研究风味编码的新方法
2017年6月29日
我们提出三种新的方法来研究味觉编码。我们使用简单的动物Manduca sexta（ Manduca ）描述了一种解剖方案，使用细胞外tetrodes来记录多种味觉受体神经元的活性，以及用于递送和监测精确定时的滋味脉冲的系统。
这些方法的总体目标是通过记录体内多个受体神经元的活动来研究简单动物 mandi-casecsta 中的味觉编码，同时传递和监测精确定时的品尝脉冲。这些方法可以帮助回答有关味觉的关键问题，例如味觉受体神经元群如何编码味觉者。该技术的主要优点是它允许在精确传递的味觉刺激之前、期间和之后对多个味觉神经元进行体内记录。
刚接触这种方法的人可能会觉得它具有挑战性，因为解剖程序很复杂。因此，我们希望该方法的可视化演示会有所帮助。这些技术是 Sam Writer 在我实验室读研究生时开发的，孙奎将与 Alejandra 一起演示这些程序。
羽化后 3 天，选择外表健康的任一性别的飞蛾。翅膀应完全伸展，长鼻和触角应形成良好且完整。在通风橱中，将选定的飞蛾插入限制管中，直到露出头部。
然后，通过将薄纸插入管子的另一端来固定飞蛾。现在，使用注射器输送的加压空气，去除裸露头部的毛发。然后，将试管放在培养皿中的粘土平台上。
将头部的背侧朝上。接下来，保护触角和长鼻。首先，用切成半厘米长的 200 微升移液器吸头为每个结构制作盖子。
要纵长鼻，请用一根铁丝准备一个钩子。将喙伸入其中一个盖子中，直到喙的最近端部分受到保护。使用坚硬的蜡染蜡将管子固定到头胶囊的背面。
接下来，小心地将天线贴成薄片并用蜡染蜡固定管子。现在，通过切割带扣压缩肌来稳定大脑。在解剖显微镜下，使用显微解剖工具在喙下方做一个小切口，打开头囊。
为了确认肌肉被割伤，将蔗糖溶液提供给远端三分之二的喙，并确保喙没有伸展五分钟。然后，使用一层融化的蜡染蜡封闭头部胶囊。要用盐水灌注大脑，请在头部腹侧周围制作一个蜡杯。
使用电动打蜡机，开始沿着头部前部向后移动制作蜡杯。将喙管和触角管放在杯子内。继续向外和向上构建杯子，直到它达到眼睛的水平。
使用镊子取出阴唇触诊，并使用融化的蜡将它们连接到蜡杯上。接下来，使用二元环氧树脂上的物层密封蜡杯和管子中的任何开口。用牙签混合环氧树脂。
首先，覆盖杯子的外表面和内表面。其次，填充颈部周围的约束管部分，使头部更牢固地固定。20 分钟后，检查杯子是否泄漏。
要开始脑部手术，首先要切掉唇触诊。要打开头囊的腹侧，请沿头部前后和眼睛周围切开角质层。然后，沿着后脑勺切开，沿着靠近长鼻的头前部做更多的切割。
然后，用镊子轻轻提起角质层瓣，露出大脑。现在，执行最关键的步骤，暴露 SEZ 和上颌神经。缓慢而小心地去除脂肪组织和气管。
经常用新鲜生理盐水冲洗大脑。要非常小心，因为很容易压碎上颌神经。当 SEZ 和上颌神经最终可见时，它们将被一层薄鞘覆盖。
要去除此鞘，请排出任何多余的盐水，然后通过涂抹 10% 胶原酶分散酶溶液来削弱鞘。浸泡 5 分钟后，用生理盐水冲洗溶液数次。然后，用生理盐水冲洗几次后，使用超细显微解剖钳轻轻去除鞘。
最后，将盐水滴注管固定到灌注杯中。本节介绍如何构建和使用品尝剂递送系统。该系统由一根带有多个开口的试管组成。
这些开口为动物的长鼻、品尝剂歧管、颜色传感器提供了入口，并允许水通过。要构建这个系统，首先要准备一个长鼻的试管。使用烙铁打一个长鼻大小的孔。
然后，在管内构建一个筛选截面以将喙固定到位。在孔上方切下 5 毫米，将网眼涂上蜡，然后用蜡和环氧树脂重新连接管子。使用加压灌注系统输送试饮。
根据需要将任意数量的试管连接到歧管中。要连接 tastant 输出管，请在网孔上方约 1 厘米处打一个孔，然后用环氧树脂将输出管固定到上面。在每个品尝剂中，包括一种人工染料，以便由颜色传感器检测。
将颜色传感器连接到设备上，在网孔周围半厘米处，并使用环氧树脂将其固定在那里。使用蠕动泵通过硅管将蒸馏水输送到系统中。用一个大容器收集废水。
使用气动泵将品尝剂输送出一股空气。现在，开始通过管道泵送干净的水，并提供品尝脉冲以测试颜色传感器。现在，将三分之二的飞蛾长鼻的蒸馏液装入试管中。
使用镊子伸出喙并将其轻轻推入孔中。然后，用柔软的牙蜡和一层环氧树脂将喙密封到位。现在，连接盐水灌注管线并设置灌注流量。
然后，将双绞线四极管的接地电极浸入盐水浴中。然后，使用显微作器，将四极管放在上颌神经旁边，慢慢将其推进到神经中。检测到尖峰信号后，让制剂稳定至少 10 分钟，然后再进行记录。
使用所描述的方案在品尝分娩之前、期间和之后从味觉受体神经元进行记录。颜色传感器监测每个品尝的一秒脉冲的开始和偏移。品尝剂引起了四个通道中每个通道检测到的尖峰。
在尖峰序列中，可以观察到单个动作电位。使用尖峰分选软件将这些尖峰分配给独特的神经元。三种不同的味觉受体神经元对依次递送的 6 种味觉受体的反应揭示了不同水平的基线活性和对味觉选择性。
此外，回复的时间也不同。有些被锁定在刺激的持续时间内，而另一些则比刺激更持久。细胞内记录也可以使用传统的尖锐玻璃电极从味觉受体轴突进行。
细胞内记录与使用所述四极管技术观察到的反应非常相似，但四极管记录更容易制作、更持久且更稳健。看完这个视频后，你应该能够暴露 mandi-casecsta 中的上颌神经和食管下区，并能够构建一个具有精确时间控制的 tastant 输送系统。执行此方案时，请戴上实验室安全手套和口罩，因为 mandi-casecsta 的细粉状鳞屑脱落可能引起过敏。
一旦掌握，这个过程可以在三个半小时内完成。在此程序之后，还可以执行来自多个大脑区域的同步记录以回答其他问题，例如，当味觉受体神经元传递到突触后目标神经元时，它们对味觉受体神经元的反应是如何改变的。
概述
本文介绍了三种研究蛾类Manduca sexta味觉编码的新方法。这些技术包括解剖协议、味觉受体神经元的细胞外四极管记录，以及一种用于递送和监测味觉刺激的系统。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 行为生物学
- 电生理学
背景
- 理解味觉编码对于洞察感觉处理至关重要。
- 蛾类Manduca sexta是这些研究的简单模型生物。
- 从多个味觉受体神经元记录可以阐明味觉信息是如何编码的。
- 精确递送味觉物质对于准确的实验结果至关重要。
研究目的
- 开发体内记录味觉神经元的方法。
- 调查味觉物质如何被味觉受体神经元群体编码。
- 提供解剖和记录技术的视觉演示。
使用的方法
- 为神经记录准备蛾类的解剖协议。
- 使用细胞外四极管记录神经元活动。
- 递送和监测定时味觉物质脉冲的系统。
- 帮助新研究人员进行复杂解剖过程的视觉辅助工具。
主要结果
- 成功从多个味觉受体神经元进行体内记录。
- 证明了味觉物质递送系统的有效性。
- 提供了关于味觉信息编码的见解。
- 突出了解剖过程中的挑战和解决方案。
结论
- 开发的方法对于研究味觉编码很有价值。
- 体内记录可以增强对味觉处理的理解。
- 未来的研究可以在这些技术基础上进一步探索味觉。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding gustatory coding mechanisms provides foundational insights for target validation in neuroscience drug discovery, particularly for compounds modulating feeding behavior or metabolic pathways. The ability to record population-level neuronal responses in vivo supports mechanistic de-risking by linking molecular interventions to functional neural outputs. These methods enable predictive confidence in early discovery by quantifying how tastants are encoded across gustatory receptor neuron populations before downstream signal processing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking tastant identity and concentration to specific patterns of electrical activity across gustatory receptor neuron populations.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct in vivo measurement of neuronal responses before, during, and after stimulus delivery, clarifying target engagement in sensory pathways.
- Scientific Value: Facilitates pathway characterization by revealing how individual neurons contribute to population-level coding, aiding in target selection for modulating feeding-related behaviors.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by enabling consistent extracellular recording of multiple gustatory receptor neurons using tetrode arrays.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility through precise temporal control of tastant delivery and real-time monitoring via color sensor feedback, reducing variability in stimulus presentation.
- Scientific Value: Enables screening readiness by generating quantifiable spike train outputs that can be sorted to identify individual neuron responses, supporting reliable compound evaluation in taste-modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by linking in vivo gustatory receptor neuron activity to downstream brain processing, allowing assessment of how sensory signals are transformed at postsynaptic targets.
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by providing baseline neuronal response profiles that can be used to detect compound-induced alterations in coding fidelity.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking by distinguishing between stimulus-locked and sustained neuronal responses, helping to differentiate direct sensory effects from secondary network adaptations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, particularly for targets involved in chemosensory signaling and feeding behavior regulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling researchers to determine how specific tastants are encoded by defined populations of gustatory receptor neurons, clarifying molecular receptive ranges.
- Screening: Describes assay readiness through stable tetrode recordings that yield consistent spike detection across channels, allowing comparison of neuronal responses under different conditions.
- Analytics: Highlights spike sorting as a key analytical output that assigns action potentials to unique neurons, enabling resolution of individual contributions to population coding.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating how gustatory receptor neuron responses propagate to follower neurons in the brain, informing postsynaptic target validation.
- Enterprise Reuse: Positions the tetrode-based recording system as a reusable platform for longitudinal studies, as recordings are longer lasting and more robust than intracellular sharp electrode methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how tastant identity and concentration are represented in neural activity patterns.
- Operational Value: Improves standardization and scalability through a perfusable preparation that supports repeated recordings and simultaneous multi-area monitoring.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by providing objective, quantifiable neural readouts that correlate tastant delivery with electrophysiological outcomes, reducing reliance on behavioral proxies alone.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds that alter gustatory coding fidelity, enabling early detection of off-target sensory effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection, microsurgery, and electrophysiology to successfully expose maxillary nerves and subesophageal zone without damaging delicate structures.
- Dependent on specialized instrumentation including micromanipulators, tetrodes, perfusion systems, and color sensors for tastant delivery and monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of dissection and wax-sealing protocols to ensure consistent preparation quality across users and laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending the approach to other model systems, as the maxillary nerve accessibility and sheath removal techniques are species-specific.
- Includes practical limitations such as the intricate dissection process and allergenic scaling from the moth, which require safety precautions and may limit throughput.
