利用固态核磁共振波谱法对大分子组装体进行原子尺度结构研究

本实验方案的总体目标是利用魔角旋转固体核磁共振波谱技术，在原子分辨率水平上研究不溶性且非晶态的超分子蛋白质组装体的结构。我们将介绍利用固体核磁共振技术研究生物大分子蛋白质组装体原子结构的关键方法步骤。由于这些组装体本质上不溶且不具有晶体结构，对其原子结构的研究极具挑战性。

固态核磁共振是一种新兴技术，能够在不受组装物体尺寸或溶解度限制的情况下，以原子级分辨率研究分子结构和动力学。本文展示了利用固态核磁共振可视化生物大分子蛋白组装体原子结构的关键步骤，包括同位素标记样品的制备、固态核磁共振结构数据的采集与分析。固态核磁共振实验流程的第一步是制备¹³C、¹⁵N标记的蛋白亚基，并在体外进行组装。

挑取一个转化后的 E.coli 菌落，接种于 15 ml 预热的 LB 培养基中，37 摄氏度、200 RPM 振荡培养过夜。接种主培养物时，将整个预培养物转移至一升含有同位素标记的碳源和氮源的预热 N9 培养基中。

可包括含N15标记的氯化铵、均匀C13标记的葡萄糖、特异性C13标记的葡萄糖或特异性C13标记的甘油。在37摄氏度下孵育，并在培养物变浑浊后立即于600纳米处测定光密度。当OD值达到0.8时，加入0.75毫摩尔的IPTG诱导蛋白表达，持续4小时。请注意，不同蛋白的最佳诱导条件可能有所不同。

在 6,000 G 和 4 摄氏度条件下离心 30 分钟，回收细胞。蛋白亚基纯化后，在体外进行组装。使用离心过滤装置将蛋白浓缩至约 1 毫摩尔浓度。

为此，将样品加入滤过装置中，在4,000 G条件下离心30分钟。每次离心步骤之间，用移液器轻轻混匀滤过装置中的溶液，以避免蛋白质在滤膜上沉积。重复此操作，直至达到所需浓度。

将样品转移至离心管中，在室温下振荡孵育一周。通常，亚基聚合形成丝状结构会伴随溶液变浑浊。加入0.02%（质量/体积）叠氮化钠以防止细菌污染。

为收获蛋白质组装体，将样品在 20,000 G 和 4 °C 条件下离心一小时。吸除大部分上清液，仅保留足以覆盖表面的液体以避免样品干燥，并将样品在 4 °C 下保存至检测前。我们将介绍通过固态核磁共振进行结构分析所必需的关键实验。

通过检测C13核的一维交叉极化（CP）和INEPT实验，可分别用于检测组装体中刚性与柔性蛋白质片段，并用于评估结构均一性程度及局部多态性。此处，我们采用标准实验参数值。

典型的参数范围在方案中已注明。按照方案所述，将转子插入核磁共振磁体中，并启动魔角旋转。设定所需的旋转频率，并确保频率稳定在±10赫兹范围内。

使用16次扫描记录一次脉冲的一维质子谱。设置1D质子碳CP实验。CP实验可显示来自刚性构象残基产生的信号。初始实验参数取自参考化合物的标准优化流程。

当灵敏度足够高时，可在样品中优化脉冲校准和去耦参数。此处，我们采集了16次扫描的交叉极化（CP）谱图。CP接触时间及功率水平的选择依据为信号强度最大化，如本例中CP接触时间优化所示。

本示例中的最大强度出现在 800 毫秒处。此外，还应从参考化合物校准最初设定的参数重新调整去耦参数。最后，需仔细观察在给定魔角旋转频率（此处为 18 千赫兹）下旋转边带的定位，以避免其与信号发生重叠。

记录一个参考的一维质子碳交叉极化（CP）谱，作为一维光谱指纹。此处，我们累积128次扫描，交叉极化接触时间为800毫秒，去耦强度为100千赫兹，循环延迟为3秒，采样时间为20毫秒。对CP实验进行处理时，不使用任何窗函数。

选择一个孤立的峰来估算样品中的C39，以反映结构的有序性和均一性。此处，以半高全宽测量的线宽约为60至70赫兹，表明该组装体中的蛋白质结构具有良好的有序性。设置一维质子-碳INEPT实验，以探测蛋白质组装体中高度流动的部分。

记录一个参考的INEPT实验，以作为移动蛋白片段的指纹。典型参数为128次扫描，采集时间为25毫秒。处理质子-碳INEPT实验。

信号的数量及其位置分别反映了残基运动程度和氨基酸组成的特征。在此，仅观察到来自扭曲缓冲区 CH2 merit-y 的信号，因为整个蛋白质在组装结构中处于刚性状态。该蛋白质结构的构象分析基于组装中所有刚性残基的固态核磁共振共振归属。

这得以实现是因为化学位移对局部化学环境具有高度敏感性，可用于预测蛋白质的二级结构。完整的三维结构测定则基于收集结构数据，例如距离约束，这些约束编码了分子内和分子间原子接近程度的信息，最长可达九埃。本文将展示如何记录基本的二维实验，并给出一个序列归属的示例。

接下来，我们将简要演示如何从选择性标记 C13 的样品实验中收集距离限制数据。设置一个短混合时间的二维碳-碳 PDSD 实验，以检测残基内碳-碳相关性。从一维 CP 实验中复制质子-碳交叉极化初始步骤的参数值。

对于均匀标记C13的样品，混合时间可设置为50毫秒。此处，我们在间接维和直接维分别选择15毫秒和20毫秒的采样时间。处理PDSD谱图时，我们采用QSINE窗口函数，并设置正弦钟形偏移为3.5。

为了实现对残基的特异性指认，使用短混合时间PDSD的设置来采集混合时间为100至200毫秒的中间混合时间PDSD谱。请注意，通常需要额外的谱图（包括氮检测实验）才能完成共振指认，相关细节在本方案中有详细说明。选择一种NMR分析软件，例如CCPNMR Analysis。

将二维谱图载入软件，并根据主要蛋白质序列创建一个分子对象。首先在短混合时间的PDSD谱图中识别可见的氨基酸类型。通过连接自旋系统的碳原子，可实现对残基类型的特异性归属。

在此，我们指派一个苏氨酸残基的自旋体系。C-α、C-β 和 C-γ 原子核之间的极化转移在 PDSD 谱图中产生真实的交叉峰。请尝试通过此方法尽可能多地鉴定出残基。

叠加短混合时间与中等混合时间的 PDSD 谱。在中等混合时间 PDSD 谱中可见的额外峰通常来源于相邻残基之间的相互作用。标记出自旋体系的共振峰，并在中等混合时间 PDSD 谱中寻找这些共振频率与其他自旋体系之间的相关信号。

我们展示了在丝状蛋白组装中，thenium 33与isolutane 32的依次归属。thenium自旋系统的共振频率在32号isolutane的碳频率上可见，反之亦然。本方案中描述了利用氮检测谱进行归属的步骤，以及如何从归属结果中获得蛋白质二级结构的方法。

在完成彻底的共振归属后，我们可以继续进行长程限制的鉴定。长程限制是指远端残基之间分子内或分子间的碳-碳接近关系，这些关系不仅决定了单体亚基的三级折叠结构，还决定了组装体内亚基的空间排布。在此过程中，特异性¹³C标记的样品尤为重要。

将中间混合时间的PDSD与在选择性C13标记样品上记录的长混合时间碳-碳PDSD叠加，后者混合时间为400毫秒至1秒。如果可能，两个PDSD谱均应使用相同的选择性标记样品记录。附加峰来源于较远距离的C13原子之间的相关性。

在进行共振归属时，需考虑选择性标记方案。本例中使用的是1-3-甘油。此处我们展示了一个远程相互作用峰的示例，其在两个维度上均具有明确的归属。

Thenuim 33 C-beta 与蛋白 45 C-alpha。在完成长程距离鉴定后，约束条件被分为明确或模糊，以及分子内或分子间。用于结构建模的约束列表已在方案中列出。

有关使用不同程序进行结构建模的教程可在线获取。固体核磁共振（NMR）数据，无论是单独使用还是结合其他互补数据，均可实现超分子组装体的原子级结构解析。固体核磁共振的优势在于，一方面能够提供二级结构信息以及来自分子内界面的原子间距离约束，这些信息可整合到建模过程中。

然而，另一方面，固态核磁共振波谱技术的独特之处在于其能够获取完整超分子组装体分子间界面上的原子距离限制信息。检测并区分分子内与分子间的限制约束指认可能是一个繁琐的过程，通常需要制备选择性碳13标记的样品。然而，随着选择性标记策略、波谱仪硬件设计以及固态核磁共振方法学的新进展，该技术正日益实现其理论潜力，能够在不受样品尺寸、长程有序性或结晶性限制的情况下提供原子水平的分子信息。

该方法可使我们研究生物大分子组装体的原子结构。为获得高分辨率数据，必须仔细制备样品以优化核磁共振（NMR）条件。通过本方案，我们能够获得蛋白质组装体的原子级分辨率信息。

该技术可与其他结构生物学技术结合使用，以获得三维模型。