高分子量生物素化葡聚糖胺在大鼠丘脑-皮质投影示踪中的应用

本视频的总体目标是展示高分子量 BDA 应用于研究中枢神经系统最佳神经标记的改进方案。这项措施可以帮助回答神经网络领域的关键问题。通过神经回路可视化神经标记的框架结构。

这种技术的主要优点是它提供了启动局部神经回路及其化学特性的机会。准备一个配备玻璃微量移液器的微升微量注射器，并通过吸取液体石蜡进行测试。使用批准的方案麻醉大鼠后，通过对尾巴捏没有反应来确认深度麻醉。

然后用电动剃须刀剃掉动物的头顶，用 10% 聚维酮碘擦洗手术部位，然后用 70% 乙醇擦洗。通过将钝耳杆插入耳朵并将大鼠的上门牙放入口托，将大鼠固定到立体定位装置中。在眼睛上涂抹眼药膏。

使用无菌手术手套和窗帘来保持无菌条件。使用 70% 乙醇再次清洁手术部位的头部皮肤。用手术刀在皮肤上做矢状切口后，沿着矢状缝合线，使用无菌棉签涂抹器将肌肉和骨膜从颅骨上刮走。

使用图谱中的预定义坐标，确定开颅手术的位置。使用带有圆头钻头的毛刺钻头进行开颅手术，钻孔至约 1 毫米深，直到可以看到脑膜。使用微镊子切除硬脑膜，以暴露注射部位上方的大脑皮层。

从微量注射器中排出液体石蜡，然后吸取 10% BDA 溶液。将注射器安装到显微注射装置中并连接微量泵。在立体显微镜下，纵显微注射装置。

将装满的玻璃微移液管通过大脑的皮质表面插入 VPM 中，深度为 5.8 毫米。然后，使用微泵在 3 分钟内将 100 纳升 10% BDA 压力注入 VPM 中。5 分钟后，慢慢抽出移液管。

用无菌线缝合伤口，然后将大鼠放在温暖的恢复区，直到它恢复意识并完全恢复。对大鼠实施安乐死后，用剪刀和镊子打开大鼠的胸腔并进入心脏。将静脉导管插入左心室，朝向主动脉，然后打开右耳廓。

首先，在生理温度下灌注 0.9% 生理盐水，持续约 1 至 2 分钟，直到从心脏流出的血液澄清。然后继续在 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液中加入 250 至 300 毫升 4% 多聚甲醛。将解剖的大脑在 4% 多聚甲醛中在室温下固定 2 小时。

然后将大脑转移到 0.1 摩尔 PBS 中的 30% 蔗糖中，并在 4 摄氏度下冷冻保存三天。三天后，当大脑沉入溶液中时，借助脑基质将大脑沿冠状方向分成三个块。中央阻滞包含初级体感皮层中丘脑的腹侧后内侧核。

将大脑的中央块安装在滑动切片机的冷冻台上，以便在冠状平面上切片，并在冷冻时以 40 微米进行切片。将切片收集在含有 0.1 摩尔 PBS 的六孔培养皿中。通过在 0.1 摩尔 PBS 中摇动冲洗切片约 1 分钟来开始染色。

然后将切片转移到链霉亲和素-AF594 在含有 0.3%Triton X-100 的 0.1 摩尔 PBS 中加入 AF500/525 绿色荧光尼氏染色剂的混合溶液中，并在室温下孵育 2 小时。染色后，在 0.1 摩尔 PB 中摇动洗涤切片 3 次。使用标准组织化学技术将切片安装在显微镜载玻片上。

风干切片约一个小时。将 50% 甘油的蒸馏水溶液涂在钍切片上，并在对载玻片进行成像之前盖上玻片。这张具有代表性的显微照片显示了在绿色 Nissl 染色背景下丘脑腹侧后内侧核的红色 BDA 注射部位。

此处显示了 thorescent BDA 标记，包括第 4 层的丘脑皮质醇轴突和第 5 层和第 6 层的皮质丘脑神经元。为了进行比较，该显微照片表明，使用标准亲和素-生物素过氧化物酶程序的常规 BDA 标记揭示了与钍 BDA 标记相似的神经标记模式。这种 thorescent BDA 标记切片的更高放大倍率视图以红色详细显示了顺行标记的轴突乔木。

此处详细显示了逆行标记的神经元细胞体、树突和树突棘。一旦掌握，如果作得当，开颅手术和立体定向注射可以在 20 到 30 分钟内完成。看完这个视频，你应该对如何应用高分子量 BDA 来恢复神经元连接和神经标记的详细结构有一个很好的了解。