固体核磁共振波谱法研究高分子组件的原子尺度结构

该方案的总体目标是通过魔角旋转固体 NMR 波谱以原子分辨率研究不溶性和非结晶性超分子蛋白质组装体的结构。我们将介绍通过固体 NMR 研究生物分子蛋白质组装体的原子结构的基本方法步骤。研究这些组装体的原子结构极具挑战性，因为它们本质上是不溶性和非结晶性的。

固体核磁共振是一种新兴的技术，能够在原子分辨率下研究分子结构和动力学，而不受组装物体的大小或其溶解度的限制。我们在这里说明了通过销售态 NMR 可视化生物分子蛋白质组装体的原子结构的关键步骤，包括同位素标记样品的制备、固体 NMR 结构数据的收集和分析。固体 NMR 工作流程的第一步是生产 C13 N15 标记的蛋白质亚基及其体外组装。

一个转化的大肠杆菌细胞菌落接种 15 mil 预热的预热 LB 培养基。在 37 摄氏度下以 200 RPM 的转速振荡孵育过夜。为了接种主要培养物，将整个预培养物转移到一升预热的 N9 培养基中，该培养基含有必要的同位素标记的碳和氮源。

这些可以包括，N15 标记的氯化铵、均匀 C13 标记的葡萄糖、选择性 C13 标记的葡萄糖或选择性 C13 标记的甘油在 37 度下孵育，并在培养物变得浑浊时立即测量 600 纳米的光密度。当 OD 达到 0.8 值时，用 0.75 微摩尔 IPTG 诱导蛋白表达 4 小时。请注意，最佳诱导条件可能因蛋白质而异。

通过在 6， 000 G 和 4 度下离心 30 分钟来回收细胞。纯化蛋白质亚基后，它们在体外组装。在离心过滤装置中将蛋白质浓缩至一个迷你摩尔左右。

为此，将样品引入过滤装置中，并以 4， 000 G 离心 30 分钟。在离心步骤之间，用移液管轻轻混合过滤装置中的溶液，以避免蛋白质沉积在过滤膜上。重复该过程，直到达到所需的浓度。

将样品转移到猎鹰管中，并在室温下搅拌孵育一周。通常，亚基聚合成细丝伴随着溶液变得浑浊。添加每体积重量为 0.02% 叠氮化钠以避免细菌污染。

要收获蛋白质组装体，请将样品在 20， 000 G 和 4 度下离心 1 小时。吸出大部分上清液，只留下足够的液体覆盖表面以避免样品干燥，并将样品储存在 4 度直至测量。我们将介绍通过固体 NMR 进行结构分析的基本实验。

在 C13 细胞核上检测到的一维交叉极化 （CP） 和无能实验分别用于检测组装中的刚性和柔性蛋白质片段。并估计结构同质性和局部多态性的程度。在这里，我们使用标准的实验值。

典型参数范围在协议中指示。将旋转体插入 NMR 磁体，然后按照协议中的说明开始魔术角旋转。设置所需的旋转频率，并确保稳定在正负 10 赫兹以内。

使用 16 次扫描记录单个脉冲一维质子谱。设置 1D 质子碳 CP。CP 实验显示了由刚性构象中的残基产生的信号。初始实验参数取自参考化合物的标准优化程序。

当灵敏度足够高时，可以在样品中优化脉冲校准和去耦参数。在这里，我们记录了 16 次扫描的 CP。CP 接触时间和功率水平是根据最大信号强度选择的，如此处所示，用于优化 CP 接触时间。

在此示例中，最大强度在 800 毫秒时达到。此外，还应根据参比化合物校准中最初设置的去耦参数重新调整。最后，仔细观察给定魔角旋转频率下旋转边带的定位，此处显示为 18 kHz，以避免与信号重叠。

记录参考 1D 质子碳 CP 光谱，用作一维光谱指纹。在这里，我们累积了 128 次扫描，CP 接触时间为 800 毫秒，去耦强度为 100 kHz，回收延迟为 3 秒，采集时间为 20 毫秒。无动于衷地处理 CP 实验。

选择并分离的峰以估计样品中的 C39，指示结构有序和均一性。在这里，线宽（以半高处的全宽测量）约为 60 到 70 赫兹，表明组装体中蛋白质结构井然有序。设置一维质子碳无能实验以探测蛋白质组装体的高流动性部分。

记录一个参考无能的实验，作为移动蛋白质片段的指纹图谱。典型参数为 128 次扫描，采集时间为 25 毫秒。处理质子碳无能实验。

信号的数量及其位置分别表示残基迁移率的程度和氨基酸组成。在这里，仅观察到来自扭转缓冲液 CH2 merit-y 的信号，因为整个蛋白质在组装结构中处于刚性状态。蛋白质结构的构象分析基于组装体所有刚性残基的固态 NMR 共振分配。

之所以能够做到这一点，是因为化学位移是局部化学环境的高度敏感探针，可用于预测蛋白质的二级结构。然后，根据结构数据的收集（例如距离约束）进行完整的 3D 结构测定，这些数据编码分子内和分子原子间接近度，最高可达 9 埃。在这里，我们将展示如何记录基本的二维实验，并给出一个顺序分配的例子。

然后，我们将简要演示如何从选择性 C13 标记样品上记录的实验中收集距离约束。设置短混合时间二维碳碳 PDSD 实验，检测残基内碳碳相关性。从一维 CP 实验中复制初始质子碳交叉极化步骤的值。

对于均匀标记的 C13 样品，混合时间可设置为 50 毫秒。在这里，我们分别在间接和直接维度上选择了 15 毫秒和 20 毫秒的采集时间。为了处理 PDSD 频谱，我们使用正弦钟移位为 3.5 的 QSINE 窗口函数。

要启用残留物特定分配，请使用短混合时间 PDSD 的设置来记录混合时间为 100 至 200 毫秒的中间混合时间 PDSD。请注意，完整的共振分配通常需要额外的光谱，包括氮检测实验，这在实验方案中有详细说明。选择一个 NMR 分析程序，例如 CCPNMR Analysis。

将 2D 光谱加载到软件中，并使用初级蛋白质序列创建分子对象。首先确定在短混合时间 PDSD 谱图中可见的氨基酸类型。连接自旋系统的碳原子可以进行残基类型的特定分配。

在这里，我们分配了钌残基的自旋系统。C-α、C-β 和 C-γ 原子核之间的极化转移导致 PDSD 光谱中出现物理交叉峰。尝试使用此程序识别尽可能多的残留物。

叠加短时和中混时 PDSD 谱图。在中间混合时间 PDSD 中可见的补充峰通常是由连续残基之间的接触产生的。标记自旋系统的谐振峰，并在中间混合时间 PDSD 中查找与其他自旋系统的谐振频率的相关性。

我们显示了在我们的丝状蛋白质组装中将 thenium 33 顺序分配给 isolutane 32。thenium 自旋系统的共振频率在 32 中等离子体的碳频率上可见，反之亦然。协议中描述了分配氮检测光谱和从分配中获得蛋白质二级结构的程序。

在彻底的共振分配之后，我们可以继续确定长距离约束。长距离约束是远距离残基之间的分子内或分子间碳碳接近性，它定义了单体亚基的三级折叠和组装体内亚基的排列。在这里，选择性 C13 标记的样品特别重要。

将中间混合时间 PDSD 与在选择性 C13 标记样品上记录的长混合时间碳碳 PDSD 叠加，混合时间在 400 毫秒到 1 秒之间。如果可能，两个 PDSD 都应该记录在同一个选择性标记的样品上。补充峰来自更远的 C13 原子之间的相关性。

在 resonance assignment（谐振分配）期间，请考虑选择性标记方案。在这种情况下，1-3-甘油。在这里，我们突出显示了长程接触峰值的示例，并明确分配到两个维度中。

Thenium 33 C-beta 与蛋白 45 C-α。完成长距离识别后，约束被分类为明确或模糊以及分子内或分子间。协议中列出了要为结构建模准备的约束列表。

在网上找到有关使用不同程序进行结构建模的教程。固体 NMR 数据，无论是单独使用还是与互补数据结合使用，都可以确定超分子组装体的原子级结构。固体核磁共振的优势在于，一方面，能够提供二级结构信息和分子内界面的原子距离限制，这可以集成到建模过程中。

然而，另一方面，固体 NMR 波谱的独特之处在于它能够在完整超分子组装的分子间界面处收集原子距离限制。然而，检测和区分分子内和分子间约束分配可能是一个繁琐的过程，通常需要制备选择性 C13 标记的样品。然而，随着选择性标记策略、波谱仪硬件设计和固体 NMR 方法的新发展，该技术正日益实现其理论潜力，即提供原子级分子信息，而不受物体大小、长距离有序或结晶度的限制。

这种方法使我们能够研究生物分子组装体的原子结构。仔细制备样品以优化 NMR 条件以获得高分辨率数据非常重要。通过这个协议，我们可以获得原子分辨率，这是蛋白质组装的信息。

并且这项技术可以与结构生物学中的其他技术相结合，以获得三维模型。