利用生物素标记法测定原代星形胶质细胞培养物中蛋白质的细胞表面表达及内吞速率

在本视频中，将介绍两种方法：细胞表面生物素标记法和脉冲-追踪生物素标记法。在接下来的演示中，我们将使用星形胶质细胞。这是大脑中最丰富的胶质细胞类型，恰好表达我们的目标蛋白——水通道蛋白-4（Aquaporin-4）。

本文所采用的方法可应用于多种不同类型的细胞，包括悬浮细胞和贴壁细胞。只要跨膜蛋白具有可被生物素标记的胞外结构域，这些技术便可用于研究几乎所有跨膜蛋白的细胞表面表达及其内化过程。本细胞表面生物素标记实验的总体目标是确定层粘连蛋白对星形胶质细胞质膜上水通透性通道蛋白Aquaporin-4表达的影响。

开始此操作时，将星形胶质细胞培养物从培养箱中取出，通过抽吸弃去培养基。用四毫升预冷的 CM-PBS 洗涤细胞三次，并将培养皿置于碎冰上。抽吸去除 CM-PBS，然后每孔加入两毫升生物素缓冲液。

轻轻前后倾斜培养皿数次，以确保完全覆盖，然后将培养物置于冰上30分钟。随后移除生物素缓冲液，加入4毫升淬灭缓冲液，并将培养物继续置于冰上10分钟。接下来，吸除缓冲液并更换为等量的淬灭缓冲液，再将培养物置于冰上静置10分钟。

然后，弃去淬灭缓冲液，用4毫升预冷的CM-PBS洗涤细胞三次。接着，将细胞刮入1毫升预冷的CM-PBS中，并将悬液转移至微量离心管中。随后，在4°C的预冷微量离心机中以100 ×g离心3分钟，使细胞沉淀。

随后，弃去上清液，并将细胞重悬于 500 微升裂解缓冲液中。然后将样品置于冰上孵育 30 分钟，每 5 分钟涡旋振荡一次。之后，在 4 摄氏度条件下以 14,000 g 离心 10 分钟，使去污剂和可溶性物质沉淀。

然后，将上清液转移至新的微量离心管中。保留50微升裂解液，并加入25微升3×上样缓冲液。随后，在干浴仪中于95摄氏度加热使其变性。

这是输入组分，包含生物素标记的细胞表面蛋白以及未标记生物素的胞质蛋白。使用剪去尖端的移液枪头，将75微升链霉亲和素琼脂糖珠加入裂解液中，在4摄氏度下于摇床孵育3小时。随后，在4摄氏度下以1,500 ×g离心30秒，沉淀链霉亲和素琼脂糖珠。

保留50微升上清液，加入25微升3×上样缓冲液。然后在95摄氏度的水浴或加热块中使其变性。此为细胞内组分，主要包含非生物素化的胞质蛋白。

随后，将沉淀的珠子重悬于一毫升洗涤缓冲液中，在四摄氏度下轻轻摇动三分钟。离心收集珠子并弃去上清液。重复此步骤四次，以最大限度减少非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。

加入50微升用裂解缓冲液稀释至1×的上样缓冲液。在95摄氏度下变性，使生物素和链霉亲和素从磁珠上释放。该组分应仅含有生物素化的细胞表面蛋白。

随后，通过SDS-PAGE分离输入、细胞表面和细胞内组分，并进行蛋白质印迹分析。脉冲-追踪生物素标记实验的总体目标是确定星形胶质细胞中水通道蛋白-4的近似内化速率。首先，将星形胶质细胞培养物从培养箱中取出，并吸除培养基。

随后，用四毫升预冷的 CM-PBS 洗涤细胞三次，并将培养皿置于碎冰上。吸除 CM-PBS，然后用移液器向每个培养皿中加入三毫升生物素缓冲液。轻轻倾斜培养皿数次，使缓冲液均匀分布，并于冰上孵育 30 分钟。

然后，吸除生物素缓冲液，并加入五毫升预热的培养基。将一个培养皿在37摄氏度孵育15分钟，另一个培养皿在相同温度下孵育30分钟。另取一个培养皿置于4摄氏度作为零分钟样本。

孵育结束后，弃去培养基，用四毫升预冷的 CM-PBS 洗涤细胞三次。随后吸除 CM-PBS，再用移液器将六毫升还原缓冲液加入细胞中，冰上放置 15 分钟。然后更换为六毫升新鲜的还原缓冲液，继续冰上孵育额外 15 分钟。

此步骤至关重要，因为还原缓冲液中的谷胱甘肽会裂解仍存在于细胞表面的生物素标记物，从而确保仅有内化的蛋白质被生物素标记。随后，移除还原溶液，并加入六毫升淬灭缓冲液。

将样品继续置于冰上15分钟，再重复淬灭步骤一次。然后弃去淬灭缓冲液，用4毫升预冷的PBS洗涤细胞三次。吸除CM-PBS，再用细胞刮将细胞刮入1毫升预冷的PBS中，转移至微量离心管中。

在100 ×g条件下离心3分钟，使细胞沉淀。3分钟后弃去上清液，将细胞重悬于500 µL裂解缓冲液中。将样品置于冰上孵育30分钟，每5分钟涡旋一次。

将裂解液在 4°C 条件下以 14,000 g 离心 10 分钟，使去污剂和可溶性物质沉淀。然后，将上清液转移至新的微量离心管中。保留 50 微升该裂解液，并加入上样缓冲液。

随后，在干浴器中于 95 摄氏度变性细胞。此为输入组分，包含生物素化内吞蛋白以及非生物素化蛋白。使用剪去尖端的移液器吸头，向裂解液中加入 150 µL 链霉亲和素琼脂糖悬液，并在 4 摄氏度摇床上孵育三小时。

孵育三小时后，在 4°C 条件下以 1,500 ×g 离心 30 秒，使链霉亲和素琼脂糖珠沉淀。加入 1 毫升洗涤缓冲液重悬珠子，并在 4°C 下轻轻摇动孵育 3 分钟。离心沉淀珠子，弃去上清液。

重复此步骤四次，以最大限度减少非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。然后，在 4 摄氏度下，以 1,500 ×g 离心 30 秒，使磁珠沉淀。弃去上层洗涤缓冲液，加入 50 微升 1× 上样缓冲液。

通过在95摄氏度下变性，从磁珠上释放生物素和链霉亲和素。该组分应仅包含内化的细胞表面蛋白。然后，通过SDS-PAGE分离输入样品、细胞表面蛋白组分和未结合组分，并进行Western印迹分析。

图中显示的是未经处理的星形胶质细胞以及经 24 纳摩尔层粘连蛋白处理的星形胶质细胞的细胞表面、细胞内和总蛋白组分，分别用针对水通道蛋白-4（Aquaporin-4）和β-肌营养不良糖蛋白（beta-dystroglycan）的抗体进行检测。该直方图展示了未经处理与经层粘连蛋白处理的星形胶质细胞中，水通道蛋白-4在细胞表面水平的差异，数据经β-肌营养不良糖蛋白归一化。在本图中，在 0、15 和 30 分钟时间点收集的内化蛋白组分均用抗水通道蛋白-4抗体进行检测。

该直方图总结了四次独立实验中水通道蛋白-4内化的结果，数据已相对于零分钟时间点的数值进行了归一化处理。星号表示在15至30分钟之间，内吞的水通道蛋白-4量具有统计学意义的显著增加。当使用谷胱甘肽断裂可裂解生物素类似物中的二硫键时，细胞表面水通道蛋白-4对生物素化组分的贡献急剧减少。

零分钟和15分钟样本之间呈现出明显差异。当省略该步骤时，来自细胞表面池的信号会导致两个时间点之间的变化无法被检测到。完成此操作后，可进一步应用其他方法，如免疫荧光和全内反射荧光显微镜（TIRF显微镜），以回答更多问题，包括货物蛋白的物理转运过程。