一种用于大鼠脑组织的疏水性组织透明化方法

该透明化技术的总体目标是建立一种适用于大鼠脑组织的透明化方法。此方案也可用于HIV-1转基因大鼠。该技术的主要优势在于，大鼠脑组织可在保持完整的情况下进行透明化处理，从而实现全脑神经环路水平的分析。

进行该操作演示的将是来自我实验室的博士生Kristin Kirchner，以及我实验室的研究助理Hailong Li。在对一只三至六周龄的大鼠进行经心灌注后，使用镊子将大脑从颅骨中取出。然后将其置于矢状位，利用剃刀刀片和大鼠脑切片模具将其切成四个相等的、每片宽三毫米的切片。

将每个切片置于含有4%多聚甲醛的5毫升密封塑料管中，在4°C下摇床上过夜固定。次日，在室温下继续固定1小时。用PBS洗涤每个切片3次，每次约30分钟。

将洗涤后的切片依次在20%、40%、60%、80%和100%甲醇溶液中孵育，每种浓度各孵育1小时。再用100%甲醇重复脱水一次。然后将样品置于100%甲醇中，在4°C下冷却10分钟。

配制含有66%二氯甲烷（DCM）和33%甲醇的溶液，将冷藏的切片在该溶液中于室温下振荡孵育过夜。次日，用甲醇洗涤样本两次，每次30分钟，并在4°C下用100%甲醇冷藏10分钟。进行漂白时，将样本置于新鲜的5%甲醇-过氧化氢溶液中，在4°C下孵育过夜。

经过过夜孵育后，将样品依次在80%、60%、40%和20%的甲醇溶液中孵育，每种浓度均在室温下孵育1小时。随后将样品在PBS中孵育1小时，并用溶液一洗涤两次，每次洗涤1小时。用1毫升注射器吸取2.5 µL的1%生物素-CTB，缓慢注入伏隔核位点，持续20秒。

将针尖留在原位一分钟，并在10秒内缓慢拔出，以防止泄漏。将样品在37摄氏度的水浴中依次于溶液三和溶液四中孵育，每种溶液各孵育两天。然后加入一抗，并继续孵育七天。

用溶液二清洗样品，每次清洗一小时，共清洗五次，然后将样品置于溶液二中，于室温下避光过夜保存。将样品在37摄氏度水浴中与二抗孵育七天。最后，用溶液二再次清洗样品五次，每次一小时，清洗后将样品置于溶液二中，于室温下避光过夜保存。

将样品依次在20%、40%、60%、80%和100%甲醇中孵育，每种浓度均在室温下孵育1小时。随后在新鲜的100%甲醇中过夜孵育。次日，在室温下以振荡方式将样品在新配制的66%二氯甲烷（DCM）和33%甲醇混合液中孵育3小时。

孵育三小时后，将样品置于二苄基醚中，不振荡，直至样品变澄清。然后将样品保存在二苄基醚中，直至成像。取一个3D打印腔室，使用环氧树脂将其固定在显微镜载玻片上。

将样品置于腔室中央的方形区域，并用二苄基醚完全填充腔室。在腔室上方覆盖一片厚度为0.17毫米的盖玻片，施加压力以确保其与腔室壁完全接触。随后用环氧树脂密封边缘。

务必旋转腔室，使气泡从填充入口逸出。用额外的二苄基醚填充腔室，然后用环氧树脂密封填充入口，并使其固化。

使用共聚焦显微镜系统以4倍放大倍数对样本进行z轴扫描观察。4倍放大下疏水性透明化组织样本的共聚焦图像显示，在黑质区域有密集的酪氨酸羟化酶（TH）染色，黑质邻近区域TH阳性神经元稀疏，以及一个缺乏TH阳性神经元的深黑色组织区域。20倍放大下典型的TH阳性神经元具有较大的胞体和多个分支状突起。

而IBA1染色的小胶质细胞具有较小的细胞体和较短的突起。理想的共聚焦图像应显示黑质区域中TH染色呈阳性且密集，荧光增益适中。质量较差的共聚焦图像示例包括：对焦不当且荧光增益过高、出现不在组织焦平面内的明亮斑点导致的假阳性染色，以及由于使用的封闭血清与二抗不匹配而产生的高背景染色。

此处显示的是大鼠脑内CTB染色阳性结果。细长的纤维为沿多巴胺能通路的传入投射。TH与CTB的共定位使得伏隔核区域的注射位点得以可视化，表现为一个密集的荧光绿色圆形区域。

此处展示了黑质中TH与CTB的共定位。进行该实验时需牢记的最重要事项是：确保样品在所有抗体溶液中有充足的孵育时间，并在成像前给予足够时间彻底清除。样品应尽量减少暴露于空气，以免造成损伤。

该技术具有高度的通用性，可用于研究大脑不同区域中多种感兴趣的蛋白质。本技术有助于神经科学家在环路水平上探究大鼠大脑，这对于将大脑作为一个完整系统进行研究至关重要。