鼠脑组织疏水组织清除方法
December 23rd, 2020
在这里，我们提出了一个疏水组织清除方法，允许查看目标分子作为完整的大脑结构的一部分。这项技术现已得到F344/N控制和艾滋病毒-1转基因两性大鼠的验证。
这种透明化技术的总体目标是为大鼠大脑建立一种组织透明化方法。该方案也可用于 HIV-1 转基因大鼠。该技术的主要优点是大鼠脑组织可以保持完整以进行透明化，从而允许进行完整的电路级分析。
演示该程序的是我实验室的博士生 Kristin Kirchner 和我实验室的助理研究员 Hailong Li。对 3 至 6 周龄大鼠进行经心脏灌注后，使用镊子从颅骨中取出大脑。然后将其置于矢状位置，并使用剃须刀片和大鼠脑基质将其切成四个相等的 3 毫米宽的切片。
将每个切片用 4% PFA 固定在密封的 5 毫升塑料管中，在 4 摄氏度的摇床上过夜。第二天，在室温下继续固定 1 小时。用 PBS 洗涤每个切片 3 次，每次洗涤约 30 分钟。
将洗涤后的切片在 20、40、60、80 和 100% 甲醇溶液中连续孵育 1 小时。用 100% 甲醇重复脱水。然后将样品在 4 摄氏度的 100% 甲醇中冷却 10 分钟。
制备含有 66% DCM 和 33% 甲醇的溶液，并在室温下振荡将冷却切片在该溶液中孵育过夜。第二天，用甲醇洗涤样品两次，每次 30 分钟，然后在 4 摄氏度的 100% 甲醇中冷却 10 分钟。漂白时，将样品置于新鲜的 5% 过氧化氢甲醇溶液中，并在 4 摄氏度下孵育过夜。
过夜孵育后，将样品在 80%、60%、40% 和 20% 甲醇溶液中，在室温下连续孵育 1 小时。然后将样品在 PBS 中孵育 1 小时，并在溶液中洗涤 2 次，每次 1 小时。用 2.5 微升 1% 生物素-CTB 填充 1 毫升注射器，并在 20 秒内缓慢注射到伏隔核部位。
将针尖留在原位 1 分钟，然后在 10 秒内缓慢取出，以防止泄漏。将样品在溶液 3 中孵育，然后在溶液 4 中分别在 37 摄氏度的水浴中孵育两天。然后添加一抗并继续孵育 7 天。
在溶液 2 中洗涤样品 5 次，每次洗涤 1 小时，并在室温下在溶液 2 中储存过夜。将样品与二抗在 37 °C 水浴中孵育 7 天。最后，在溶液 2 中洗涤 5 次，每次洗涤 1 小时，并在溶液 2 中室温下在弱光下存放过夜。
在室温下，将样品在 20%、40%、60%、80% 和 100% 甲醇中连续孵育 1 小时。然后将其在新鲜的 100% 甲醇中孵育过夜。第二天，将样品在新鲜制备的 66% DCM 和 33% 甲醇中，在室温下振荡孵育 3 小时。
三小时后，将样品在二苄醚中孵育，不要摇晃，直到澄清为止。然后将其储存在二苄醚中直至成像。获得 3D 打印室并使用环氧树脂将其固定在显微镜载玻片上。
将样品放在腔室中间的方形空间中，并用二苄醚完全填充腔室。将 0.17 毫米厚的盖玻片放在腔室上并施加压力以确保其与腔室壁完全接触。然后使用环氧树脂密封边缘。
确保旋转腔室，让气泡从进样口逸出。用额外的二苄醚填充腔室。然后用环氧树脂密封填充入口并使其固化。
使用共聚焦显微镜系统观察标本，以四倍放大倍率进行 z 扫描。在四倍放大倍率下，疏水透明化组织样品的共聚焦图像显示黑质区域有密集的 TH 染色，与黑质相邻的 TH 神经元稀疏，组织呈深黑色区域，缺乏 TH 神经元。在 20 倍放大倍率下，TH 阳性神经元的典型形态具有一个大的胞体和几个分支突起。
而 IBA1 染色的小胶质细胞具有较小的细胞体和较短的延伸过程。理想的共聚焦图像显示黑质区域的阳性和致密 TH 染色，具有适当的荧光增益。较差的共聚焦图像的示例包括：荧光增益过多、聚焦不当的图像、亮点未与组织其余部分聚焦的假阳性染色，以及由于使用与二抗不匹配的封闭血清而导致的高背景染色。
此处显示了大鼠大脑中的 CTB 阳性染色。细长纤维是沿多巴胺能通路的传入投影。TH 和 CTB 的共定位使得在伏隔核区域可视化注射部位成为可能，该注射部位显示为一个密集的荧光绿色圆圈。
TH 和 CTB 在黑质中的共定位如图所示。在尝试此程序时要记住的最重要的一点是，要给样品足够的时间在所有抗体溶液中孵育，并在成像前留出足够的时间完全清除。样品应限制暴露在空气中，因为这会损坏样品。
这项技术用途广泛，可用于研究大脑不同区域的许多不同感兴趣蛋白质。目前的技术有助于为神经科学家在电路水平上研究大鼠大脑铺平道路，这对于研究大脑作为一个整体系统至关重要。
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概述
本研究介绍了一种新的疏水性组织透明化方法，用于可视化完整大脑结构中的目标分子，特别关注大鼠大脑，包括F344/N对照和HIV-1转基因模型。该技术通过保持大脑组织的完整性，允许进行完整电路水平的分析。
研究的主要组成部分
科学领域
- 组织透明化方法
- 神经科学
- 脑成像技术
背景
- 透明化技术增强了分子结构的可视化。
- 现有方法通常会损害组织完整性。
- 研究完整的大脑结构对电路水平的分析至关重要。
- 该方法适用于不同的大鼠模型，包括与HIV研究相关的模型。
研究目的
- 验证大鼠大脑的疏水性透明化协议。
- 实现神经元电路的高分辨率成像。
- 促进大脑结构的分子表征。
使用的方法
- 该研究采用了针对大鼠大脑组织优化的疏水性透明化方法。
- 生物模型为F344/N对照和HIV-1转基因大鼠。
- 协议包括心脏灌注、切片、脱水和抗体标记。
- 关键步骤包括多次孵育和小心的样品处理以避免损坏。
- 使用共聚焦显微镜进行成像以分析染色的神经元结构。
主要结果
- 该技术成功地透明化了大脑组织，同时保持了分子完整性。
- 实现了酪氨酸羟化酶（TH）染色和其他神经元标记物的清晰可视化。
- CTB和TH的共定位提供了对多巴胺能通路的洞察。
- 方法的验证显示其对研究各种大脑蛋白质的多功能性。
结论
- 本研究展示了一种分析大脑电路的强大技术，同时保持组织完整性。
- 该方法使神经科学家能够探索大鼠大脑的复杂结构和分子相互作用。
- 研究结果可能对理解疾病模型和神经生物学有影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
This hydrophobic tissue clearing method enables intact rat brain analysis for circuit-level studies, supporting target validation in neurodegenerative and infectious disease models. By preserving tissue integrity while allowing high-resolution imaging of molecular markers, it reduces the need for sectioning and associated artifacts. The approach provides predictive value in preclinical target de-risking by enabling whole-brain phenotyping and pathway mapping.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through intact tissue visualization of protein targets like TH and Iba-1.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining structural context of neuronal circuits and microglial activation.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by allowing comparative analysis of control and transgenic disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antibody screening and colocalization studies.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through consistent clearing and imaging workflows.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple brain regions and protein targets without re-sectioning.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant system analysis in HIV-1 transgenic rats for mechanistic de-risking.
- Preclinical Alignment: Connects discovery-phase target validation to preclinical continuity via whole-brain phenotyping.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables biomarker-aligned advancement by visualizing pathological changes in intact circuitry.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing and pathway clarification in intact brain tissue, supporting lead identification through circuit-level phenotyping.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by preserving structural integrity during target visualization.
- Screening: Enables assay readiness through standardized clearing and quantitative fluorescence readouts.
- Analytics: Provides measurable outputs such as staining density and colocalization for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by maintaining tissue integrity for longitudinal biomarker tracking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform for multiple targets across disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through intact tissue analysis.
- Operational Value: Improves standardization and scalability of clearing procedures across laboratories.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by enabling comprehensive target engagement assessment.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization through whole-brain phenotypic screening capabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, antibody validation, and confocal imaging.
- Depends on standard laboratory equipment including shakers, incubators, and confocal microscopes.
- Necessitates cross-team standardization of clearing times, antibody concentrations, and washing protocols.
- Involves adaptation considerations for different rat strains, antibody pairs, and brain regions.
- Includes practical limitations such as sensitivity to air exposure and requirement for optimized blocking sera to minimize background.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
3:04
CTB-Cholera Toxin Subunit B Labeling and Antibody Application
5:02
Mounting the Sample for Imaging
7:39
Conclusion
0:46
Sample Preparation
1:36
Dehydration and Depigmentation
4:17
Tissue Clearing
5:59
Results: Confocal Images of the Hydrophobically Cleared Tissue Samples with Fluorescent Labelled TH Neurons and CTB Markers
