Juxtasomal生物胞素标记来研究单个皮层神经元的结构与功能的关系

该程序的总体目标是将信息处理过程中感觉皮层中的细胞类型特异性动作电位尖峰与记录的神经元的形态特性联系起来。这是通过首先通过手术准备大鼠进行并列体记录来实现的。准备好后，电极记录自发和感觉诱发的尖峰活动，记录的神经元是使用电流和注射负载的杀菌素。

之后，大脑被处理以进行生物素染色。最后，从后续切片中以数字方式重建充满生物素的神经元，以进行细胞类型分类。最终，单个神经元的并列体记录允许研究皮层网络内的感觉处理和结构信息。

这种方法可以帮助回答神经科学中的关键问题，例如单个细胞类型和层在感觉处理过程中的作用是什么？一般来说，需要这种方法的人会很挣扎，因为在填充过程中很容易杀死神经元。通过制备最佳质量的移液器，可以增加成功填充杀菌素的机会，此外，需要训练有素的眼睛来控制窄带电流注射。

因此，需要经验来提高恢复充盈神经元的成功率。首先，将麻醉的 wistar 大鼠放在配备有加热垫的立体定位框架上。通过测试脚趾捏反射来确认镇静深度。

然后插入直肠探头以保持正确的体温。固定动物的头部并去除手术部位的毛发。在眼睛上涂抹软膏以防止干燥。

在手术部位注射利多卡因后等待 3 到 5 分钟，然后去除覆盖颅骨表面的皮肤。接下来，清除所有残留的组织，并用 0.9% 氯化钠骑行广泛清洁颅骨。确定左半球初级体感皮层的坐标，并用手术皮肤记号笔在颅骨上标记位置。

使用牙钻从感兴趣区域刮下骨头。继续刮擦骨头，直到它变得透明并且血管清晰可见。接下来，用手术刀在薄头骨上切一个小窗口。

注意不要损伤硬脑膜和血管。使用外科皮肤记号笔标记开颅手术的边缘。为了提高能见度，在干燥的头骨上涂上一层薄薄的强力胶，然后涂上牙科水泥来建造一个浴缸。

在闭合开颅手术时，将对侧的胡须修剪到正好 5 毫米，以帮助它们可见。在开始录制之前，用黑色睫毛膏突出修剪过的胡须，用 Boro Silicic 玻璃制作贴片移液器。理想的移液器形态是逐渐细长的锥度、低锥角和大约 1 微米的内吸头直径。

用补充有 2% 生物素的普通 rad ringer 加载膜片移液管，然后将膜片移液管安装到移液器支架上，固定在头部载物台上，并连接到微米纵器。要专门针对大鼠 S one 的 D 两列，请将电极支架的角度设置为相对于矢状面的 34 度。接下来，将贴片移液管放置在开颅手术附近。

用 0.9% 氯化钠填充浴液。当放大器处于桥式模式时，施加带有正电流注入的方波脉冲以确定电极电阻。最佳电极电阻在 3 到 5 兆之间。

建立 100 至 150 毫巴的过压，并以 1 微米的步长推进膜片移液管，同时以方脉冲的形式施加正电流。在与硬脑膜接触时监测稳健的电阻变化。此时，将微型机械手的坐标设置为零，以允许精确的深度测量。

以 1 微米步长模式前进，直到贴剂移液穿透硬脑膜，电极电阻突然下降。移除移液器的保持压力。接下来，搜索单个单位，同时以 1 微米的步长前进。

通过施加 200 毫秒的开关脉冲来连续监测电极电阻，电极电阻的增加通常表明单个神经元的接近会使电极前进，直到正动作。记录大约 2 毫伏的电位波形。可选择记录自发的尖峰活动，并通过使用压电装置巧妙地偏转单个晶须来确定晶须撤销的尖峰活动，以获得并列体填充的最佳条件。

推进电极，直到电阻为 25 至 35。兆欧姆和尖峰的振幅为 3 到 8 毫伏，以启动并列体填充。从 1 纳安开始施加正方流脉冲。

以 0.1 纳安的步长缓慢逐渐增加电流，同时监测 AP 波形和频率。监测膜张开，因为在阻滞脉冲的导通期 AP 频率明显增加 填充过程中的尖峰波形式显示超极化后宽度增加和减少 填充时增加或减少电流以保持稳定的生物素输注，在 AP 频率突然增加时减少或停止电流脉冲。避免过量流入细胞外离子（如钠离子）引起的毒性。

重要的是要注意，每个神经元对充盈过程的反应都不同。因此，必须根据记录条件调整并列体标记参数。停止电流注入后密切监测信号。

填充会话后的尖峰波形式通常会变宽，并在超极化后显示强烈减少，等待神经元恢复，当尖峰波形恢复到其原始特性以减少对细胞的任何机械应力时，这一点很明显。以 1 微米的步长缩回贴片移液管，直到尖峰振幅减小，等待至少一小时让生物素在细胞内扩散，同时密切监测动物的体温和呼吸。最后，获得并处理脑样本以揭示并列体标记的质量。

这些图像显示了初级体感皮层中并置充满神经元的图像。这种系金属神经元的切向视图证明了树突和轴突之间的大小差异。在这种并列索马里标记神经元的数字重建中，神经元投影图像以高分辨率但低放大倍率显示，并且自动数字重建分别以蓝色覆盖轴突，以红色覆盖树突。

在这里，箱区扩展为在整个轴突长度上显示轴突布氏。在最后的动画中，我们举例说明了来自大鼠初级体感皮层的一层 5 厚簇状寄生金属神经元的重建管道。该管道需要以 100 倍放大倍率重建树突和轴突形态，以 4 倍放大倍率重建桶形轮廓。

结果是完整的 3D 重建，随后将其配准到标准化参考框架中，以执行形态特征的定量分析。因此，体内并列体标记可实现卓越的标记质量，从而可靠地重建完整的 3D 形态。在这里，我们在氨基甲酸乙酯麻醉动物中展示了该方法。

然而，Jux Somal 记录也可用于清醒的头部束缚动物，以研究单个细胞类型和层在积极探索环境过程中的作用。观看此视频后，您应该更好地了解如何对单个神经元进行杀菌素标记以进行战后鉴定和形态重建。