有针对性的特定功能的微域的新皮质相结合的内源信号和双光子成像标记的神经元

该程序的总体目标是精确定位功能图中的微结构域，以高分辨率研究神经元的结构和功能。这是通过首先对大面积皮层进行内禀信号成像以获得感兴趣的刺激特征图来实现的。第二步是确定地图中要针对高分辨率光子成像的精确位置。

接下来，在仔细定位装有荧光染料的移液器后，用荧光标记标记神经元。最后，收集神经元反应或结构的高分辨率光子图像。最终，可以使用内禀信号特征图来查找感兴趣的区域，例如方向风车奇点，然后可以以单个神经元分辨率进行研究。

该协议的主要优点是，只需对系统进行一些快速调整，就可以使用相同的显微镜设置在不同空间尺度上对皮层进行成像。这允许人们结合这些技术，使用课程分辨率内在信号图作为选择神经元区域的指南，以使用荧光探针进行标记以进行高分辨率成像。该动物已根据机构动物护理诱导委员会批准的方案进行了麻醉，头骨已被暴露和清洁。

牙科水泥混合物用于将中心带有矩形开口的不锈钢头板连接到颅骨上。头板顶部的金属腔室用作水浸物镜成像的储液器。头板已使用金属柱固定在 XY 载物台上。

使用牙钻在头板的矩形开口内减薄大面积的骨头。涂抹骨蜡以停止偶尔的出血。薄区域必须延伸到计划的开颅手术的边界之外。

然后在骨头上钻一个 2 x 2 毫米的方形轮廓，用于开颅手术。定期用新鲜的人工脑脊髓液冲洗腔室，以去除骨碎片并尽量减少对底层皮层的散热。现在，用三号镊子提起骨头。

使用五号镊子和 Vana 弹簧剪刀去除硬脑膜的上层，保持底层完好无损。硬脑膜的最后一层是透明的，通过它应该可以清楚地看到果皮容器。滴一滴溶于 A CSF 的温热 2%aeros，并立即将盖玻片放在开颅手术机上。

首先，在盖玻片外部周围浸泡有 A CSF 的凝胶泡沫，以防止 agros 在内禀信号成像过程中干燥。然后将本征信号成像 CCG 相机连接到两个照相显微镜顶部的标准 C 安装端口，并将照明光源放在 XY 载物台位置附近的空气台上，并将光导固定在开颅手术机上。缩回海山端口下方的初级二向色镜和镜子，以便本征信号所需的反射红光直接从开颅手术传递到 CCD 相机。

将红外滤光片插入光路中，以防止皮层发热。然后放置一个通过绿光的过滤器，并记录皮质表面血管的数字参考图像。接下来，将 Z 焦点移动到皮质表面以下 500 微米处。

用红色滤光片替换绿色滤光片，以照亮皮层以测量内在信号。确保皮层被均匀照亮。屏蔽开颅手术免受视觉刺激显示产生的光线的影响，并呈现一系列视觉刺激并记录反射数据图像以生成方向图 在 10 分钟内，收集对应于八个刺激序列的四次重复的数据，每个方向有四个方向和两个方向。

现在分析本征信号数据以生成伪方向彩图，如下所示。然后为神经元的两个光子标记选择潜在的目标区域。例如，方向风车奇点在地图中所有首选方向都汇聚的地方。

接下来，叠加方向图和皮质表面脉管系统的图像，并使用功能域的布局和大表面血管的位置来选择目标，避开具有大血管和动脉的位置。准备荧光 D 溶液，并根据书面方案中的说明拉动长锥形移液器。将 5 微升染料混合物装入移液器中。

然后去除最后一层硬脑膜以促进移液器插入并获得最高质量的双光子图像，如下图所示。移液器必须以 30 度角驶入皮层，才能在腔室和物镜之间通过。因此，移液器入口位置的皮质表面位置不会直接位于目标感兴趣区域上方。

例如，要标记皮质表面以下 200 微米的目标区域，皮质表面的移液器入口位置将在目标位置的外侧约为 350 微米。移动 XY 载物台，使皮质表面入口位置在 20 x 或 40 x 物镜下居中。一旦入口位置位于物镜下方的中心，将物镜的 Z 位置升高 2 毫米。

然后打开绿色落射荧光灯，在移液器中观察红色 Alexa 染料并移动移液器，直到吸头高于皮质表面入口位置。在通过明场照明显微镜的目镜观察移液器吸头时，降低移液器，直到吸头到达皮质表面所需的入口位置。接下来，取下物镜并使用无绒吸收矛从开颅手术中吸走多余的脑脊髓液并干燥相邻的骨头。

然后滴一滴温热的 3%玫瑰，溶于 A CSF 以稳定皮层。一旦 aros 凝固，插入一个 40 倍物镜并用 CSF 重新填充腔室。接下来，使用微型纵器的对角线轴移动移液器，直到吸头在皮层中达到所需的深度。

当移液器到达第二层时，偶尔的压力喷射 DI 混合物将降低移液器吸头堵塞的可能性，三小口 DI 混合物将照亮额外的细胞空间，并露出圆形细胞体的密集组装作为黑影，用于将神经元体加载到直径为 300 至 600 微米的皮层球体中。使用 30 到 90 次脉冲将 Dix 混合物注射到细胞外间隙。每个脉冲 1 秒，2 至 10 PSI。

注射完成后，等待几分钟，然后取出移液管和物镜。荧光钙指示剂将在一小时内被神经元完全吸收。最后，取下用于下载的 aros 并冲洗录音室。

在表面滴一小滴 2% 至 3% 的 rose，然后迅速将盖玻片放在开颅手术上。将高 NA 20 x 物镜插入物镜支架，并将标记的皮质区域重新居中在物镜下方。使用 XY 载物台保护开颅手术免受外来光源的影响，并在体内收集标记神经元的高分辨率图像。

或者，单细胞电穿孔可用于研究树突形态或树突的功能成像。在这种方法中，DI 是根据书面协议准备的。然后在程序的适当位置，将移液器吸头放置在神经元细胞体膜附近，并使用轴施加一到三个脉冲。

用染料立即填充神经元的过程很容易用双光子显微镜观察。该图像显示了一个双光子成像区域，显示了用荧光钙指示剂 OGB 标记的细胞体，在视觉皮层第 2 层 2 到 3，比例尺代表 100 微米。该图显示了来自上图所示相同位置的单个神经元细胞体的方向偏好。

在以成像区域为中心的风车奇点周围可以看到首选刺激方向的有组织图。在这里，我们看到了通过本征信号成像获得的方向图。黑色方块对应于前两个光子图像中显示的区域。

该图像显示了与方向图重叠的单个神经元的树突和细胞体。在两个光子引导下用 Alexa floor 5 94 对神经元进行电穿孔。当 Z 堆栈在体内收集时，使用 neuro lucid 作为软件离线追踪树突状过程。

单细胞电穿孔之前使用本征信号成像获得取向图。比例尺代表 100 微米。皮质第一层的 10 微米 Z 投影显示了顶端树突。

红色箭头显示沿树突的棘，而皮质第 2 层、第 3 层的这些 10 微米 Z 突起显示基部树突，棘用红色箭头表示，轴突用白色箭头表示。该方法可用于研究不同空间尺度上皮层中的功能图谱，以及精确靶向特定感兴趣域中的神经元。在地图中，我们已经展示了该方法在检查方向选择地图中的应用，但它可以扩展到其他视觉特征图，例如视网膜、toppy、眼优势和方向，或具有功能组织地图的其他感觉模式，例如编码 somato 感觉或听觉的那些。