小鼠基因组工程使用Designer核酸酶

该程序的总体目标是在设计尾部核酸酶或爪子的帮助下快速生成基因缺陷小鼠。这是通过首先设计和组装编码特定爪对的 DNA 构建体来实现的，这些 DNA 构建体用作体外转录生成 Talon mRNA 的模板。该程序的下一步是分离受精的小鼠细胞，然后用 T 显微注射它们。最后一步是通过手术将注射的细胞转移到假怀孕的养母体内。

得到的 F 零后代经常显示基因组序列的位点特异性缺失，这通常会导致靶基因功能的丧失。虽然这里介绍的方法可以深入了解小鼠的基因功能，但基本方法也可以适用于其他模式生物，如大鼠和鱼类。首先，访问网站上的 TAL 效应核苷酸靶向网站。

选择 TN targeter 程序并粘贴目标基因的序列。对于此协议。使用 ad 基因上可用的 P-C-A-G-T 7 TALEN 表达构建体以及 golden gate Talen 和 T 效应器试剂盒。

如果 Talen 使用其他构建体或组装套件，则最佳垫片长度和尾部 RV 数量的组装设置可能不同，请在使用预设架构设置下选择 Miller Etal 2011 选项。然后选择 NN 在 G substitute 选项卡。程序会生成一个文本文件，其中包含从此列表生成的潜在目标站点。

选择所需的 Talen 对或对，然后继续进行 Golden gate 组件。该方案适用于最常用的实验室小鼠品系，包括 C 57、BL、6 J 和 BDF，1 个超级排卵 10 个供体雌性，在 4 周龄时使用 5 个单位的妊娠母马血清促性腺激素。48 小时后给雌性 5 单位的人绒毛膜促性腺激素也通过腹腔注射后立即注射人绒毛膜促性腺激素注射伴侣，雌性与繁殖年龄雄性在同一天一对一，准备假孕养母。别人。

第二天早上，处死雌性并通过解剖 ucts 来恢复受精的卵母细胞。然后将卵母细胞束释放到含有一毫升 M 2 培养基的器官培养皿中。通过在 M 2 培养基中加入 10 微升 0.1% 牛透明质酸酶溶液到含有细胞离合器的培养皿中，去除所有卵丘细胞。

然后使用口腔移液器通过两次或三次更换 M 2 培养基来洗涤胚胎，以去除透明质酸酶。继续对尚未从卵丘细胞解离的胚胎进行透明质酸酶处理。分离的胚胎可以储存在 M 16 中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养基中，直到它们被显微注射。

准备 100 微升注射液，每微升每条尾部含有 10 纳克。核酸酶、mRNA 配对并以 30， 000 G 离心 30 分钟以沉淀。任何可能堵塞注射针的颗粒。

然后将混合物放在冰上。计划在下午早些时候注射原核期的卵母细胞。将大约 100 个胚胎浸入一层矿物油下的 M 两种培养基中，并在没有 marsy DIC 光学元件的倒置显微镜上工作。

在 20 倍放大倍率下，选择具有不同原核的细胞。卵母细胞的分选可以使用空注射毛细血管来完成，在注射毛细血管与 1 到 2 μL 注射液一起使用之前加载注射毛细血管。然后将其连接到显微注射头上。

然后用固定毛细管吸出选定的细胞，并将核酸酶 mRNA 浅注射到细胞质中。避免接触原核。注射量应保持较低。

在细胞质膨胀的第一个迹象时，拔出针头。正常情况下，大约 80% 到 90% 的胚胎应该可以存活，而不会立即存活。为了增加注射的 mRNA 量，在显微注射可用细胞后使溶液更加浓缩。

使用口腔移液器将它们转移到 M 16 培养基中。将胚胎在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育一小时。然后将幸存下来的那些转移到假怀孕的养母身上。

在显微注射前一天，通过将 3 至 6 个月大的 CD 1 雌性小鼠与 VAs 扇形雄配来诱导假性妊娠。第二天早上，选择带有透明 atory 栓的雌性用作胚胎受体。未使用的雌性将在三周内从假怀孕状态恢复，之后可以重复使用。

将麻醉的养母雌性放在其腹部温暖的表面上。然后用 70% 乙醇喷洒切口区域消毒。将湿毛发从计划的切口部位梳开。

现在用剪刀切开腹膜腔，将子宫角外化。要做到这一点。拉上附着在卵巢上的脂肪垫，用斗牛犬夹固定生殖器官。

此外，请务必用加热的 0.9% 氯化钠溶液保持器官湿润。此时，对 12 到 20 个活胚胎进行分类，并将它们加载到薄玻璃毛细管中。首先使用口腔移液器吸出一个小气泡，然后用细镊子吸出胚胎。

轻轻抓住放大器上游的 UCT，并使用 30 号针在 UCT 壁上打一个小孔。将加载的毛细管插入孔中，轻轻地将胚胎吹入放大器中，直到您看到气泡已从毛细管中移出。然后取出毛细管。

立即将生殖器官放回体腔中，并用单针缝合腹膜腔。接下来，使用一个或两个 9 毫米的伤口夹子闭合皮肤。将动物放回笼子并监督她，直到麻醉消失。

然后将雌性安置在两到三只小鼠的稳定社会群体中，以尽量减少术后前三天的压力，确保在小鼠基因组中以设计核酸酶为目标的每只蝗虫的饮用水中提供像 DEF Falcon 这样的镇痛剂。基于 PCR 的检测旨在识别携带所需突变等位基因的创始动物。在第一个例子中，创始人来源于尾部核酸酶对的显微注射。

通过 PCR 产物的 T 7 核酸内切酶消化分析靶向小鼠朊病毒蛋白基因的包被区域。T 7 核酸内切酶消化测定依赖于突变和野生型等位基因产生的 PCR 产物的 DNA 链之间异源双链体的形成。除了全长 PCR 产物外，还出现了 250 和 110 个碱基配对的长消化产物，揭示了 Talon 诱导的单个创始人的目标基因组区域内的诱变。

或者，如果合适的诊断限制性酶切位点位于设计核苷酸酶对的间隔区内，则可以对 PCR 产物进行限制性消化。在第二个示例中，ZFN 靶向位于介绍中的 XPO one 限制性位点，即小鼠 Rosa 26 基因座之一。这里未消化的条带表明存在突变。

星号标记，没有任何消化产物强烈表明创始人在目标基因的两个等位基因中携带突变。这些未消化的 PCR 产物的克隆和测序表明，创始小鼠可以携带目标等位基因的两个或多个不同修饰。野生型序列的缺失表明靶基因完全消融。

看完这个视频，你应该对尾部核酸酶的设计、尾部的组装、核酸酶构建体以及如何使用它们通过直接外显微注射生成突变小鼠有了很好的了解。该方法适用于其他类别的设计核酸酶，例如锌、指核或 CAS 九 crispr。它还可以通过同时共注射核酸酶和适当的基因靶向模板，通过同源重组来促进基因组修饰。