Name: 固体核磁共振波谱法研究高分子组件的原子尺度结构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: 学习利用魔角旋转固态核磁共振波谱法研究不溶性非晶态超分子蛋白质组装体的原子尺度结构。该方法可解析刚性及柔性区段，为结构生物学提供高分辨率数据。

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本工作由法国国家研究局（ANR）（项目编号13-PDOC-0017-01资助B.H.，项目编号ANR-14-CE09-0020-01资助A.L.）、&#34;未来投资计划&#34;波尔多大学/法国国家科学研究中心（CNRS）（PEPS 2016项目资助B.H.，参考编号ANR-10-IDEX-03-02资助B.H.）、法国医学研究基金会（FRM-AJE20140630090资助A.L.）、欧盟第七框架计划（FP7-PEOPLE-2013-CIG资助A.L.）以及欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资助（A.L.获得ERC启动资助，协议编号639020）和项目&#34;WEAKINTERACT.&#34;

作者无任何利益冲突需要披露。

固态核磁共振（SSNMR）是用于在原子水平上表征大分子蛋白质组装体的首选方法。基于SSNMR进行结构测定的核心问题之一是所研究体系的谱图质量，这决定了能否构建出不同精度的三维结构模型，通常从低分辨率模型（包含二级结构元件但三维信息较少）到准原子级分辨率的三维结构。从多维SSNMR实验中提取的结构信息的数量与质量，是计算获得该组装体高分辨率NMR结构的关键。
本方案依赖于检测13C-13C和15N-13C结构约束，需要采集多个具有高信噪比的二维（有时为三维）谱图。在中等魔角旋转（MAS）频率（&#60;25 kHz）下，将样品装入直径为3.2–4 mm的转子中，可容纳的蛋白样品量最高约为50 mg，具体取决于样品的含水量。转子内样品的量与固体核磁共振（SSNMR）谱图中的信噪比成正比，这是实现长程距离约束检测及其明确归属的关键因素。
光谱分辨率在逐步共振归属和约束条件收集过程中是一个关键参数。为了获得最佳结果，需要优化样品制备参数，特别是亚基的纯化以及组装条件（pH、缓冲液、振荡、温度） 等等。）。对于样品优化，建议为已观察到组装现象的多个不同条件分别制备未标记样品，并记录相应的1D 1H-13在每个制备好的样品上采集CP谱（见步骤2.1）。这些谱图用于比较不同样品制备条件下的谱图分辨率和分散性，并据此确定最佳实验条件。
固态核磁共振（SSNMR）数据的质量在很大程度上取决于核磁共振采集参数的选择，尤其是极化转移步骤的参数。使用高磁场强度（≥600 MHz 1H 频率）对于实现高灵敏度和高谱分辨率至关重要，这在面对大分子蛋白质组装体等复杂研究目标时尤为必要。
在许多情况下，限制因素是波谱仪的可用性。因此，在进行波谱仪实验之前，应审慎选择需要制备的样品。无论如何，均匀标记13C和15N的样品是完成逐残基及残基内共振归属的前提条件。通过固态核磁共振技术完成归属的蛋白质，参见71。在中等魔角旋转（MAS）频率下进行大分子组装体结构测定时，需要使用选择性13C标记的样品；为检测长程13C-13C和13C-15N相互作用，通常采用基于1,3-13C-甘油和/或2-13C-甘油，以及1-13C-葡萄糖和2-13C-葡萄糖标记的样品，如上所述。两种标记策略的选择取决于谱图的信噪比和分辨率。为区分分子内与分子间长程相互作用，混合标记并稀释的样品已被证明是有效的方法。
简而言之，原子级固态核磁共振结构研究的关键步骤包括：（i）亚基的制备与组装需经过优化，以获得优良的样品数量和质量；（ii）必须谨慎选择波谱仪磁场强度和采集参数；（iii）三维结构测定需要采用选择性同位素标记策略，所需数据量取决于数据质量以及是否有互补数据可供使用。
尽管固态核磁共振（SSNMR）可广泛应用于从膜蛋白到同源多聚体纳米结构等多种超分子体系，但其通常受限于需要毫克量级的同位素标记样品。近年来超快魔角旋转（≥100 kHz）SSNMR技术的发展，为该领域开辟了新的前景 1H检测核磁共振，并将样品最低用量的极限推进至亚毫克级 72,73,74然而，对于详细的结构研究 13C标记的样品是不可或缺的，这限制了固体核磁共振技术在组装样品中的应用 体外 或在仅含最低限度培养基的生物体中表达的系统，其中细胞内固态核磁共振（SSNMR）是一种新兴方法（综述见 75,76,77,78).
在固态核磁共振（SSNMR）应用于获得高分辨率三维结构时，一个重要的因素是谱图分辨率：组装体中固有的构象异质性可能会限制谱图分辨率及谱图分析。在某些情况下，残基特异性的13C标记可作为替代方法，用于获取关键残基的特定距离信息，从而构建结构模型（近期示例参见79,80）。
采用固态核磁共振（SSNMR）进行三维结构测定仍需采集多个数据集，通常在精密仪器上耗时较长，具体时间取决于研究方法和体系，在600–1000 MHz（1H频率）谱仪上可能需要数天至数周。因此，谱仪机时的获取可能成为深入SSNMR研究的限制因素。
对于同源多聚体蛋白质组装体，可获得质量足够高的固体核磁共振数据，以识别大量结构限制，例如在 3,57,64,70，SSNMR 仍无法提供微观尺寸信息。因此，在一个 从头合成 SSNMR结构测定同源多聚体组装体时，电镜（EM）或单位长度质量（MPL）数据可与SSNMR数据理想互补，以确定其对称参数。仅SSNMR数据即可提供原子级的分子内和分子间相互作用界面信息
固态核磁共振（SSNMR）与电子显微镜（EM）或MPL测量等结构技术具有高度互补性，其数据也可与通过X射线晶体学或溶液核磁共振获得的突变或截短亚基的原子结构完美结合。文献中越来越多的研究表明，多种结构数据的联合应用已成功实现了大分子组装体原子级三维模型的构建（代表性示例如图6所示）。
在结构生物学领域，固态核磁共振（SSNMR）作为一种有前景的技术，可用于在原子水平上研究不溶性及非晶态聚集体。 即 提供原子尺度的结构数据。在这方面，固体核磁共振（SSNMR）与溶液核磁共振及X射线晶体学相辅相成，适用于研究包括膜蛋白在其天然环境中的分子组装，以及病毒包膜、细菌纤维、淀粉样蛋白、RNA及RNA-蛋白质复合物等（例如参见81）。其高度多样的应用 体外 在细胞环境中，例如追踪二级、三级和四级结构的变化，以及在原子尺度上鉴定与相互作用分子的结合表面（例如 82以及在组装复合物背景下描绘分子动力学，表明了固体核磁共振在未来复杂生物大分子组装体结构研究中的重要意义。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>M9 培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0.5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6.7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 维生素混合液 100X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C-葡萄糖</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：在E. coli BL21细胞中用于重组蛋白 表达的最小培养基成分。

魔角旋转固体核磁共振波谱技术（SSNMR）的进步为在原子分辨率下表征大分子蛋白质组装体的结构提供了高效工具。这些蛋白质组装体是普遍存在的系统，在多种生物学过程中发挥着关键作用。通过SSNMR研究，可以获取其分子结构、相互作用及动力学信息，已有研究成功应用于病毒（衣壳1）和细菌感染机制（分泌系统2,3、菌毛4）、膜蛋白复合物5,6,7,8以及功能性淀粉样蛋白9,10,11。此类分子组装体也可能引发病理状态，例如在神经退行性疾病中，蛋白质错误折叠并组装成淀粉样状态，导致细胞功能异常或细胞死亡12,13。蛋白质组装体通常由多个相同亚基通过对称寡聚化形成具有各种形状的大型超分子结构，包括纤维、丝状体、孔道、管状结构或纳米颗粒。其四级结构由蛋白质亚基之间的弱相互作用所决定，以调控其空间和时间上的组装过程，并实现复杂的生物学功能。由于这些组装体本质上不溶，且通常不具备结晶性，限制了传统X射线晶体学或溶液核磁共振方法的应用，因此在原子尺度上对其进行结构研究对高分辨率技术而言仍具挑战性。魔角旋转（MAS）固体核磁共振是一种新兴技术，可在不溶性大分子组装体上获得原子分辨率数据，并已成功解析出越来越多复杂生物分子系统的三维原子模型，包括细菌丝状体、淀粉样组装体和病毒颗粒14,15,16,17,18,19,20,21,22。高磁场技术的进步、方法学的发展以及样品制备的优化，使MAS SSNMR成为研究各种环境下不溶性蛋白质的可靠方法，尤其是在具有生物学相关性的大分子组装状态或细胞膜环境中，该技术与冷冻电子显微镜高度互补。在许多情况下，这类蛋白质组装体表现出高度对称性。MAS SSNMR可利用这一特性，因为在同源分子组装体中，所有蛋白质亚基具有相同的局部结构，因而几乎呈现相同的SSNMR谱图特征，从而显著降低分析复杂度。
本视频介绍了一种利用中等魔角旋转（MAS，&lt;25 kHz）固态核磁共振（SSNMR）对大分子蛋白复合物进行结构研究的高效方案，该方案可分为多个步骤（图1）。我们将以一种丝状蛋白复合物为例，展示SSNMR结构研究工作流程中的关键阶段（参见图1中高亮的步骤），但不包括每种蛋白复合物各不相同的蛋白亚基纯化步骤——该步骤对结构研究至关重要——同时也不深入介绍SSNMR波谱技术和结构计算方面的技术/方法细节，相关专题的在线教程已有详述。尽管本方案主要聚焦于在MAS条件下进行的固态核磁共振实验，但使用取向排列的生物环境（如取向双层磁小体）23,24,25,26,27，可在无需MAS技术的情况下研究膜类似介质中蛋白质的构象及其动态蛋白-蛋白相互作用。我们将展示蛋白质表达与组装步骤，以及关键SSNMR谱图的采集、分析与解读。我们的目标是使读者深入了解结构分析流程，从而能够利用SSNMR技术对大分子复合物开展原子分辨率的结构研究。
该方案包含3个部分：
1. 固体核磁共振样品制备
在进行固态核磁共振分析之前，需要对大分子组装体中的蛋白质组分进行表达、同位素标记、纯化和组装 体外 进入类似天然的复合物状态（示例见 图2）。为了确保高核磁共振（NMR）灵敏度，需进行同位素富集 13C 和 15需通过使用添加了N标记的最小细菌表达培养基来实现标记 13C 和 15N 个来源，例如均匀的 13C标记的葡萄糖/甘油和 15NH4Cl 分别。在方案的后期阶段，选择性地 13选择性标记的C-标记样品 13C标记的来源，例如（1,3-13C）和（2-13C)-甘油（或(1-13C）和（2-13C)-葡萄糖）用于促进核磁共振（NMR）分析。混合标记样品对应于等摩尔混合物，其中含有50% 15N- 和 50% 13C标记的或50%（1,3-13C）和 50%（2-13C-葡萄糖用于描述分子间相互作用的检测。蛋白质的高纯度以及组装步骤中的严格条件是确保最终样品具有均一结构秩序的关键因素。
2. 基于一维（1D）固态核磁共振的初步结构表征
我们介绍了通过固态核磁共振（SSNMR）进行结构分析所需的关键实验。采用检测13C核的一维（1D）交叉极化（CP）实验和INEPT/RINEPT28实验，分别用于检测组装体中刚性与柔性蛋白质片段，并评估结构均一性及局部多态性的程度（示例见图3）。
3. 构象分析与三维结构测定
第1和第2小节涉及构象分析，该分析基于蛋白质组装中所有刚性残基的固态核磁共振（SSNMR）化学位移指认，因为化学位移对局部环境极为敏感，可用于预测φ/ψ二面角，从而确定二级结构。 图4 展示了蛋白质组装体刚性核心中连续共振指认的一个示例. 三维结构测定基于收集结构数据，例如编码近距离的空间距离限制&lt;7 - 9 Å），包含分子内和分子间的信息。第3和第4小节描述长程距离限制的收集与解析。长程接触定义为分子内 13C-13由残基 i 到 j 且 |i-j| ≥ 4 所形成的近端相互作用，由此定义单体亚基的三级蛋白质折叠，或作为分子间作用 13C-13C 近端，定义了组装过程中蛋白质亚基之间的分子间界面。分子内和分子间界面如图所示。 图5. 通过SSNMR测得的约束条件 13C-13C 和 15N-13C再耦合实验通常用于编码核间距离 &lt; 1 nm。第4小节解释了分子间距离限制的检测。在对称性蛋白质组装体中，使用均匀标记的样品（即 100% 均一或选择性标记）在鉴定分子间亚基-亚基相互作用方面存在局限性，因为分子内和分子间的接触均会产生可检测信号。通过使用混合标记样品可明确检测分子间接近性，该样品在聚集前混合等摩尔的两种不同标记样品。第5小节简要介绍结构建模。
<img alt="标记的蛋白质表达、体外组装、固态核磁共振；蛋白质结构分析示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 通过固态核磁共振进行原子级分辨率结构研究的工作流程。13C、15N同位素标记的蛋白质制备，亚基纯化，亚基组装，组装体形成的控制，固态核磁共振（SSNMR）实验，SSNMR实验数据分析及距离约束的提取，以及结构建模均在图中展示。 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR 波谱仪（&gt; 11.7 特斯拉）</td><td>Bruker</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>三共振魔角旋转固态核磁探头&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>4 mm 固态核磁转子</td><td>Bruker</td><td>K1910</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5805000629</td><td></td></tr><tr><td>GeneQuant 1300 分光光度计</td><td>Dutscher</td><td>28-9182-13</td><td></td></tr><tr><td>IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td><td>Dutscher</td><td>228001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4450 台式轨道摇床</td><td>Dutscher</td><td>78376</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver 混匀仪</td><td>Dutscher</td><td>79547</td><td></td></tr><tr><td>sonopuls HD 3100</td><td>Bandelin</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser 电穿孔仪</td><td>Biorad</td><td>165-2100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mini-PROTEAN tetra 电泳系统</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>AKTA pure 系统</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td></td></tr><tr><td>capillary microman M25 移液器</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>F148502</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon&lt;sup&gt;R&lt;/sup&gt; ultra-15</td><td>Sigma</td><td>Z740199-8EA</td><td></td></tr><tr><td>毛细管和活塞</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>F148112</td><td></td></tr><tr><td>药匙</td><td>Fisher</td><td>13263799</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖 &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵-15N</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td></td></tr><tr><td>1,3 &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 甘油</td><td>Sigma</td><td>492639</td><td></td></tr><tr><td>2 &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C 甘油</td><td>Sigma</td><td>489484</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Sigma</td><td>K1876</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>氯化铁</td><td>Sigma</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>氯化锌</td><td>Sigma</td><td>793523</td><td></td></tr><tr><td>MEM 维生素溶液（100&amp;times;）</td><td>Sigma</td><td>M68954</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 碱&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>4,4-二甲基-4-硅杂戊烷-1-磺酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>178837</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unicorn 6.3</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Akta 系统</td></tr><tr><td>ccpNMR</td><td>CCPN&amp;nbsp;</td><td></td><td>波谱仪系统</td></tr></tbody></table>

利用固态核磁共振波谱法对大分子组装体进行原子尺度结构研究

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

超分子蛋白质组装体在从宿主-病原体相互作用、病毒感染到神经退行性疾病传播等多种生物学过程中发挥着基础性作用。这些组装体由多个蛋白质亚基通过非共价方式有序组织而成，形成能够执行多种细胞功能或导致有害后果的大分子结构。由于这类大分子组装体本身具有不溶性和非晶态特性，通常会显著降低结构生物学常用技术（如X射线晶体学和溶液核磁共振（NMR））所获得数据的质量，因此对其组装机制及功能的原子级认识往往十分有限。本文介绍魔角旋转固体核磁共振波谱技术（SSNMR）作为一种在原子分辨率下研究大分子组装体结构的有力方法。SSNMR能够在无尺寸和溶解度限制的情况下揭示组装复合物的原子细节。本文所述方案涵盖了从制备13C/15N同位素标记的大分子蛋白质组装体，到标准SSNMR谱图的采集及其分析与解释等关键步骤。作为示例，我们展示了对一种丝状蛋白质组装体进行SSNMR结构分析的完整流程。

典型的固态核磁共振（SSNMR）工作流程包括以下几个步骤，如图所示 图1通常，蛋白质亚基由 体外 异源表达于 E. coli，纯化并在振荡条件下组装，但有时也在静态条件下进行。蛋白亚基的表达与纯化随后通过SDS凝胶色谱法进行图2A）。然后可通过电子显微镜（EM）分析确认大分子复合物的形成（参见 图2B 以丝状组装为例）。
将蛋白质组装体装入SSNMR转子后，将转子插入谱仪，调节MAS频率和温度，并采集谱图。通过一维SSNMR技术可获得初步信息。图3展示了一个结构均一的蛋白质样品在13C通道上检测到的典型SSNMR自由感应衰减（FID）信号，一个1H-13C交叉极化（CP）谱图，揭示了组装体中蛋白质亚基刚性核心所含的13C共振信号，以及一个二维1H-13C INEPT谱图，反映的是柔性残基的信号。为了获得组装体刚性核心结构的原子级解析信息，需要在均匀标记和选择性标记的样品上采集多维SSNMR实验数据，以首先完成SSNMR共振信号的归属，继而检测远程邻近关系（见图4）。
所有谱图均使用适当的软件进行处理和分析，以指定固态核磁共振（SSNMR）共振峰并提取分子内和分子间距离约束图5）。SSNMR 距离限制可单独使用，或与来自互补技术的数据结合使用，并可整合到建模程序中。
对于通过固态核磁共振（SSNMR）技术解析的大分子组装体的代表性原子结构，图6 展示了来自细菌附属结构和淀粉样纤维的几种丝状组装体。
<img alt="蛋白质三维结构、带状模型、示意图、结构生物学、分子构象分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：通过固态核磁共振方法解析的丝状大分子结构：细菌丝状结构与淀粉样蛋白纤维。A) 尿路致病性E. coli的I型菌毛，PDB编号2N7H 4；B) ASC丝状结构，PDB编号2N1F 63；C) III型分泌系统针状结构，PDB编号2MME、2LPZ和2MEX 2,3,64；D) 淀粉样蛋白β AB42纤维，PDB编号2NAO、5KK3、2MXU 65,66,67，以及大阪突变体PDB编号2MVX 57、艾奥瓦突变体PDB编号2MPZ 58；E) α-突触核蛋白纤维，PDB编号2N0A 68；F) HET-s朊病毒结构域，PDB编号2RNM、2KJ3 69,70。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

原子分辨率下的超分子蛋白质组装体结构因其在多种生物现象中发挥的关键作用而具有重要意义。本文介绍了一种利用魔角旋转固体核磁共振波谱技术（MAS SSNMR）对不溶性且非晶态的大分子蛋白质组装体进行高分辨率结构研究的实验方案。

超分子蛋白质组装在从宿主-病原体相互作用、病毒感染到……等一系列生物过程中发挥着基础性作用。

本实验方案的总体目标是利用魔角旋转固体核磁共振波谱技术，在原子分辨率水平上研究不溶性且非晶态的超分子蛋白质组装体的结构。我们将介绍利用固体核磁共振技术研究生物大分子蛋白质组装体原子结构的关键方法步骤。由于这些组装体本质上不溶且不具有晶体结构，对其原子结构的研究极具挑战性。固态核磁共振（NMR）是一种新兴技术，能够在不受组装体尺寸或溶解度限制的情况下，以原子级分辨率研究分子结构与动力学。本文展示了利用固态核磁共振可视化生物大分子蛋白组装体原子结构的关键步骤，包括同位素标记样品的制备、固态核磁共振结构数据的采集与分析。固态核磁共振实验流程的第一步是制备碳13（C13）、氮15（N15）标记的蛋白亚基，并在体外进行组装。挑取一个转化后的 E.coli 菌落，接种于 15 ml 预热的 LB 培养基中，37 摄氏度、200 RPM 振荡培养过夜。接种主培养物时，将整个预培养物转移至一升含有必要同位素标记的碳源和氮源的预热 N9 培养基中。可包括含 N15 标记的氯化铵、均匀 C13 标记的葡萄糖、特异性 C13 标记的葡萄糖，或特异性 C13 标记的甘油。在 37°C 下孵育，并在培养物变浑浊后立即于 600 纳米处测定光密度。当 OD 达到 0.8 时，加入 0.75 mM 的 IPTG 诱导蛋白表达，持续 4 小时。请注意，最佳诱导条件因蛋白而异。在 6,000 G 和 4 摄氏度条件下离心 30 分钟，回收细胞。蛋白亚基纯化后，在体外进行组装。使用离心过滤装置将蛋白浓缩至约 1 毫摩尔浓度。为此，将样品加入滤膜装置中，在4,000 G条件下离心30分钟。每次离心步骤之间，用移液器轻轻混匀滤膜装置中的溶液，以避免蛋白质在滤膜上沉积。重复该操作，直至达到所需浓度。将样品转移至离心管中，在室温下振荡孵育一周。通常，亚基聚合形成丝状结构会伴随溶液变浑浊。加入0.02%（重量/体积）叠氮化钠以防止细菌污染。为收集蛋白质组装体，将样品在 20,000 G 和 4 °C 条件下离心一小时。吸除大部分上清液，仅保留足以覆盖表面的液体以避免样品干燥，并将样品在 4 °C 下保存至测量前。我们将介绍通过固态核磁共振进行结构分析所必需的关键实验。通过在C13原子核上检测的一维交叉极化（CP）和INEPT实验，可分别用于检测组装体中的刚性与柔性蛋白质片段，并用于评估结构均一性程度及局部多态性。此处，我们采用标准实验参数。典型的参数范围在方案中已注明。将转子插入核磁共振磁体中，并按照方案所述启动魔角旋转。设定所需的旋转频率，并确保频率稳定在±10赫兹范围内。使用16次扫描记录单次脉冲的一维质子谱。设置1D质子碳CP实验。CP实验可显示处于刚性构象中的残基所产生的信号。初始实验参数取自参考化合物上的标准优化流程。当灵敏度足够高时，可在样品中优化脉冲校准和去耦参数。此处，我们采集了16次扫描的交叉极化（CP）谱。交叉极化接触时间与功率水平的选择依据为信号强度最大化，此处以交叉极化接触时间的优化为例进行说明。本示例中的最大强度出现在 800 毫秒处。还应根据参考化合物校准最初设定的参数，重新调整去耦参数。最后，仔细观察在给定魔角旋转频率（此处为 18 千赫兹）下旋转边带的定位，以避免与信号发生重叠。记录一个参考的一维质子-碳交叉极化（CP）谱，作为一维光谱指纹。此处，我们累积128次扫描，交叉极化接触时间为800毫秒，去耦强度为100千赫兹，循环延迟为3秒，采样时间为20毫秒。对CP实验进行处理时，不使用任何窗函数。选择一个孤立的峰来估算样品中的C39，以反映结构的有序性和均一性。此处，以半高全宽测量的线宽约为60至70赫兹，表明该组装体中的蛋白质结构具有良好的有序性。设置一维质子-碳INEPT实验，以探测蛋白质组装体中高度流动的部分。记录一个参考的INEPT实验，用作移动蛋白质片段的指纹。典型参数为128次扫描，采集时间为25毫秒。处理该质子碳INEPT实验。信号的数量及其位置分别反映了残基的运动程度和氨基酸的组成。此处仅观察到来自扭曲缓冲区 CH2 的 merity 信号，表明在整个组装结构中，蛋白质均处于刚性状态。蛋白质结构的构象分析基于对组装体中所有刚性残基的固态核磁共振共振归属。这得以实现的原因是化学位移对局部化学环境具有高度敏感性，可用于预测蛋白质的二级结构。完整的三维结构测定则依赖于一系列结构数据的收集，例如距离约束，用以编码分子内和分子间原子接近程度，最长可达九埃。本文将介绍如何记录基本的二维实验，并举例说明序列化归属的实现过程。接下来，我们将简要演示如何从选择性C13标记样品的实验中获取距离限制参数。设置一个短混合时间的二维碳-碳PDSD实验，用于检测残基内碳-碳相关性。从一维CP实验中复制质子-碳交叉极化初始步骤的参数值。对于均匀标记 C13 的样品，混合时间可设置为 50 毫秒。此处，我们在间接维和直接维分别选择 15 毫秒和 20 毫秒的采集时间。为处理 PDSD 谱图，我们采用 QSINE 窗函数，并设置正弦钟形偏移为 3.5。为了实现残基特异性归属，使用短混合时间PDSD的设置来采集混合时间为100至200毫秒的中间混合时间PDSD谱。请注意，通常需要额外的谱图（包括氮检测实验）才能完成共振归属，相关细节在本方案中有详细说明。选择一种NMR分析软件，例如CCPNMR Analysis。将二维谱图载入软件，并根据目标蛋白的主序列创建分子对象。首先在短混合时间的PDSD谱图中识别可见的氨基酸类型。通过连接自旋系统的碳原子，可实现对残基类型的特异性归属。在此，我们对噻inium残基的自旋体系进行归属。C-alpha、C-beta与C-gamma原子核之间的极化转移在PDSD谱图中产生真实的交叉峰。请尝试通过此方法尽可能多地鉴定出残基。将短混合时间与中等混合时间的PDSD谱图叠加。在中等混合时间PDSD谱图中出现的额外峰通常源于相邻残基之间的相互作用。标记出自旋体系的共振峰，并在中等混合时间PDSD谱图中寻找这些共振频率与其他自旋体系之间的相关峰。我们在丝状蛋白组装中展示了 thenium 33 与 isolutane 32 的顺序归属。thenium 自旋系统的共振频率在 32 中 isolutes 的碳频率上可见，反之亦然。本方案中描述了利用氮检测谱进行归属的步骤，以及从归属结果中获取蛋白二级结构的方法。在完成充分的共振归属后，我们可以进一步开展远程限制条件的鉴定。远程限制条件是指远端残基之间分子内或分子间的碳-碳邻近关系，这些信息能够确定单体亚基的三级折叠结构以及组装体内各亚基的空间排布。在此过程中，特异性碳13标记的样品具有重要意义。在选择性C13标记的样品上，叠加一个中间混合时间的PDSD谱与一个混合时间为400毫秒至1秒的长混合时间碳-碳PDSD谱。如果可能，这两个PDSD谱应均在同一选择性标记的样品上采集。附加峰来源于更远距离的C13原子之间的相关信号。在进行共振归属时，需考虑选择性标记方案。本例中使用的是1-3-甘油。此处我们突出显示了一个远程相关峰的示例，该峰在两个维度上均具有明确的归属。Thenuim 33 C-beta 与蛋白 45 C-alpha。在完成长程距离鉴定后，约束条件被分类为明确或模糊，以及分子内或分子间。用于结构建模的约束列表详见实验方案。可在网上找到使用不同程序进行结构建模的教程。固体核磁共振（NMR）数据，无论是单独使用还是结合其他补充数据，均可实现对超分子组装体的原子级结构解析。固体核磁共振的优势在于，一方面能够提供二级结构信息，以及来自分子内界面的原子间距离限制，这些信息可整合到建模过程中。然而，另一方面，固态核磁共振波谱技术的独特之处在于其能够获取完整超分子组装体分子间界面上的原子距离限制信息。但检测并区分分子内与分子间限制条件的归属通常是一个繁琐的过程，一般需要制备选择性C13标记的样品。然而，随着选择性标记策略、核磁共振谱仪硬件设计以及固态核磁共振方法学的新进展，该技术正日益实现其提供原子水平分子信息的理论潜力，且不受样品尺寸、长程有序性或结晶性的限制。该方法使我们能够研究生物大分子组装体的原子结构。为获得高分辨率数据，必须仔细制备样品以优化核磁共振（NMR）条件。通过本方案，我们可以获得蛋白质组装体的原子级分辨率信息。该技术可与其他结构生物学技术结合使用，以获得三维模型。

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