高分子量生物素化葡聚糖胺在大鼠丘脑-皮质投影示踪中的应用
2018年4月12日
在这里, 我们提出了一个完善的协议, 以有效地揭示生物素化葡聚糖胺 (BDA) 标签的荧光染色方法通过一个相互的神经通路。它适用于分析 BDA 标签的精细结构, 并在共焦激光扫描显微镜下将其与其他神经元进行区分。
本视频的总体目标是展示高分子量 BDA 应用于研究中枢神经系统最佳神经标记的改进方案。这项措施可以帮助回答神经网络领域的关键问题。通过神经回路可视化神经标记的框架结构。
这种技术的主要优点是它提供了启动局部神经回路及其化学特性的机会。准备一个配备玻璃微量移液器的微升微量注射器，并通过吸取液体石蜡进行测试。使用批准的方案麻醉大鼠后，通过对尾巴捏没有反应来确认深度麻醉。
然后用电动剃须刀剃掉动物的头顶，用 10% 聚维酮碘擦洗手术部位，然后用 70% 乙醇擦洗。通过将钝耳杆插入耳朵并将大鼠的上门牙放入口托，将大鼠固定到立体定位装置中。在眼睛上涂抹眼药膏。
使用无菌手术手套和窗帘来保持无菌条件。使用 70% 乙醇再次清洁手术部位的头部皮肤。用手术刀在皮肤上做矢状切口后，沿着矢状缝合线，使用无菌棉签涂抹器将肌肉和骨膜从颅骨上刮走。
使用图谱中的预定义坐标，确定开颅手术的位置。使用带有圆头钻头的毛刺钻头进行开颅手术，钻孔至约 1 毫米深，直到可以看到脑膜。使用微镊子切除硬脑膜，以暴露注射部位上方的大脑皮层。
从微量注射器中排出液体石蜡，然后吸取 10% BDA 溶液。将注射器安装到显微注射装置中并连接微量泵。在立体显微镜下，纵显微注射装置。
将装满的玻璃微移液管通过大脑的皮质表面插入 VPM 中，深度为 5.8 毫米。然后，使用微泵在 3 分钟内将 100 纳升 10% BDA 压力注入 VPM 中。5 分钟后，慢慢抽出移液管。
用无菌线缝合伤口，然后将大鼠放在温暖的恢复区，直到它恢复意识并完全恢复。对大鼠实施安乐死后，用剪刀和镊子打开大鼠的胸腔并进入心脏。将静脉导管插入左心室，朝向主动脉，然后打开右耳廓。
首先，在生理温度下灌注 0.9% 生理盐水，持续约 1 至 2 分钟，直到从心脏流出的血液澄清。然后继续在 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液中加入 250 至 300 毫升 4% 多聚甲醛。将解剖的大脑在 4% 多聚甲醛中在室温下固定 2 小时。
然后将大脑转移到 0.1 摩尔 PBS 中的 30% 蔗糖中，并在 4 摄氏度下冷冻保存三天。三天后，当大脑沉入溶液中时，借助脑基质将大脑沿冠状方向分成三个块。中央阻滞包含初级体感皮层中丘脑的腹侧后内侧核。
将大脑的中央块安装在滑动切片机的冷冻台上，以便在冠状平面上切片，并在冷冻时以 40 微米进行切片。将切片收集在含有 0.1 摩尔 PBS 的六孔培养皿中。通过在 0.1 摩尔 PBS 中摇动冲洗切片约 1 分钟来开始染色。
然后将切片转移到链霉亲和素-AF594 在含有 0.3%Triton X-100 的 0.1 摩尔 PBS 中加入 AF500/525 绿色荧光尼氏染色剂的混合溶液中，并在室温下孵育 2 小时。染色后，在 0.1 摩尔 PB 中摇动洗涤切片 3 次。使用标准组织化学技术将切片安装在显微镜载玻片上。
风干切片约一个小时。将 50% 甘油的蒸馏水溶液涂在钍切片上，并在对载玻片进行成像之前盖上玻片。这张具有代表性的显微照片显示了在绿色 Nissl 染色背景下丘脑腹侧后内侧核的红色 BDA 注射部位。
此处显示了 thorescent BDA 标记，包括第 4 层的丘脑皮质醇轴突和第 5 层和第 6 层的皮质丘脑神经元。为了进行比较，该显微照片表明，使用标准亲和素-生物素过氧化物酶程序的常规 BDA 标记揭示了与钍 BDA 标记相似的神经标记模式。这种 thorescent BDA 标记切片的更高放大倍率视图以红色详细显示了顺行标记的轴突乔木。
此处详细显示了逆行标记的神经元细胞体、树突和树突棘。一旦掌握，如果作得当，开颅手术和立体定向注射可以在 20 到 30 分钟内完成。看完这个视频，你应该对如何应用高分子量 BDA 来恢复神经元连接和神经标记的详细结构有一个很好的了解。
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概览
该视频演示了一种用于应用高分子量生物素化葡聚糖胺（BDA）以研究中枢神经系统中神经标记的精细协议。该方法允许详细可视化神经回路及其化学特性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经回路
- 荧光成像
背景
- 了解神经网络对于神经科学研究至关重要。
- 生物素化葡聚糖胺（BDA）是追踪神经通路的有价值工具。
- 荧光染色增强了神经元素的可视化。
- 共聚焦激光扫描显微镜提供高分辨率成像。
研究目的
- 完善神经研究中BDA标记的协议。
- 改进神经回路中细微结构的分析。
- 区分BDA标记和其他神经元素。
使用的方法
- 用玻璃微管配制微注射器。
- 对大鼠模型施行麻醉。
- 应用高分子量BDA。
- 使用共聚焦激光扫描显微镜进行可视化。
主要结果
- 成功可视化了神经回路中BDA标记。
- BDA与其他神经元素之间的清晰区分。
- 增强了对局部神经回路特征的理解。
- 协议的完善提高了可重复性和清晰度。
结论
- 完善的BDA协议对神经回路研究有效。
- 荧光染色显著有助于神经分析。
- 这种方法可以帮助回答神经科学中的关键问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) tracing enables precise mapping of thalamocortical projections, supporting mechanistic de-risking in neurocircuitry research. Enhanced visualization of neuronal pathways and local circuit markers increases predictive confidence for target validation in CNS drug discovery. This refined protocol strengthens translational continuity from early discovery through preclinical neuroanatomical studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed interrogation of thalamocortical connectivity for pathway clarification.
- Supports functional target validation by visualizing reciprocal neural projections.
- Facilitates mechanistic de-risking through high-resolution mapping of neuronal circuits.
- Improves predictive confidence for CNS target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated neural tissue systems for downstream phenotypic screening.
- Standardizes fluorescent labeling for reproducible and quantitative neural tracing outputs.
- Enables reliable assessment of compound effects on defined neural pathways.
- Supports platform reuse for multiplexed marker analysis in neural tissues.
Translational & Preclinical Research
- Aligns neural circuit mapping with disease-relevant systems for translational biomarker studies.
- Provides continuity from discovery-stage tracing to preclinical validation of neural targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust anatomical evidence.
- Supports integration of chemical marker co-localization for mechanistic insights.
Pipeline & Workflow Integration
This refined BDA tracing protocol fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling robust neural pathway mapping and marker co-localization for CNS research portfolios.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in thalamocortical circuits.
- Screening: Delivers standardized, reproducible fluorescent outputs for neural tissue assays.
- Analytics: Provides quantitative and qualitative readouts for comparing neural labeling conditions.
- Translational Research: Bridges anatomical mapping with biomarker alignment in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for multiplexed neural circuit analysis across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of neural tracing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust anatomical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and neuroanatomical tracing.
- Needs access to fluorescence microscopy and histochemical staining infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible tissue processing and imaging.
- Adaptation may be needed for different brain regions or animal models.
- Dependent on precise injection and staining techniques for optimal results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Stereotaxic Injection of Tracer
2:54
Perfusion and Sectioning
4:15
Double Fluorescent Staining for BDA and Basic Neural Elements in Cerebral Cortex
5:07
Results: Injection Site and Typical Neural Labeling with High Molecular Weight BDA in the Somatosensory Cortex
6:04
Conclusion
