通过显微注射卵母细胞生成转基因小鼠

该方案的总体目标是描述通过显微注射卵母细胞成功生成转基因小鼠所需的程序。该方案可以帮助参与小鼠发生领域和基因靶向领域的研究人员和技术人员。该技术的主要优点是它依赖于小鼠卵母细胞的直接注射，既用于随机整合，也可用于基因靶向，允许在短短六周内产生转基因小鼠。

为了制备单向导 RNA，在选择所需的两个靶序列并根据文本方案制备引物后，通过在无核酸酶的水中将 PX330 质粒稀释至 10 ng/μL 来合成线性 DNA 模板。制备预混液，最后加入聚合酶，并保持在冰上。然后将溶液混合并分成八个 PCR 管。

每管加入 1 微升 PXR330，然后运行以下程序。接下来，使用 PCR 纯化试剂盒、歧管和真空源纯化 PCR 产物。向 1 体积的 PCR 样品中加入 5 体积的结合缓冲液并混合。

将硅膜离心柱放在歧管上。要结合 DNA，请在真空中将所有 8 个样品都涂到色谱柱上。要洗涤样品，向色谱柱中加入 0.75 mL 洗涤缓冲液并抽真空。

然后，将色谱柱以 12， 000 倍 G 离心 60 秒以去除残留乙醇。将色谱柱放入干净的 1.5 mL 微量离心管中，然后，为了洗脱 DNA，在膜中心加入 30 μL 不含核酸酶的水。让色谱柱静置 1 分钟，然后以 12， 000 倍 G 离心 60 秒。

然后使用分光光度计测量 DNA 浓度。要使用 t7 RNA 合成试剂盒进行体外转录，请制备预混液并在 37 摄氏度的热循环仪中孵育反应 3 小时。加入 28 μL 无核酸酶水和 2 μL DNAse one，再孵育反应 15 分钟。

要纯化 RNA，请溶解提供的离心柱中包含的粉末和 650 μL 无核酸酶微量注射缓冲液。小心去除所有气泡，盖上试管并在室温下将溶液水合 5 至 15 分钟。取下底部的蓝色盖子，将色谱柱放入 2 mL 试管中。

然后在室温下以 750 倍 G 离心管 2 分钟。然后将色谱柱放入新的 1.5 mL 试管中，将 50 μL RNA 溶液滴加到中心，不要接触色谱柱壁。然后，以 750 倍 G 离心色谱柱 2 分钟。

根据文本方案测量 RNA 浓度并评估 RNA 的质量。使用不含核酸酶的微量注射缓冲液，将 9 个 mRNA 稀释至 50 ng/μL，将 sgRNA 稀释至 12.5 ng/μL，用于基因敲除实验。添加浓度为 200 ng/μL 的供体模板，用于基于同源直接修复的基因组编辑，并将其保存在冰上。

使用吸气器咬嘴，用四滴新鲜的酪蛋白氨基酸清洗卵母细胞。并将它们转移到最后一滴 casome 8 培养基中，上面覆盖矿物油。为了进行随机积分的 pro 核注射，在立体显微镜下，使用吸气器咬嘴将大约 50 个鸡蛋转化为一滴 m 2 培养基，上面覆盖着将用作注射室的矿物油。

将注射室转移到倒置显微镜上，用几皮升的注射混合物注射受精卵母细胞。如果注射成功，前核会肿胀。进行细胞质注射以进行基因靶向，使用咬嘴将大约 50 个卵子转移到一滴含有 5 微克/毫升细胞松弛素 B 的溶果体 A 中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育卵子 5 分钟。

将卵子转移到注射室，然后在非常低的压力下，将几皮升的注射混合物注射到细胞质中。尽可能使用自动显微注射器的补偿压力。注射后，使用咬嘴将卵母细胞转移回一滴 casomeamino acids。

将它们保持在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下，直到它们被装载以重新植入假怀孕女性的输卵管中。根据文本方案麻醉堵塞的雌性小鼠后，为了在无菌条件下进行重新植入，使用手术刀将生殖道暴露到平行于背中线的一厘米长切口上。然后，用剪刀剪断肌肉，用镊子抓住脂肪垫。

轻轻拉出卵巢，直到其附着的输卵管和子宫清晰可见。然后用容器夹固定脂肪垫。在立体显微镜下，用一把微型剪刀在输卵管壁上切开一个切口，距离壶腹上游几毫米。

此外，在立体显微镜下，将 25 个微量注射的鸡蛋加载到连接到咬嘴的玻璃毛细管中。然后，将玻璃毛细管插入输卵管并排出卵子，直到壶腹内可见气泡。为确保重新着床成功，您必须检查壶腹中是否存在气泡，这可以保证所有卵子都已排出到正确的位置，并且没有卵子留在玻璃毛细管中。

轻轻去除玻璃毛细管，将生殖道放回腹部。然后使用三根零、不可吸收的手术缝合线缝合切口，然后使用伤口夹闭合皮肤。将鼠标放在温暖的垫子上以避免体温过低，并皮下注射镇痛药。

监视鼠标，直到完全恢复。最后，根据文本方案进行基因组分型和测序。该图显示了分析凝胶，证明了转基因纯化和 sgRNA 合成的质量，这对成功生成转基因小鼠至关重要。

此处显示的是用于随机积分的微注入会话的典型读数。基因分型引物应位于转基因上，并且应设计为产生 200 至 800 个碱基对的片段。在基因靶向的读数中，选择与区域外的基因组 DNA 杂交的引物最终被两个家伙切除。

该策略允许直接识别杂合子和纯合子敲除创始人。如此处所示，当方案的每个步骤都经过优化时，随机整合的转基因幼崽的百分比应达到 10% 至 25%，与 CRISPR 组件编辑小鼠基因组的能力相比，这有点低。使用 CRISPR 进行基因靶向，创始人的数量通常较高，从 25% 到 100% 不等使用 CRISPR 编辑时获得成功纯合子的整个后代并不少见。

开发后，该技术允许神经科学或癌症等领域的研究人员使用新的掩模模型来发现病理机制，并最终将其转化为治疗策略。