Name: 实验模型研究酸性后处理对脑缺血的神经保护作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学习酸性后处理技术用于脑缺血神经保护研究，通过体外皮质纹状体切片和体内大脑中动脉闭塞模型，探索酸中毒治疗对中风治疗的潜在应用价值。

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本工作由国家自然科学基金（81573406、81373393、81273506、81221003、81473186 和 81402907）、浙江省自然科学基金（LR15H310001）及浙江省领军型创新团队支持计划资助&amp;T创新团队（2011R50014）

所有实验均经浙江大学动物实验伦理委员会批准，并遵循其伦理准则进行，完全符合美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的要求。实验过程中尽可能减少动物的任何疼痛或不适，并使用最少数量的动物。
1. 大脑皮层-纹状体脑片的氧糖剥夺
<ol>
	<li>溶液配制：
	<ol>
		<li>配制 1,000 mL r-ACSF（124 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1.25 mmol/L KH2PO4、2 mmol/L MgSO4、26 mmol/L NaHCO3、2 mmol/L CaCl2、10 mmol/L 葡萄糖，最终 pH 为 7.4）。整个实验过程中用 5% CO2 和 95% O2 持续通气。</li>
		<li>按上述方法配制 200 mL 无葡萄糖 ACSF（gf-ACSF），但不添加葡萄糖，并用 5% CO2 和 95% N2 通气。在应用于脑片前，先通气 30 分钟以降低溶液中的氧含量。持续通气直至氧糖剥夺（OGD）操作完成。</li>
		<li>通过将 200 mL r-ACSF 与 20% CO2 和 80% O2 平衡来配制酸性 ACSF（a-ACSF）。在应用于脑片前通气 30 分钟，使溶液 pH 降至 6.8，并持续通气直至 APC 操作完成。</li>
		<li>将三个组织储存槽分别放入 r-ACSF、gf-ACSF 和 a-ACSF 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑片制备： 
	注意：本研究使用 8 周龄雄性 C57Bl/6J 小鼠。动物饲养于受控温度（22 ± 2 °C）环境中，光照-黑暗周期为 12 小时，并可自由获取颗粒饲料和饮水。
	<ol>
		<li>在诱导室中使用过量异氟烷处死小鼠，随后进行断头。使用小剪刀和镊子解剖出脑组织。用薄刮刀取出脑组织，小心放入盛有冰浴 r-ACSF（已用 5% CO2 和 95% O2 平衡）的玻璃烧杯中。 
		注意：上述步骤应尽可能快速且细致地完成。</li>
		<li>将脑组织置于冰浴 r-ACSF 中 5 分钟。调节气体压力以避免脑组织移动。</li>
		<li>在振动切片机平台上用冷冻沉淀胶涂抹两条胶带。在远离刀片的一侧胶带上放置一块 3% 琼脂糖以支撑脑组织。</li>
		<li>将一个直径 10 cm 的培养皿倒置在冰上，然后在皿内放置一张滤纸。用数滴冰浴 r-ACSF 润湿滤纸。</li>
		<li>用镊子将脑组织转移至滤纸上。用刀片和镊子切除前极和小脑。 
		注意：横切面应尽可能平整，并垂直于矢状面。</li>
		<li>将剩余脑组织垂直放置在另一条胶带上，并使其紧靠琼脂糖支撑。向切割储液槽中加入冰浴 r-ACSF 以完全浸没脑组织，并在冰槽区域加入冰块。保持储液槽中的 r-ACSF 持续通以 5% CO2 和 95% O2。</li>
		<li>升起储液槽，调整刀片位置，使刀片尽可能靠近脑组织并略高于其表面。</li>
		<li>选择 &#34;CONT&#34; 模式以连续切割脑片。设定切片厚度为 400 µm，振动频率为 6–8，切割速度为 3–4。按下 &#34;start/stop&#34; 按钮开始自动切割。</li>
		<li>剪去 3 mL 巴斯德移液管的尖端，使其开口大小与脑片相匹配。 
		注意：开口应足够大，以避免对脑片造成额外损伤。</li>
		<li>用剪过尖端的巴斯德移液管逐个吸取五片脑片，并将其转移至盛有冰浴 r-ACSF（持续通以 5% CO2 和 95% O2）的组织储存槽中。不收集第一片切出的脑片。调节气体压力以避免脑片移动。 
		注意：脑片之间不应相互重叠。</li>
		<li>将脑片在室温 r-ACSF 中孵育 30 分钟，随后在 37 °C 水浴中再孵育 10 分钟，以恢复突触功能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氧糖剥夺（OGD）与酸性灌注预处理（APC）：
	<ol>
		<li>将 gf-ACSF 和 a-ACSF 放入 37 °C 水浴中，并按照 1.1.2 和 1.1.3 所述分别用相应气体通气 30 分钟。</li>
		<li>将一片脑片保留在 r-ACSF 中作为对照。将另外四片脑片小心转移至预热的 gf-ACSF 组织储存槽中，孵育 15 分钟。随后将这些脑片转移回 r-ACSF 组织储存槽中以实现再灌注。</li>
		<li>为研究 APC 的时间窗，将一片脑片直接从 gf-ACSF 转移至 a-ACSF。将另外三片脑片先转移至 r-ACSF，然后分别在再灌注后 5 分钟和 15 分钟时，将其中两片转移至 a-ACSF 组织储存槽中。</li>
		<li>将这两片脑片在 a-ACSF 中孵育 3 分钟后，再转移回 r-ACSF。将这三片脑片在 r-ACSF 中继续孵育 1 小时。将剩余脑片保留在 r-ACSF 中作为 OGD 组。</li>
		<li>进行剂量反应研究时，OGD 后先将全部四片脑片转移至 r-ACSF 组织储存槽中，孵育 5 分钟。然后将一片脑片保留在 r-ACSF 中作为 OGD 组，其余三片转移至 a-ACSF 中。分别在 a-ACSF 中孵育 1、3 和 5 分钟后，再转移回 r-ACSF，并在 r-ACSF 中继续孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑片活力测定：
	<ol>
		<li>配制 0.25% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）生理盐水溶液。将 1.25 g TTC 粉末加入 500 mL 生理盐水中。 
		注意：待粉末完全溶解后，将溶液转移至用铝箔包裹的 24 孔板中（每孔 500 µL），并在 4 °C 下保存。TTC 及经 TTC 染色的组织对光敏感。</li>
		<li>将脑片转移至含有 TTC 溶液的 24 孔板中（每孔一片），并在溶液中将其展开。将脑片置于 37 °C 浅水浴中孵育 30 分钟。</li>
		<li>将脑片转移至用铝箔包裹的洁净 1.5 mL 离心管中，测定脑片干重。</li>
		<li>向离心管中加入乙醇/二甲基亚砜（1:1）溶液（体积与重量比为 10:1），以提取甲臜。将脑片在避光条件下室温孵育 24 小时。</li>
		<li>将各管中的乙醇/二甲基亚砜溶液全部转移至 96 孔板中，使用酶标仪在 490 nm 波长处测定吸光度。</li>
		<li>将吸光度值按脑片干重进行归一化处理，并以对照组脑片的百分比形式表示活力。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大脑中动脉闭塞（MCAO）
<ol>
	<li>准备：
	<ol>
		<li>使用70%乙醇对工作台、激光多普勒血流仪（LDF）仪器及其附件表面进行消毒。</li>
		<li>准备已灭菌的器械：剪刀两把，10 cm；镊子两把，10 cm；眼科镊一把，11 cm；显微眼科剪一把，9 cm；微血管夹一个，1.8 cm；持针器一个，12.5 cm；若干手术缝线（△ 1/2 4 × 10）；棉签。</li>
		<li>准备一支不含针头的注射器，内装生理盐水，用于维持操作区域湿润。</li>
		<li>准备麻醉气体（100% O2&#160;+&#160;异氟烷）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑血流检测：
	<ol>
		<li>设置激光多普勒血流仪。</li>
		<li>向小鼠腹腔注射镇痛药：安乃近 200 mg/kg，卡洛芬 4 mg/kg，丁丙诺啡 0.1 mg/kg。</li>
		<li>将小鼠放入诱导室，使用含4%异氟烷的氧气进行麻醉，直至其身体和胡须的自发运动停止。</li>
		<li>将小鼠置于俯卧位，鼻部接入鼻罩，并在后续操作中维持1.5%异氟烷麻醉。</li>
		<li>在双眼上涂抹右旋泛醇眼膏。</li>
		<li>使用70%乙醇对头部进行消毒。</li>
		<li>使用手术刀在眼与耳之间做右侧旁正中皮肤切口，暴露前囟。</li>
		<li>用无菌棉球擦拭颅骨表面。</li>
		<li>在颅骨表面滴加一至两滴手术胶水。</li>
		<li>将光纤探头尖端置于前囟后方5&#160;mm、中线外侧6 mm处。</li>
		<li>在计算机软件上开始记录血流信号。待血流基线稳定后，在胶水上滴加20 µL固化剂以固定探头。 
		注：理想的基线值应高于500 flux。</li>
		<li>若基线值低于200 flux，需微调探头位置以获得合适的基线。实验期间保持探头牢固附着于颅骨。</li>
		<li>光纤探头固定后，使用碘伏对头部进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大脑中动脉闭塞（MCAO）：
	<ol>
		<li>将已麻醉的小鼠（颅骨上已固定LDF探头）仰卧位固定，并在整个手术过程中使用加热灯维持体温。使用70%乙醇对颈部进行消毒。</li>
		<li>使用手术刀在颈部做旁正中皮肤切口，用镊子钝性分离软组织以暴露血管。在暴露的组织上滴加一滴生理盐水以保持湿润。</li>
		<li>使用眼科镊将颈总动脉从周围组织和迷走神经中分离出来，注意避免损伤迷走神经。&#160;暴露颈总动脉后，再次使用碘伏对颈部皮肤进行消毒。</li>
		<li>在颈总动脉远端放置微血管夹，并在近端用6-0丝线打结固定。夹子应尽可能靠近近端，以便后续操作。确保夹子与结扎点之间的血管长度尽可能长，以利于后续操作。</li>
		<li>在夹子近端打一个松结作为临时缝线，确保两个结之间有足够的空间用于插入单丝线栓。</li>
		<li>使用显微眼科剪在两个结之间做一小段纵向切口，切口应尽可能靠近结扎点。注意避免切断血管。</li>
		<li>通过切口将12 mm钝头单丝线栓插入动脉腔内，并推进数毫米。收紧松结固定线栓头部，然后移除血管夹。</li>
		<li>使用眼科镊将线栓沿颈内动脉推进约10 mm，以阻塞大脑中动脉，直至LDF软件显示血流显著下降（&#62;较基线血流减少80%以上）。记录闭塞开始时间。 
		注：LDF仪器设置详见第2.2节。</li>
		<li>闭塞大脑中动脉1小时。切断LDF探头连接，将小鼠置于30 °C培养箱中完成闭塞期。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再灌注与酸中毒处理（APC）：
	<ol>
		<li>在闭塞开始后55分钟，按前述方法使用异氟烷重新麻醉动物。将小鼠仰卧位固定，切开颈部切口，重新暴露颈总动脉。</li>
		<li>闭塞期结束后，用眼科镊轻轻拉出线栓以实现再灌注，并通过收紧结扎将临时缝线转为永久结扎。</li>
		<li>如需进行酸中毒处理，在再灌注后5、50或100分钟时，将鼻罩吸入气体更换为含20% CO2、20% O2 和60% N2 的混合气体，持续5分钟。使用间断缝合关闭切口。</li>
		<li>将小鼠置于30 °C加热笼中，直至其恢复意识，随后转移至清洁的单独笼具中。提供培养皿盛装的饮水和湿润饲料。术后密切观察小鼠是否出现剧烈疼痛或死亡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑梗死体积测定：
	<ol>
		<li>在再灌注后24小时，采用TTC染色法测定脑梗死体积。</li>
		<li>在预定处死时间前，按步骤1.4.1所述配制0.25% TTC溶液。将溶液分装至24孔板中（每孔1 mL），用铝箔包裹后于4 °C保存。 
		注：TTC及其染色组织对光敏感。</li>
		<li>再灌注24小时后，在诱导室中使用过量异氟烷处死动物，断头取脑。使用小剪刀和镊子分离脑组织。检查脑表面出血点，排除在Willis环处发生蛛网膜下腔出血的小鼠。</li>
		<li>将脑组织置于放置于-20 °C冰袋上的洁净载玻片上，连同载玻片一起放入-20 °C冰箱中5分钟，以便后续切片。</li>
		<li>从-20 °C环境中取出脑组织和载玻片，放回-20 °C冰袋上。使用刀片和镊子切除额极和小脑。</li>
		<li>用刀片将脑组织水平切成1 mm厚的切片，共5片。用镊子将切片转移至含TTC溶液的24孔板中（每孔一片），并在溶液中展平切片。将切片置于37 °C水浴中避光孵育30分钟。</li>
		<li>吸除TTC溶液，每孔加入10%甲醛溶液1 mL，室温孵育30分钟。将切片按切割顺序排列于透明薄膜上，扫描至图像分析仪中。</li>
		<li>使用ImageJ分析软件8基于视觉识别，计算梗死面积占整个脑切片面积的百分比；见图2（左）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhao, H., Sapolsky, R. M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrupting+reperfusion+as+a+stroke+therapy%3A+ischemic+postconditioning+reduces+infarct+size+after+focal+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Interrupting reperfusion as a stroke therapy: ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26 (9), 1114-1121 (2006).</li>
<li>Leconte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+hypoxic+postconditioning+protects+against+cerebral+ischemia+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Delayed hypoxic postconditioning protects against cerebral ischemia in the mouse.</a> Stroke. 40 (10), 3349-3355 (2009).</li>
<li>Fan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+lack+of+glucose+but+not+O2+is+involved+in+ischemic+postconditioning-induced+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurosci+Ther%22%5BJournal%5D)">Transient lack of glucose but not O2 is involved in ischemic postconditioning-induced neuroprotection.</a> CNS Neurosci Ther. 19 (1), 30-37 (2013).</li>
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<li>Ren, C., Yan, Z., Wei, D., Gao, X., Chen, X., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limb+remote+ischemic+postconditioning+protects+against+focal+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats.</a> Brain Res. 1288, 88-94 (2009).</li>
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<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+limb+ischemic+postconditioning+protects+mouse+brain+against+cerebral+ischemia%2Freperfusion+injury+via+upregulating+expression+of+Nrf2%2C+HO-1+and+NQO-1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remote limb ischemic postconditioning protects mouse brain against cerebral ischemia/reperfusion injury via upregulating expression of Nrf2, HO-1 and NQO-1 in mice.</a> Int J Neurosci. , 1-8 (2015).</li>
<li>Fan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+neuroprotective+strategy+for+ischemic+stroke%3A+transient+mild+acidosis+treatment+by+CO2+inhalation+at+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">A novel neuroprotective strategy for ischemic stroke: transient mild acidosis treatment by CO2 inhalation at reperfusion.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 275-283 (2014).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARK2-dependent+mitophagy+induced+by+acidic+postconditioning+protects+against+focal+cerebral+ischemia+and+extends+the+reperfusion+window%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PARK2-dependent mitophagy induced by acidic postconditioning protects against focal cerebral ischemia and extends the reperfusion window.</a> Autophagy. 0, (2017).</li>
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<li>Zhang, X., Ding, H. Z., Jiang, S., Zeng, Y. M., Tang, Q. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+study+of+the+neuroprotective+effect+of+propofol+on+hypoxic+hippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Inj%22%5BJournal%5D)">An in vitro study of the neuroprotective effect of propofol on hypoxic hippocampal slice.</a> Brain Inj. 28 (13-14), 1758-1765 (2014).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+profiling+with+HPLC-FTMS+of+exogenous+and+endogenous+chemicals+susceptible+to+the+administration+of+chotosan+in+an+animal+model+of+type+2+diabetes-induced+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Chemical profiling with HPLC-FTMS of exogenous and endogenous chemicals susceptible to the administration of chotosan in an animal model of type 2 diabetes-induced dementia.</a> J Pharm Biomed Anal. 104, 21-30 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了两种用于研究活化蛋白C（APC）对脑缺血神经保护作用的实验模型。在脑片模型中，再灌注开始后，将小鼠皮质纹状体脑片置于经20% CO2气体饱和的酸性缓冲液中孵育以实现APC；而在大脑中动脉阻塞（MCAO）模型中，再灌注后通过让小鼠吸入20% CO2实现APC。这两种模型均能反映APC对脑缺血的神经保护作用。其保护效果与缺血后处理相当，但具有更宽的时间窗。在MCAO模型中，APC的时间窗可长达再灌注后50分钟，而缺血后处理仅为10分钟15。此外，APC操作更为简便且安全性更高。
在皮质-纹状体脑片模型中，轻柔且快速的操作对于最大限度地保持脑片的活性至关重要。进行MCAO操作时，需要监测脑血流，并观察到血流急剧下降，以确认大脑中动脉的阻塞。在脑组织取出进行TTC染色后，必须仔细检查脑组织，以排除蛛网膜下腔出血。
酸中毒的强度和持续时间对于实现APC的神经保护作用至关重要。在皮质-纹状体脑片模型中，延长酸中毒处理时间并无益处（<str...

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。近几十年来，人们为寻找有效的脑卒中治疗方法付出了巨大努力，但成果仍不理想。后处理是指在缺血事件发生后通过亚毒性刺激进行干预的一种过程。缺血后处理、缺氧后处理、低糖后处理以及远隔缺血后处理等均可激活内源性适应机制，已被证明是防治脑缺血具有前景的治疗策略1,2,3,4。然而，缺血后处理可能带来额外的损伤。肢体远隔缺血后处理通常需要在同侧或双侧后肢进行数个循环的5–20分钟缺血与再灌注5,6,7。因此，这些后处理操作在临床实践中存在风险或难以实施。为克服上述缺点，我们开发了APC作为小鼠局灶性脑缺血的治疗方法8。APC仅需通过吸入20% CO2即可诱导，以更可行且安全的方式显著减轻缺血性脑损伤。近期我们进一步证实，APC可延长再灌注时间窗，凸显其在脑卒中治疗中的重要意义9。
本文介绍了两种用于研究活化蛋白C（APC）对脑缺血神经保护作用的实验模型。第一种是小鼠皮质纹状体脑片的氧糖剥夺（OGD）模型。通过快速制备并将脑片转移至人工环境中（通常为人工脑脊液，ASCF），可维持细胞活力和神经元环路完整性，从而实现对脑功能的研究 体外10,11在ASCF中进行OGD可模拟脑缺血并诱导缺血性损伤12,13,14. OGD后，脑片在常规ASCF（r-ASCF）中重新孵育以实现再灌注，随后在通入20% CO的酸性ASCF中用APC处理2与原代培养细胞相比，皮质-纹状体脑片保持了完整的组织学特征。
研究大脑功能 体内，采用小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。通过颈总动脉插入火焰烧钝的单丝线栓以阻塞大脑中动脉。作为最常用的脑卒中模型之一，MCAO模型具有临床相关性，且使用单丝线栓更易于实现再灌注。仅需吸入含20% CO的常氧混合气体2 再灌注开始后，APC 显示出对脑缺血的显著保护作用，表现为脑梗死体积减小。

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>阿拉丁工业公司</td><td>E111993</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>激光多普勒血流仪</td><td>Moor Instruments Ltd</td><td>Model Moor VMS-LDF2</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醚</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>80059618</td><td></td></tr><tr><td>水合三氯乙醛</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>30037517</td><td></td></tr><tr><td>10% 福尔马林</td><td>阿拉丁工业公司</td><td>F111936</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Jet Biofil</td><td>TCP-010-024</td><td></td></tr></tbody></table>

研究酸性后处理对脑缺血神经保护作用的实验模型

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，目前可用的治疗手段有限。作为一种内源性神经保护策略，缺血后处理已被证明是抗脑缺血的有前景疗法。然而，复杂的操作流程和潜在的安全问题限制了其临床应用。为克服这些缺点，我们开发了酸性后处理（APC）作为实验性局灶性脑缺血的治疗手段。APC是指在缺血后灌注期间通过吸入CO2实现轻度酸中毒的治疗方法。本文介绍了分别用于实施APC的体外（in vitro）和体内（in vivo）两种模型。采用小鼠氧糖剥夺（OGD）处理以及小鼠皮质纹状体阻塞和大脑中动脉阻塞（MCAO）来模拟脑缺血。APC可通过将脑片转移至用20% CO2气体饱和的酸性缓冲液，或让小鼠吸入20% CO2气体来简便实现。APC在组织存活力和脑梗死体积方面的表现显示出对脑缺血显著的保护作用。

在上述描述的皮质-纹状体脑片模型中，于再灌注后1小时通过TTC染色法量化皮质-纹状体脑片的存活性。TTC转化率通过将490 nm处的吸光度归一化至对照脑片进行计算。根据TTC转化结果，酸中毒预处理对氧糖剥夺（OGD）诱导的再灌注损伤具有保护作用，且该保护作用具有起始时间和持续时间依赖性。具体而言，在15分钟OGD后5分钟进行酸中毒处理时，1分钟和3分钟的酸化处理均显著提高了脑片存活性，而5分钟处理则无此效果（OGD: 0.609 ± 0.029，5/1: 0.758 ± 0.034，5/3: 0.821 ± 0.041，5/5: 0.672 ± 0.053，数据以均值 ± 标准误表示）（图1A）。酸中毒处理的神经保护作用在再灌注后5分钟内仍存在，但在15分钟时则消失（OGD: 0.584 ± 0.044，0/3: 0.762 ± 0.036，5/3: 0.833 ± 0.062，15/3: 0.627 ± 0.038）（图1</stron...

酸性后处理可保护脑缺血损伤。本文介绍了两种实施酸性后处理的模型，分别通过在氧糖剥夺后将皮质-纹状体脑片转移至酸性缓冲液中来实现。 体外 并通过吸入20% CO2 大脑中动脉闭塞后 体内.

中风是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，目前可用的治疗方法有限。作为一种内源性策略，……

在大脑中动脉闭塞模型的皮质-纹状体脑片模型中，酸中毒治疗的总体目标是研究酸性后处理对脑缺血的神经保护作用。该方法有助于回答酸中毒后处理如何保护缺血性脑损伤的关键科学问题，并为卒中治疗开发新策略。该技术的主要优势在于能够利用广泛可用的实验模型来研究酸中毒后处理的神经保护作用。演示该操作的是我实验室的研究生 Yarong Zheng。首先，使用一把薄刮铲从断头小鼠的颅骨中取出脑组织，并小心地将其放入一个含有冰冻常规人工脑脊液（ACSF）的烧杯中，该人工脑脊液已用5%二氧化碳和95%氧气平衡。将冷冻沉淀胶以两条带状涂抹在振动切片机的载物板上。在远离刀片的胶条上放置一块3%琼脂糖以支撑脑组织。然后用镊子将脑组织转移至滤纸上。用刀片切除额极和小脑。将脑组织垂直放置在胶水的自由端上，使脑组织紧靠琼脂糖。向切片储液槽中加入冰冻的ACSF，浸没脑组织，并在冰盒区域加入冰块。用5%二氧化碳和95%氧气持续鼓泡维持储液槽中的ACSF。将振动切片机设置为切割400微米厚的切片，并将脑组织相对于切割刀片正确放置后，按下启停按钮开始自动切片。使用尖端剪切过的巴斯德吸管，将五片脑切片逐一转移并放入盛有冰冻标准人工脑脊液（ACSF）的组织储存槽中，该ACSF需持续通入5%二氧化碳和95%氧气。室温孵育30分钟后，将脑切片转移至37摄氏度水浴中孵育10分钟，以恢复突触功能。将无葡萄糖人工脑脊液（ACSF）和酸性 ACSF 置于 37 摄氏度水浴中，分别用 5% 二氧化碳和 95% 氮气、20% 二氧化碳和 80% 氧气混合气体通气 30 分钟。小心地将五片脑片中的四片转移至预热至 37 摄氏度的无葡萄糖 ACSF 中，孵育 15 分钟。为研究酸性预处理的时间窗，将一片脑片直接从无葡萄糖 ACSF 转移至酸性 ACSF，其余三片转移至常规 ACSF 中进行再灌注。三分钟后，将切片从酸性ACSF转移至常规ACSF中。随后在常规ACSF中孵育五分钟，再将其中一片切片从常规ACSF转移至酸性ACSF中的组织托架内，孵育三分钟。在再灌注15分钟后，以相同方式转移另一片切片。未置于酸性ACSF但置于无葡萄糖ACSF中的剩余脑片设为氧糖剥夺组。将脑片从ACSF中转移至含有TTC溶液的24孔板的孔中。在溶液中将脑片展开。然后在37摄氏度的浅层水浴中孵育30分钟。接下来将组织切片转移至洁净、已称重、用铝箔包裹的1.5毫升离心管中，并测定切片的干重。称重后，按每10体积溶液对应1重量组织的比例，向管中加入乙醇与二甲基亚砜的1:1混合溶液，以提取四氮唑盐还原产物（Formazan）。避光孵育24小时。次日，将乙醇二甲基亚砜溶液从离心管转移至96孔板中，使用酶标仪在490纳米处测定吸光度。首先通过脚趾夹捏反射消失确认麻醉效果。然后将麻醉后头部连接有LDF探头的小鼠置于仰卧位，并使用无菌棉线固定。用75%乙醇对颈部剃毛区域的皮肤进行消毒。随后，在颈部做一正中旁皮肤切口，用镊子钝性分离软组织，暴露血管。向暴露的组织滴加一滴生理盐水以保持其湿润。接着，使用眼科镊子将颈总动脉从周围组织和迷走神经中分离出来。注意不要损伤迷走神经。在颈总动脉远端放置一个微血管夹，并在近端用6-0丝线结扎打结。然后在夹子近端打一个松结作为临时缝线。接下来，使用显微眼科剪在两个结之间靠近死结处做一个小的纵向切口。现在将一根12毫米长、尖端钝化的单丝线通过切口插入动脉腔内，并向前推进数毫米。将松结收紧在单丝线的尖端周围，然后移除夹钳。然后使用眼科镊子将丝线推进至颈内动脉，直至激光多普勒血流仪（LDF）软件显示血流出现急剧下降。记录闭塞开始时间。随后移除LDF探头，将小鼠置于30摄氏度的培养箱中，维持闭塞状态一小时。在阻塞开始后55分钟，用异氟烷重新麻醉动物，并按之前的方法摆好体位。然后打开颈部切口，重新暴露颈总动脉。阻塞期结束后，使用眼科镊子轻轻拉出尼龙线以实现再灌注。然后将临时缝线通过收紧结扎转为永久缝线。为治疗酸中毒，将鼻罩吸入的气体更换为20%二氧化碳、20%氧气和60%氮气，持续5分钟。用间断外科缝合法闭合切口后，将小鼠置于30摄氏度加热的笼子中，直至其恢复意识。该直方图显示了本视频中展示的皮层切片在经历缺氧缺糖及酸性后处理后的TTC染色实验结果。若在缺氧缺糖后立即或5分钟后开始酸中毒处理，3分钟的处理具有神经保护作用；但如果切片再灌注15分钟后，则无此保护作用。小鼠接受60分钟的中动脉闭塞，并在再灌注后5分钟、50分钟或100分钟时通过吸入20%二氧化碳进行5分钟治疗。再灌注后24小时，通过两、三、五三苯基四氮唑氯化物染色法对梗死体积进行定量，黑色虚线所示区域为梗死范围。该直方图显示了每种条件下的梗死体积百分比。即使酸性后处理的开始时间延迟至再灌注后50分钟，其神经保护作用仍然显著。然而，在100分钟时开始的酸中毒治疗并未阻断缺血性损伤。观看视频后，您应充分了解如何在脑片的氧糖剥夺（OGD）模型以及小鼠的MSO模型中研究酸中毒后处理的神经保护作用。在实施相关操作时，需牢记酸中毒的强度和持续时间对于重现保护效应至关重要。

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实验模型研究酸性后处理对脑缺血的神经保护作用

我们旨在阐明介导冷适应性神经免疫信号传导的机制，以期发现新的治疗靶点，从而在脑损伤发生前对其进行保护。本文介绍了开展此类研究的策略，这些策略需要具备生物系统、实验操作以及高度可重复且灵敏的技术手段。...

冷预处理神经保护作用的研究策略

大脑中动脉（MCA）结扎是一种用于在动物模型中研究局灶性脑缺血的技术。该方法通过开颅暴露大脑中动脉，并采用电凝法进行结扎。与其他现有方法相比，该技术可获得高度可重复的梗死体积，并提高术后存活率。...

小鼠永久性大脑中动脉结扎的应用

越来越多的证据表明，缺血预处理（PC）——即对脑组织施加一次非损伤性的缺血刺激——可对后续的致损伤性缺血攻击产生短暂的保护作用。我们在C57Bl6/J小鼠中建立了双侧颈总动脉阻断（BCCAO）作为预处理刺激，以诱导对短暂性局灶性脑缺血（由大脑中动脉阻断，MCAO引起）的早期缺血耐受（IT）。...

双侧颈总动脉阻断作为诱导局灶性脑缺血早期缺血耐受的充分预处理刺激

来源：Zheng, Y., 等．研究酸性后处理对脑缺血神经保护作用的实验模型．J. Vis. Exp.

评估酸性后处理在脑缺血小鼠模型中的神经保护作用

来源：Brandli, A. 远隔肢体缺血预处理：一种在啮齿类动物中的神经保护技术。J. Vis. Exp.

大鼠模型中用于神经保护的非侵入性肢体缺血预处理

我们建立了一种脑切片模型，可用于研究兴奋性毒性介导的脑损伤所涉及的分子机制。 该技术可获得具有活性的成熟脑组织，在部分保留神经元回路、细胞间相互作用及突触后区室的同时，减少了实验所需的动物数量。...

脑微切片的兴奋性毒性刺激作为一种方法 体外 卒中模型

本方案描述了重复性缺氧预处理，即短暂暴露于全身性缺氧，可减少小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后脑梗死体积及血脑屏障的破坏。同时，本文还详细说明了脑卒中后脑梗死体积与血脑屏障破坏的双重定量方法，以评估神经血管保护作用的疗效。...

重复性缺氧预处理及小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后神经血管保护作用的量化

本文介绍了一种通过颈内动脉阻塞大脑中动脉以在大鼠中诱导卒中后抑郁的实验方案。我们采用Porsolt强迫游泳实验和蔗糖偏好实验来确认并评估所诱导的抑郁情绪状态。...

一种用于诱导大鼠卒中后抑郁的中动脉闭塞技术

该 本研究旨在通过检测大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）后1至90天的脑梗死及感觉运动功能，建立并验证一种用于脑缺血恢复期及后遗症期研究的动物模型。...

一种用于评估大鼠急性中风后脑功能恢复的临床前模型

本方案描述了采用改良的四血管阻塞法诱导脑缺血性昏迷模型的过程。...

改良四血管阻塞法诱导的脑缺血昏迷模型

学习酸性后处理技术用于脑缺血神经保护研究，通过体外皮质纹状体切片和体内大脑中动脉闭塞模型，探索酸中毒治疗对中风治疗的潜在应用价值。

研究酸性后处理对脑缺血神经保护作用的实验模型

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