Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

中动脉闭塞模型中皮质纹状体切片模型中酸中毒治疗的总体目标是研究酸性后调节对脑缺血的神经保护作用。这种方法可以帮助回答酸中毒后调节如何保护缺血性脑损伤的关键问题，并开发新的中风治疗策略。该技术的主要优点是能够使用广泛可用的实验模型来研究酸中毒后条件反射的神经保护作用。

演示该程序的是我实验室的研究生 Yarong Zheng。首先用细抹刀从被斩首的老鼠的头骨中取出大脑，然后小心地将其放入装有冰冷的常规 ACSF 的烧杯中，该烧杯与 5% 的二氧化碳和 95% 的氧气平衡。将冷沉淀胶分两条涂在 vibratone 板上。

将一块 3% 的琼脂糖放在离刀片最远的胶条上，以支持大脑。然后用镊子将大脑转移到滤纸上。用刀片切掉额杆和小脑。

将脑组织垂直放在自由胶条上，使大脑靠在琼脂糖上。将冰冷的 ACSF 添加到切割容器中，以浸没大脑并将冰块添加到冰架区域。将 ACSF 保存在储液罐中，用 5% 的二氧化碳和 95% 的氧气鼓泡。

将振动音设置为切割 400 微米的切片，并正确定位大脑相对于切割刀片后，按下启停按钮开始自动切割。使用带有切割尖端的巴斯德移液器将五个脑切片一一转移，然后将它们放入冰冷的常规 ACSF 中，用 5% 的二氧化碳和 95% 的氧气鼓泡。在室温下 30 分钟后，将脑切片放入 37 摄氏度的水浴中 10 分钟以恢复突触功能。

将无葡萄糖 ACSF 和酸性 ACSF 放入 37 摄氏度的水浴中，分别用 5% 的二氧化碳和 95% 的氮气以及 20% 的二氧化碳和 80% 的氧气将溶液泡出 30 分钟。小心地将 5 个脑切片中的 4 个转移到预热的 37 摄氏度、无葡萄糖的 ACSF 中，并孵育 15 分钟。为了研究酸性预处理的时间窗口，将一个切片直接从无葡萄糖 ACSF 转移到酸性 ACSF，然后将其他三个切片转移到常规 ACSF 进行再灌注。

三分钟后，将酸性 ACSF 切片转移到普通 ACSF 中。然后在常规 ACSF 中 5 分钟后，将其中一片从常规 ACSF 转移到酸性 ACSF 中的组织支架中 3 分钟。再灌注后 15 分钟以相同的方式转移另一片。

放置在无葡萄糖 ACSF 而不是酸性 ACSF 中的剩余切片被设置为氧葡萄糖剥夺组。将切片从 ACSF 转移到含有 TTC 溶液的 24 孔板的孔中。在溶液中拉伸切片。

然后在 37 摄氏度的浅水浴中孵育 30 分钟。接下来，将切片转移到干净的、称重的 1.5 毫升离心管中，并用箔纸覆盖并测量切片的干重。称量后，将乙醇和二甲基亚砜的一比一溶液以 10 比 1 的体积重量比加入试管中，提取甲臜。

避光孵育 24 小时。第二天，将乙醇二甲基亚砜溶液从试管转移到 96 孔板中，并使用读板器测量 490 纳米处的吸光度。首先，在没有脚趾捏反射的情况下确认适当的麻醉。

然后将带有 LDF 探针的麻醉小鼠置于仰卧位，并使用无菌棉线固定。用 75% 乙醇对剃光的颈部皮肤进行消毒。然后在颈部钝器上做一个正中周围皮肤切口后，用镊子钝器解剖软组织以暴露血管。

在暴露的组织中加入一滴盐水以保持水分。接下来，使用眼镊子从周围组织和迷走神经中解剖颈总动脉。小心不要损伤迷走神经。

将微血管夹放在颈总动脉的远端。并在近端用 6-0 丝缝线打一个死结。然后在夹子近端打一个松散的结作为临时缝合。

接下来，使用微型眼科剪刀在两个结之间做一个小的纵向切口，尽可能靠近死结。现在将一根 12 毫米的尖端钝化单丝穿过切口插入动脉腔并将其推进几毫米。拧紧单丝尖端周围的松散结，然后取下夹子。

然后使用眼泪钳将细丝推进到颈内动脉中，直到 LDF 软件显示血流量急剧下降。记录遮挡的开始时间。然后切断 LDF 探针，将鼠标放入 30 摄氏度的培养箱中，闭塞 1 小时。

封闭开始后 55 分钟，用异氟醚重新麻醉动物，并像以前一样定位动物。然后打开颈部切口，重新暴露颈总动脉。闭塞期后，用眼用镊子轻轻拉出细丝，实现再灌注。

然后通过收紧结将临时缝合线变成永久缝合线。对于酸中毒治疗，将鼻锥吸入的气体改为 20% 二氧化碳、20% 氧气和 60% 氮气，持续 5 分钟。用中断的手术缝合线闭合切口后，将小鼠置于 30 摄氏度的加热笼中，直到小鼠恢复意识。

该直方图显示了在氧、葡萄糖剥夺和酸性后处理后对皮质切片进行的 TTC 测定的结果，如本视频所示。如果立即开始治疗或在氧葡萄糖剥夺后 5 分钟开始治疗，则 3 分钟的酸中毒治疗具有神经保护作用，但如果切片再灌注 15 分钟，则不具有神经保护作用。小鼠接受大脑中动脉闭塞 60 分钟，并在再灌注后 5 、 50 或 100 分钟吸入 20% 二氧化碳 5 分钟进行治疗。

再灌注后 24 小时用 2 、 3 、 5 盐酸三苯基四唑染色定量梗死体积，如黑色虚线所示。此直方图显示每种情况的梗死体积百分比。即使再灌注后起效时间延迟至 50 分钟，酸性后处理的神经保护作用也很强。

然而，在 100 分钟开始的酸中毒治疗并没有阻断缺血性损伤。观看视频后，您应该对如何在脑切片的 OGD 模型和小鼠的 MSO 模型上研究酸中毒后处理的神经保护有很好的了解。在尝试这些程序时，重要的是要记住酸中毒的延长和持续时间对于再现保护作用非常重要。