每次加样后在12,000 × g条件下真空抽滤或离心60秒。</li>
				<li>洗涤时，向柱中加入0.75 mL洗涤缓冲液（Buffer PE），在12,000 × g条件下真空抽干或离心60秒。再于12,000 × g离心60秒，以彻底去除残留乙醇。</li>
				<li>将柱子放入一个洁净的1.5 mL微量离心管中。为洗脱DNA，向膜的中心加入30 µL无核酸酶水，静置1分钟，然后在12,000 g离心60秒。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>使用分光光度计测定浓度；通常浓度应达到100 ng/µL或更高。检查A260/A280比值是否约为1.8（即， 无蛋白质污染），且A260/A230比值至少为2.0（即， 无有机溶剂污染。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>体外 使用T7 RNA合成试剂盒进行转录。
		<ol>
			<li>按照指示制备主混合液，如以下所示 表1，置于PCR仪中37 °C孵育3小时。加入28 µL无核酸酶水和2 µL DNase I，继续在PCR仪中37 °C孵育15分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用离心柱进行RNA纯化
		<ol>
			<li>将提供的离心柱中的粉末溶于650 µL无核酸酶的显微注射缓冲液中，小心去除所有气泡。盖上管盖，在室温下水化5 - 15分钟。</li>
			<li>取下底部的蓝色盖帽，将柱子放入一个2 mL离心管中。在室温下以750 × g离心2分钟。将柱子转移至一个新的1.5 mL离心管中，将50 µL RNA溶液逐滴加至柱子中心，避免接触柱壁。以750 × g离心柱子2分钟。</li>
			<li>使用分光光度计测定RNA浓度（单次反应的典型产量为30 - 50 µg）。检查A260/A280比值是否约为2.0即， 无蛋白质污染），且A260/A230比值至少为2.0（即， 无有机溶剂污染）。将sgRNA储存于-80 °C，直至使用。</li>
			<li>使用常规用于DNA电泳的1% TAE凝胶评估RNA的质量。平行跑样200-400 ng的DNA模板和相应的sgRNA。RNA条带（≈100 bp）应略大于DNA条带（参见 图3A).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 供体模板
<ol>
	<li>订购商业合成的单链寡核苷酸（ssOligos，参见 材料表用于点突变或长达50 bp的小片段序列插入；同源臂通常为60–90 bp长。</li>
	<li>对于较大的插入片段，使用供体质粒作为模板。可通过经典克隆方法或 从头合成 从商业来源合成。 
	注意：建议每条同源臂至少为800 bp。骨架大小对同源定向修复（HDR）效率无影响。</li>
</ol>
4. 注射混合液
<ol>
	<li>使用无核酸酶的显微注射缓冲液将Cas9 mRNA稀释至50 ng/µL，将sgRNA稀释至12.5 ng/µL（总量为25 ng/µL），用于基因敲除实验。对于基于同源定向修复的基因组编辑实验，加入浓度为200 ng/µL的供体模板（ssOligo或质粒）。
	 
	注意：可使用在线工具（如重悬计算器18）轻松确定稀释体积。</li>
	<li>在显微注射过程中将每份样品置于冰上，并在使用后丢弃（切勿将注射混合物重新冷冻）。</li>
</ol>
5. 阴囊输精管结扎术
注意：小鼠常用的输精管结扎术有两种类型：腹腔式和阴囊式。后者侵入性较小，此前已有描述15。
<ol>
	<li>将所有不锈钢外科手术器械进行高压灭菌。</li>
	<li>使用电子天平称量小鼠体重，并通过腹腔（i.p.）注射麻醉剂（氯胺酮 100 mg/kg，赛拉嗪 10 mg/kg）对雄性小鼠进行麻醉。</li>
	<li>监测脚趾夹捏反射的消失，待小鼠进入镇静状态后，将其置于加热垫上。</li>
	<li>使用局部消毒剂（如氯己定）和70%乙醇交替擦拭对睾丸周围皮肤进行消毒。</li>
	<li>将睾丸推入阴囊囊内，用手术刀做皮肤切口。</li>
	<li>观察睾丸、附睾尾部及输精管。</li>
	<li>用镊子夹住输精管，固定后在镊子两侧进行电灼，切除约3 mm的输精管段。</li>
	<li>对另一侧睾丸执行相同操作。</li>
	<li>使用伤口夹关闭皮肤切口，并密切监测小鼠直至完全恢复。</li>
</ol>
6. 超数排卵（卵母细胞供体）与定时交配（假孕雌性）
注意：产生适量受精卵以及用于重新移植的插栓型代孕雌性动物的技术已在其他文献中描述15。
<ol>
	<li>在第1天约12点时，通过腹腔注射（i.p.）向10只雌性小鼠注射5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG；溶于100 µL中）。</li>
	<li>46–48小时后（第3天约11点），通过腹腔注射（i.p.）向雌性小鼠注射5 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG；溶于100 µL中）。</li>
	<li>立即在夜间将雌性小鼠与单独饲养的雄性小鼠合笼交配。</li>
</ol>
7. 原核（随机整合）和细胞质（基因靶向）注射
<ol>
	<li>通过颈椎脱位处死超排卵小鼠，暴露腹部，并如前所述获取卵巢和输卵管15在体视显微镜下解剖输卵管并收集卵丘-卵母细胞复合体（COCs）15将它们放入含有氨基酸的钾 simplex 优化培养基（KSOMaa）液滴中，采用传统方法进行操作15.</li>
	<li>使用移液管向KSOMaa培养基液滴中加入约1 µL透明质酸酶（10 mg/mL）以纯化卵母细胞，并将培养皿置于37 °C、5% CO₂培养箱中。2 孵育30秒至1分钟。</li>
	<li>用口吸管将卵母细胞在4滴新鲜的KSOMaa培养基中清洗，然后转移至最终一滴覆盖石蜡油（约2 mL）的KSOMaa培养基中。将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。2 孵育器中孵育，直至卵母细胞准备好进行显微注射。</li>
	<li>原核显微注射（随机整合）
	<ol>
		<li>在体视显微镜下观察卵子，使用吸管吹嘴将约50个卵子转移至注射室（覆盖矿物油的M2培养基液滴中）。</li>
		<li>将注射腔室转移至倒置显微镜下，向受精卵（可见两个原核）注射数皮升的注射混合液，靶向其中一个原核（任一原核均可）。通过观察原核的膨胀现象，确认注射成功。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞质注射（基因靶向）
	<ol>
		<li>用口吸管将约50枚卵转移至含有5 µg/mL细胞松弛素B的KSOMaa液滴中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育5分钟2 培养箱</li>
		<li>使用口吸管将卵转移到注射室中。</li>
		<li>使用自动显微注射仪，尽可能采用其补偿压力，在极低压力（50–100 hPa）下将数皮升注射混合物注入细胞质中。</li>
		<li>注射后，用口吸管将卵母细胞转移回 KSOMaa 液滴中，并置于 37 °C、5% CO₂条件下培养2 孵育器中，直至移植到假孕雌性动物的输卵管内。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 再植入
<ol>
	<li>将所有不锈钢外科手术器械进行高压灭菌。</li>
	<li>使用电子天平称量小鼠体重，并通过腹腔（i.p.）注射麻醉剂（氯胺酮 100 mg/kg，赛拉嗪 10 mg/kg）对雌性小鼠进行麻醉。</li>
	<li>监测脚趾夹捏反射的消失，待小鼠进入镇静状态后，将其置于加热垫上。</li>
	<li>剪除雌性小鼠背部中线周围较大范围的毛发。</li>
	<li>用局部消毒剂（如氯己定）和70%乙醇交替擦拭暴露的皮肤进行消毒。</li>
	<li>按照传统方法15暴露生殖道：沿背部中线做一条长约1 cm的皮肤切口，切开肌肉，用镊子夹住脂肪垫，然后轻轻牵拉卵巢，直至与其相连的输卵管和子宫清晰可见。</li>
	<li>用血管夹固定脂肪垫。在体视显微镜下观察输卵管，使用显微剪在壶腹部上游数毫米处的输卵管壁上做一切口。</li>
	<li>在体视显微镜下，将25个显微注射后的卵母细胞装入连接吹管的玻璃毛细管中（毛细管内径约为120 µm）。将玻璃毛细管插入输卵管，并缓慢推出内容物，直至在壶腹部内可见气泡。</li>
	<li>轻柔地取出玻璃毛细管，将生殖道复位回腹腔内。使用3-0不可吸收缝线缝合切口，再用伤口夹闭合。密切监测小鼠，直至其完全恢复。</li>
</ol>
9. 基因分型策略/测序
注意：按照相关动物伦理法规，从2毫米的尾部或耳部活检组织中分离基因组DNA。
<ol>
	<li>快速基因组DNA提取（随机整合）。
	<ol>
		<li>在100 µL碱性裂解试剂（25 mM氢氧化钠和0.2 mM EDTA，pH = 12）中，将组织样本（约2 mm）于95 °C裂解1小时。</li>
		<li>加入100 µL中和试剂（40 mM Tris-HCl，pH = 5）。</li>
		<li>在12,000 g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>高质量基因组DNA提取（基因靶向）。
	<ol>
		<li>加入500 µL尾部缓冲液（50 mM Tris，pH = 8；100 mM EDTA，pH = 8；100 mM NaCl；1% SDS和0.5 mg/mL蛋白酶K，新鲜添加）。</li>
		<li>于55 °C孵育过夜。</li>
		<li>通过倒置混合5分钟（勿涡旋振荡）。</li>
		<li>加入250 µL饱和NaCl溶液（6 M），并通过倒置混合5分钟（勿涡旋振荡）。</li>
		<li>在12,000 x g、4 °C条件下离心5–10分钟，将上清液倒入新管中。</li>
		<li>加入500 µL异丙醇，通过倒置混合5分钟（勿涡旋振荡）。</li>
		<li>在12,000 x g、室温下离心10分钟。</li>
		<li>倾去上清液（沉淀无色且紧贴管壁）。</li>
		<li>用1 mL 70%乙醇洗涤。</li>
		<li>在12,000 x g、室温下离心5–10分钟，小心移除上清液，因白色沉淀不再黏附，易丢失。</li>
		<li>室温晾干约1小时。</li>
		<li>加入400 µL TE缓冲液（10 mM Tris和1 mM EDTA，pH = 8）。</li>
		<li>在55–60 °C下溶解DNA 2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>引物设计。
	<ol>
		<li>使用计算工具设计至少20 bp长的引物19。 
		注：对于随机整合，引物应与转基因序列杂交，产生200–800 bp的特异性片段。对于基因靶向，应设计与基因组DNA杂交的引物，产生在切割位点周围数百bp的特异性片段。对于大片段插入，引物可位于转基因序列上，但应随后通过引物步移或类似技术确认靶向整合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR基因分型。
	<ol>
		<li>针对每种基因组修饰，设计新的PCR方案并进行实证测试。需考虑扩增片段的长度以及每对引物的熔解温度（Tm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测序。
	<ol>
		<li>对于基因靶向，将PCR产物送至Sanger测序服务提供商进行测序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者通过新南威尔士大学马克·温赖特分析中心提供小鼠的学术转基因服务。

方案中的关键步骤
制备基因修饰小鼠通常被认为在技术上具有挑战性。然而，本文介绍的方案是一种经过优化和简化的实验方法，可帮助研究者在最短时间内掌握并解决该技术中的问题。成功完成该技术需要两个关键步骤。首先，在合成线性DNA模板（用于合成sgRNA）时，可以不使用氯化镁（MgCl2）。但强烈建议在总反应体系中系统性地添加MgCl2，因为在缺乏MgCl2的情况下，正向引物常常无法实现部分杂交。此外，在靶向整合的情况下，必须确保供体模板的任何区域都不包含目标基因组序列，否则Cas9核酸酶将切割该模板，从而阻止同源定向修复（HDR）的发生。
修改与故障排除
尽管这种用于制备基因修饰小鼠的方案经过多年优化和简化，但在显微注射用高质量卵母细胞的产量以及假孕雌鼠的交配栓查率方面仍有一些注意事项。背景品系的选择对于一次显微注射实验所能获得的活产仔鼠数量至关重要。C57BL/6 是疾病小鼠模型中最常用的背景品系。然而，就对显微注射的耐受性...

动物模型，包括脊椎动物和无脊椎动物，在研究阿尔茨海默病等人类疾病的病理生理机制方面发挥了重要作用1,2。它们也是寻找疾病修饰因子并最终开发新型治疗策略以实现治愈的宝贵工具。尽管每种模型都有其内在局限性，但将动物作为完整的系统性模型对生物医学研究至关重要，因为组织培养无法完全模拟机体的代谢和复杂的生理环境。
迄今为止，小鼠仍然是用于基因操作最常见的哺乳动物物种，因其具备多项优势。小鼠与人类在疾病相关的生理过程和基因方面具有高度保守性。小鼠是首个完成全基因组测序的哺乳动物（2002年），比人类基因组测序完成早一年（2003年）。除丰富的遗传信息外，小鼠还具有良好的繁殖能力、快速的发育周期（从受精到断奶仅需6周）以及适中的体型。这些优势，加上毛色等明显的生理指标（对杂交策略至关重要），使小鼠成为基因操作的理想模型。值得注意的是，在现代遗传学发展的早期，格雷戈尔·孟德尔（Gregor Mendel）在转向植物研究之前，最初的研究对象就是小鼠3。
基因转移技术在三十多年前首次成功制备出转基因小鼠4，最初采用的是病毒递送方法。然而，研究人员很快意识到，小鼠转基因技术面临的主要挑战之一是无法控制外源DNA的命运。由于通过病毒将转基因递送至小鼠卵母细胞会导致多个拷贝随机整合到基因组中，因此后续建立稳定转基因品系的可能性受到限制。
当戈登 等 通过显微注射技术建立了首株转基因小鼠品系5,6这标志着重组DNA技术时代的开始，影响显微注射实验结果的参数已得到广泛研究。7尽管显微注射无法控制外源基因在基因组中的整合位点（最终导致每只 founder 小鼠的特异性表达水平不同），但原核显微注射的主要优势仍在于能够形成串联重复整合的多拷贝片段（concatemers）即， 串联排列的多个转基因拷贝阵列，在基因组整合之前5这一特性多年来被用于建立数千个过表达目的基因的转基因小鼠品系。此后，转基因技术（即对生物体基因组的人工改造）被广泛应用于鉴定单个基因在疾病发生中的作用。
在小鼠基因组操作领域，另一项重要成就是 Mario Capecchi 成功实现了小鼠单个基因的失活，由此开启了基因靶向时代8然而，基于ES细胞的基因靶向技术很快显现出主要缺点，包括ES细胞培养的困难、嵌合程度的不稳定性以及实验周期较长等问题即， 获得小鼠所需的最短时间，最少12-18个月。
近年来，新技术的进步，例如工程化核酸内切酶（例如， 锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）已成为加速小鼠基因靶向过程的替代方法9,10这些内切核酸酶可通过显微注射直接注入小鼠卵母细胞，从而在短短6周内即可获得基因靶向小鼠。
自从首次报道利用CRISPR进行基因组编辑以来11，这种细菌的适应性免疫系统因其诸多优势已取代了ZFN和TALEN，这些优势包括易于合成以及能够同时靶向多个位点（称为&#34;multiplexing&#34;）。CRISPR首次被用于小鼠的基因靶向12，此后已广泛应用于从植物到人类的无数物种13,14。迄今为止，尚无任何物种对CRISPR基因组编辑具有抗性的报道。
转基因小鼠制备过程中的两个主要限制性步骤是卵母细胞的注射以及将这些卵母细胞重新植入假孕雌鼠体内。尽管该技术已被我们15及其他研究者16所描述，但近年来小鼠胚胎学和基因转移技术方面的最新进展已彻底革新了遗传修饰小鼠的制备流程。本文将介绍这些技术改进。

<table><tbody><tr><td>微量移液器 0.1-2.5 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000016</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 2 - 20 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000040</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 20 - 200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000067</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 100 - 1,000 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000083</td><td></td></tr><tr><td>分子量标记物&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33025</td><td>HyperLadder 1 kb</td></tr><tr><td>分子量标记物&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33056</td><td>HyperLadder 100 bp</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93296</td><td>10x - 稀释至 1x</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe 凝胶染料</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒 (Qiaquick)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>真空系统（多孔板）</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶显微注射缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MR-095-10F</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC 微型离心过滤器&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 mRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS9MRNA</td><td></td></tr><tr><td>表达 CRISPR 的质粒 (px330)</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T7 快速高效 RNA 试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td></td></tr><tr><td>RNA 纯化离心柱 (NucAway)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>单链寡核苷酸 (ssOligos)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO STANDARD</td><td></td></tr><tr><td>供体质粒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>KSOMaa 胚胎培养基</td><td>Zenith Biotech&amp;nbsp;</td><td>ZEKS-100</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Zenith Biotech&amp;nbsp;</td><td>ZSCO-100</td><td></td></tr><tr><td>M2 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素 B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>吹吸管口</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细移液管</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Applichem</td><td>A3830.0100</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪刀</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>血管夹</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18374-43</td><td></td></tr><tr><td>伤口夹&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>夹子施加器&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>12018-12</td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>电凝器</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>不可吸收外科缝线 (Ethilon 3-0)</td><td>Ethicon</td><td>1691H</td><td></td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>MG Scientific</td><td>Galaxy 14S</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Eppendorf</td><td>6321 000.515</td><td></td></tr><tr><td>电泳装置</td><td>BioRad</td><td>1640300</td><td></td></tr><tr><td>紫外透射仪</td><td>BioRad</td><td>1708110EDU</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Eppendorf</td><td>6334000069</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>双通道显微操作仪</td><td>Eppendorf</td><td>5188000.012</td><td></td></tr><tr><td>卵母细胞操作仪</td><td>Eppendorf</td><td>5176000.025</td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪 (Femtojet)</td><td>Eppendorf</td><td>5247000.013</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 C57BL/6J 品系</td><td>Australian BioResources</td><td>C57BL/6JAusb&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

转基因小鼠的使用已显著推动了生理学与病理学研究 体内 过程。将DNA表达载体注射到受精卵原核中，仍是制备用于过表达的转基因小鼠最常用的技术。随着CRISPR技术在基因靶向中的应用，原核注射技术已扩展至基因敲除和基因敲入小鼠的制备。本文详细描述了注射用DNA的制备以及用于基因靶向的CRISPR引导RNA的构建，特别强调质量控制环节。鉴定潜在 founder 小鼠所需的基因分型步骤至关重要。本文还介绍了利用CRISPR“多重检测”能力的创新性基因分型策略。同时概述了相关手术操作。本实验方案的各个步骤共同实现了基因修饰小鼠的制备，并为进一步建立适用于多种研究领域的鼠群提供了支持，这些领域包括免疫学、神经科学、癌症、生理学、发育生物学等。

以下描述了随机整合和CRISPR介导的基因靶向两种情况下的显微注射工作流程（图1）。
<img alt="CRISPR基因靶向工作流程；显微注射装置；sgRNA合成；PCR基因分型示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：基因修饰小鼠制备的典型工作流程。 对于随机整合，将纯化的转基因片段注射到受精卵的原核中，随后将胚胎移植至交配后发现阴栓的假孕雌鼠的输卵管内。子代的分析通过快速提取基因组DNA后进行PCR检测完成。对于CRISPR基因靶向，采用本文所述的免克隆方法合成sgRNA，并将两个向导RNA（sgRNA）与Cas9 mRNA共同注射到受精卵的细胞质中。...

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。

转基因小鼠的使用已显著推动了对生理和病理体内过程的研究。原核……

本方案的总体目标是描述通过卵母细胞显微注射成功制备转基因小鼠所需的操作步骤。该方案可为从事小鼠制备领域以及基因靶向研究的研究人员和技术人员提供帮助。该技术的主要优势在于，它依赖于对小鼠卵母细胞的直接注射，既可用于随机整合，也可用于基因靶向，从而可在短短六周内获得基因修饰小鼠。制备单个向导RNA时，在选定所需的两个靶序列并根据文本方案设计引物后，通过将PX330质粒稀释至每微升10纳克的无核酸酶水中来合成线性DNA模板。配制总反应混合液，最后加入聚合酶，并置于冰上保存。随后将溶液混匀并分装至八个PCR管中。每管加入 1 微升 PXR330，并运行以下程序。接着使用 PCR 纯化试剂盒、多联过滤装置和真空泵纯化 PCR 产物。向 1 体积的 PCR 样品中加入 5 体积的结合缓冲液并混匀。将硅胶膜离心柱置于真空 manifold 上。为结合 DNA，在真空条件下将全部八个样本加入离心柱中。为洗涤样本，向离心柱中加入 0.75 毫升洗涤缓冲液，并进行真空抽滤。然后，以 12,000 × g 离心 60 秒，以去除残留乙醇。将柱子放入一个洁净的 1.5 毫升微量离心管中，然后在膜的中心加入 30 微升无核酸酶水以洗脱 DNA。静置柱子 1 分钟，然后以 12,000 × g 离心 60 秒。然后使用分光光度计测定DNA浓度。使用T7 RNA合成试剂盒进行体外转录时，配制总反应体系，并在37摄氏度的热循环仪中孵育反应3小时。加入28微升无核酸酶水和2微升DNase I，再将反应孵育15分钟。为了纯化RNA，将提供的离心柱中的粉末溶解于650 µL无核酸酶的微注射缓冲液中。仔细去除所有气泡后，盖上管盖，在室温下水化溶液5至15分钟。取下底部的蓝色盖子，将离心柱置于一个2 mL离心管中。然后在室温下以750 × g离心2分钟。随后将柱子放入一个新的1.5毫升离心管中，并将50 µL RNA溶液逐滴加入柱子中心，注意不要接触柱壁。接着以750 × g离心2分钟。根据文本方案测定RNA浓度并评估RNA质量。使用无核酸酶的显微注射缓冲液，将case nine mRNA稀释至50纳克/微升，将sgRNA稀释至12.5纳克/微升，用于基因敲除实验。对于基于同源定向修复的基因组编辑，加入浓度为200纳克/微升的供体模板，并置于冰上保存。使用移液器吹吸装置，用四滴新鲜的酪蛋白氨基酸溶液清洗卵母细胞，并将其转移至一滴覆盖矿物油的酪蛋白八号培养基终末液滴中。为进行原核显微注射以实现随机整合，在体视显微镜下，使用移液器吹吸装置将约50个卵母细胞转移至一滴覆盖矿物油的M2培养基液滴中，该液滴将作为注射腔室。将注射腔转移至倒置显微镜下，向受精卵母细胞中注射数皮升的注射混合液。若注射成功，原核将出现肿胀。进行细胞质注射以实现基因靶向，使用口控移液装置将约50枚卵转移至含有细胞松弛素B（5微克/毫升）的casome A液滴中，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5分钟。将卵子转移至注射室，然后在极低压力下，使用自动显微注射仪的补偿压力（尽可能启用），向细胞质内注射数皮升的注射混合液。注射完成后，用口控移液装置将卵母细胞转移回一滴氨基酸溶液中。将它们置于37°C和5%二氧化碳条件下培养，直至准备移植到假孕雌鼠的输卵管中。根据文本方案麻醉一只已交配栓塞的雌性小鼠后，在无菌条件下进行移植操作：使用手术刀沿背部中线做一长约1厘米的平行切口，暴露生殖道；然后用剪刀剪开肌肉层，并用镊子夹住脂肪垫。轻轻拉出卵巢，直至其相连的输卵管和子宫清晰可见。然后使用血管钳固定脂肪垫。在体视显微镜下，用一对显微剪在输卵管壁上进行剪切，切口位于壶腹部上游几毫米处。同时，在体视显微镜下，将25枚显微注射后的卵子装入与吹管相连的玻璃毛细管中。然后，将玻璃毛细管插入输卵管，并推出卵子，直至在壶腹部可见气泡。为确认再移植操作成功，必须检查壶腹部是否存在气泡，该气泡可确保所有卵子均已准确排出至正确位置，且玻璃毛细管内无残留卵子。轻轻取出玻璃毛细管，将生殖道放回腹腔内。然后使用三根0号不可吸收外科缝线缝合切口，再用伤口夹闭合皮肤。将小鼠置于加热垫上以防止低体温，并皮下注射镇痛剂。监测小鼠直至完全恢复。最后，根据文本方案进行基因组分型和测序。该图显示了用于分析转基因纯化质量和sgRNA合成的凝胶电泳结果，这两者对于成功制备基因修饰小鼠至关重要。此处显示的是随机整合显微注射实验的典型结果。用于基因型鉴定的引物应位于转基因序列上，并设计为扩增出长度为 200 至 800 个碱基对的片段。在此基因靶向结果中，所选引物可与基因组 DNA 中最终被两个识别位点切除区域之外的序列特异性杂交。该策略可直接鉴定杂合子和纯合子基因敲除创始人小鼠。如图所示，当优化本方案的每一步骤后，转基因仔鼠的比例应达到10%至25%（随机整合），与CRISPR组分编辑小鼠基因组的能力相比，该比例相对较低。采用CRISPR进行基因靶向时，创始人小鼠的比例通常更高，范围为25%至100%；使用CRISPR编辑时，获得整窝成功纯合子后代的情况并不少见。该技术开发后，可使神经科学或癌症等领域的研究人员利用新的掩模模型来发现病理机制，并最终将其转化为治疗策略。

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卵母细胞在减数分裂成熟过程中由于染色体分离错误而容易发生非整倍性。非整倍体卵子可导致不孕、流产或唐氏综合征等发育障碍。本文介绍了将目标物质导入卵母细胞的方法，以及研究减数分裂成熟过程和评估倍性的方法。...

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本视频介绍了将慢病毒载体注射到受精小鼠胚胎的卵周隙中的原核显微注射技术。该慢病毒含有转基因，可整合到受精胚胎的基因组中，最终产生转基因小鼠。...

基于慢病毒载体的卵周隙注射：一种将目的基因导入受精单细胞小鼠卵母细胞的方法

锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等设计核酸酶可通过激活非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）通路，对小鼠着床前胚胎的基因组进行修饰。这些技术进步使得能够快速生成具有精确遗传修饰的小鼠。...

利用设计核酸酶进行小鼠基因组编辑

本文介绍了一种通过特异性siRNA介导的mRNA耗竭，随后进行免疫荧光分析，以评估小鼠卵母细胞中减数分裂纺锤体组装与结构的实验方案。该方案适用于 体外...

通过siRNA介导的沉默技术评估小鼠卵母细胞中的减数分裂纺锤体

本实验方案旨在描述一种功能缺失和功能获得的方法，可用于鉴定新生素（neogenin）作为植入前小鼠胚胎中滋养外胚层和内细胞团分化的阶段特异性受体。...

利用功能缺失与功能获得方法研究小鼠着床前胚胎早期细胞命运决定因子

随着与人类疾病相关的遗传变异逐渐被揭示，开发能够快速评估这些已鉴定变异生物学意义的系统变得日益重要。本方案描述了利用小鼠卵母细胞评估人类基因在女性减数分裂Ⅰ期中功能的方法。...

利用小鼠卵母细胞评估人类基因在减数分裂Ⅰ期的功能

本文介绍一种通过将慢病毒载体直接注射到受精卵的卵周隙中，以高效促进外源基因整合并制备首建者转基因小鼠的实验方案。...

慢病毒介导的转基因小鼠制备：一种用于直接研究 Founder 小鼠的简单高效方法

本文介绍了一种改良的一细胞胚胎冷冻保存方法，以及一种将冻融胚胎与电穿孔技术相结合的方案，用于高效制备基因修饰小鼠。...

利用冻融胚胎高效制备基因修饰小鼠

本实验方案描述了通过向受精卵显微注射CRISPR-Cas9系统和供体DNA，高效制备基因盒敲入和条件性敲除（floxed）小鼠的方法。...

通过受精卵显微注射在小鼠中构建基因盒敲入和Flox等位基因

本方案描述了显微注射及 体内...

利用体细胞基因组编辑小鼠模型 体内 显微注射与电穿孔

基因组编辑改进效率 通过 输卵管核酸递送（I-GONAD）方法与传统显微注射技术相当，后者需要从供体雌性动物中收集受精卵，并将其移植到假孕雌性动物体内。本方案通过引入CRISPR/Cas9诱导的突变，证明了该方法的有效性 ROSA26...

基因组编辑技术的改进 通过 基于输卵管核酸递送的 在体 内 电穿孔技术用于基因敲除小鼠的制备

学习通过显微注射卵母细胞生成转基因小鼠的完整实验流程，掌握CRISPR基因靶向编辑与随机整合技术。本方案涵盖sgRNA制备、原核注射及基因型鉴定等关键步骤，约六周即可获得基因修饰小鼠，为发育生物学与疾病模型研究提供可靠技术支撑。

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

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