使用生物素化测定原代星形细胞培养物中蛋白质的细胞表面表达和吞噬率

在本视频中，将介绍两种方法，细胞表面生物素化和脉冲追踪生物素化。在下面的演示中，我们将使用星形胶质细胞。这些是大脑中最丰富的神经胶质细胞类型，它们恰好表达我们感兴趣的蛋白质，即水通道蛋白-4。

我们在本文中使用的方法可以应用于许多不同的细胞类型，这些细胞类型可能包括悬浮细胞或贴壁细胞。这些技术可用于研究几乎任何跨膜蛋白的细胞表面表达和内化，只要它具有生物素可接近的细胞外结构域。这种细胞表面生物素化测定的总体目标是确定层粘连蛋白对星形胶质细胞质膜上透水通道水通道蛋白-4 表达的影响。

要开始此过程，请从培养箱中取出星形胶质细胞培养物，并通过抽吸丢弃培养基。用 4 毫升冷冻的 CM-PBS 洗涤细胞 3 次，然后将培养皿放在碎冰上。通过抽吸去除 CM-PBS，然后将两毫升生物素缓冲液移液到每个孔中。

轻轻地将培养皿来回倾斜几次以确保完全覆盖，然后将培养物放在冰上 30 分钟。然后去除生物素缓冲液，用 4 毫升淬灭缓冲液替换，并将培养物在冰上放置 10 分钟。接下来，吸出并更换为等量的淬灭缓冲液，然后将培养物置于冰上 10 分钟。

然后，丢弃淬灭缓冲液，用 4 毫升冷冻的 CM-PBS 洗涤细胞三次。然后，将细胞刮入 1 毫升冷冻的 CM-PBS 中，并将悬浮液转移到微量离心管中。接下来，在设置为 4 摄氏度的冷冻微量离心机中以 100 g 离心 3 分钟，使细胞沉淀。

之后，弃去上清液，将细胞重悬于 500 μL 裂解缓冲液中。然后，将样品放在冰上 30 分钟，每 5 分钟涡旋一次。然后，将裂解物在 4 摄氏度下以 14， 000 g 离心 10 分钟，以沉淀任何去污剂和可溶性材料。

然后，将上清液转移到新的微量离心管中。保存 50 μL 裂解物，并向其中添加 25 μL 的 3 X 上样缓冲液。随后，通过在干浴中以 95 摄氏度加热使其变性。

这是输入组分，包含生物素化的细胞表面蛋白和非生物素化的胞质蛋白。使用切割的移液器吸头，将 75 μL 链霉亲和素琼脂糖珠转移到裂解物中，并在 4 摄氏度下在摇床上孵育 3 小时。之后，在 4 摄氏度下以 1， 500 g 离心 30 秒，使链霉亲和素琼脂糖珠沉淀。

保存 50 μL 上清液，并添加 25 μL 的 3 X 上样缓冲液。然后，在 95 摄氏度的水中将其在水浴或加热块中变性。这代表细胞内组分，主要由非生物素化的胞质蛋白组成。

然后，将沉淀的珠子重悬于 1 毫升洗涤缓冲液中，并在 4 摄氏度下摇动 3 分钟。沉淀珠子并弃去上清液。再重复此过程四次，以尽量减少非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。

加入 50 μL 上样缓冲液，使用裂解缓冲液稀释至 1 X。通过在 95 摄氏度下使微珠变性，从微珠中释放生物素和链霉亲和素。该级分应仅包含生物素化的细胞表面蛋白。

随后，通过 SDS-PAGE 分离输入、细胞表面和细胞内组分，并通过 western blotting 进行分析。脉冲追踪生物素化实验的总体目标是确定水通道蛋白-4 在星形胶质细胞中的近似内化速率。首先，从培养箱中取出星形胶质细胞培养物并吸出培养基。

然后，用 4 毫升冷冻的 CM-PBS 洗涤细胞 3 次，并将培养皿放在碎冰上。吸出 CM-PBS，然后将 3 毫升生物素缓冲液移液到每个培养皿中。将培养皿来回倾斜几次，以确保缓冲液分布均匀，然后将它们放在冰上 30 分钟。

然后，吸出生物素缓冲液，并用 5 毫升温热的培养基替换。将一个培养皿在 37 摄氏度下孵育 15 分钟，然后将第二个培养皿在相同温度下孵育 30 分钟。将另一个盘子留在 4 摄氏度作为零分钟样品。

在孵育期结束时，丢弃培养基并用 4 毫升冷冻的 CM-PBS 洗涤细胞 3 次。然后，吸出 CM-PBS，然后将 6 mL 还原缓冲液移液到细胞上，并将样品置于冰上 15 分钟。然后，用 6 mL 新鲜还原缓冲液替换培养基，并将样品置于冰上再放置 15 分钟。

这一步至关重要，因为还原缓冲液中包含的谷胱甘肽会裂解残留在细胞表面的生物素 moasis。这确保了只有内化的蛋白质才会被生物素标记。然后，去除还原溶液，并用 6 毫升淬灭缓冲液代替。

将样品在冰上再放置 15 分钟，然后再次重复淬灭步骤。然后，丢弃淬灭缓冲液，用 4 毫升冷冻 PBS 洗涤细胞 3 次。吸出 CM-PBS，然后使用细胞提升器将细胞刮入 1 毫升冷冻 PBS 中，并将悬浮液转移到微量离心管中。

以 100 g 离心 3 分钟，使细胞沉淀。三分钟后，弃去上清液，将细胞重悬于 500 μL 裂解缓冲液中。将样品置于冰上 30 分钟，每 5 分钟涡旋一次。

将裂解物以 14， 000 g 离心，在 4 摄氏度下离心 10 分钟，以沉淀去污剂和可溶性材料。然后，将上清液转移到新的微量离心管中。保存 50 μL 这种裂解物，并添加上样缓冲液。

随后，在 95 摄氏度的干浴中使细胞变性。这是输入组分，包含生物素化的内吞蛋白和非生物素化的蛋白质。使用切割的移液器吸头，向裂解物中加入 150 μL 链霉亲和素琼脂糖浆液，并在 4 摄氏度下在摇床上孵育 3 小时。

3 小时后，在 4 摄氏度下以 1， 500 g 离心 30 秒，使链霉亲和素琼脂糖珠沉淀。将微珠重悬于 1 mL 洗涤缓冲液中，并在 4 摄氏度下摇动 3 分钟。沉淀珠子，弃去上清液。

再重复此过程四次，以尽量减少非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。然后，在 4 摄氏度下以 1， 500 g 离心 30 秒，使珠子沉淀。丢弃覆盖的洗涤缓冲液，并加入 50 μL 的 1 x 上样缓冲液。

通过在 95 摄氏度下变性，从珠子中释放生物素和链霉亲和素。该部分应仅包含内化的细胞表面蛋白。然后，通过 SDS-PAGE 分离输入、细胞表面和未结合的组分，并通过 Western 印迹进行分析。

这里显示的是未经处理的星形胶质细胞和用 24 纳摩尔层粘连蛋白处理的星形胶质细胞的细胞表面、细胞内和总级分，探测水通道蛋白-4 和 β-肌营养不良蛋白聚糖。该直方图说明了未处理和层粘连蛋白处理的星形胶质细胞中水通道蛋白-4 细胞表面水平的差异，针对 β-dytroglycan 进行标准化。在该图中，探测在 0 分钟、15 分钟和 30 分钟收集的内化蛋白组分中的 Aquaporin-4。

这个直方图总结了 Aquaporin-4 的内化，对于四个独立的实验，根据零分钟时间点的值进行标准化。星号表示在 15 到 30 分钟之间内吞的水通道蛋白 4 的量在统计学上显着增加。当谷胱甘肽用于破坏可裂解生物素类似物中的二硫键时，细胞表面水通道蛋白-4 对生物素化部分的贡献急剧减少。

导致 0 分钟和 15 分钟样品之间存在明显差异。当省略该步骤时，源自单元表面池的信号将使两个时间点之间的变化无法检测到。在此程序之后，可以应用免疫荧光和 TIRF 显微镜等其他方法来回答其他问题，包括货物的物理运输。