提高高分子量生物素化葡聚糖胺在大鼠丘脑皮层投射示踪中的应用

本视频的总体目标是展示一种优化的高分子量BDA应用方案，用于研究中枢神经系统中的最佳神经标记。该方法有助于回答神经网络领域中的关键问题，通过神经回路可视化神经标记的框架结构。

该技术的主要优势在于能够启动局部神经环路并研究其化学特性。准备一支一微升微量注射器，配备玻璃微量移液管，通过吸取液体石蜡测试其性能。按照批准的实验方案麻醉大鼠后，通过夹尾无反应确认其处于深度麻醉状态。

然后使用电动剃刀剃除动物头部顶部的毛发，并用10%聚维酮碘擦洗手术区域，随后使用70%乙醇消毒。将动物固定于立体定位仪上，方法是将钝头耳杆插入耳道，并将大鼠的上门齿置于门齿固定器中。在眼睛表面涂抹眼用软膏。

使用无菌外科手套和手术巾以维持无菌环境。用70%乙醇再次清洁手术区域的头部皮肤。用手术刀沿矢状缝做矢状切口后，使用无菌棉签将肌肉和骨膜从颅骨上刮除。

根据图谱中的预定义坐标，确定颅骨开窗的位置。使用带有圆头钻头的骨钻进行颅骨开窗，钻至约一毫米深度，直至可见脑膜。使用显微镊子切除硬脑膜，暴露注射部位上方的脑皮层。

将液体石蜡从微量注射器中排出，然后吸入10% BDA溶液。将注射器安装到显微注射装置上，并连接微泵。在体视显微镜下操作显微注射装置。

将装有溶液的玻璃微电极通过脑皮层表面插入丘脑腹后内侧核（VPM），深度为 5.8 毫米。然后使用微泵在三分钟内向 VPM 内压力注射 100 纳升 10% BDA。五分钟后，缓慢撤出微电极。

用无菌缝线缝合伤口，然后将大鼠置于温暖的恢复区域，直至其恢复意识并完全苏醒。处死大鼠后，使用剪刀和镊子打开大鼠胸腔，暴露心脏。将静脉导管插入左心室，朝向主动脉方向，并剪开右心耳。

首先，用生理温度下的0.9%生理盐水灌注约一到两分钟，直至从心脏流出的液体变清。然后继续用250至300毫升的4%多聚甲醛（溶于0.1摩尔磷酸盐缓冲液中）进行灌注。将取出的脑组织在4%多聚甲醛中室温下后固定两小时。

然后将脑组织转移至含30%蔗糖的0.1 mol PBS中，于4°C条件下进行三天的冷冻保护。三天后，当脑组织沉入溶液底部时，借助脑切片模具，在冠状面上将脑组织分为三个部分。中央部分包含丘脑腹后内侧核及初级躯体感觉皮层。

将脑组织的中央部分固定于滑动切片机的冷冻台上，冷冻后在冠状面进行切片，厚度为 40 微米。将切片收集至含有 0.1 摩尔 PBS 的六孔板中。开始染色前，用 0.1 摩尔 PBS 在摇床上冲洗切片约 1 分钟。

然后将切片转移至含有0.3% Triton X-100的0.1摩尔PBS中，该溶液同时含有链霉亲和素-AF594和AF500/525绿色荧光尼氏染料，室温孵育两小时。染色后，在0.1摩尔PB中振荡洗涤切片三次。采用标准组织化学技术将切片封片于显微镜载玻片上。

将切片风干约一小时。在荧光切片上滴加50%甘油溶于蒸馏水的溶液，盖上盖玻片后进行切片成像。该代表性显微照片显示了在绿色尼氏染色背景下，生物素葡聚糖胺（BDA）注射至丘脑腹后内侧核的位点，呈红色。

此处展示的是荧光BDA标记，包括位于第四层的丘脑皮层轴突以及位于第五层和第六层的皮层丘脑神经元。作为对比，该显微照片表明，采用标准的亲和素-生物素过氧化物酶法的传统BDA标记显示出与荧光BDA标记相似的神经元标记模式。该荧光BDA标记切片的高倍放大图像详细显示了顺行标记的轴突分支，呈红色。

逆行标记的神经元胞体、树突及树突棘在此处得到详细展示。一旦熟练掌握，开颅手术和立体定位注射若操作得当，可在20至30分钟内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何应用高分子量BDA以示踪神经元连接，并清晰显示神经标记的精细结构。