Name: 重组离子通道的相对细胞表面表达的总用流式细胞仪测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学习使用流式细胞术定量测定重组离子通道的相对细胞表面表达，该方法采用双标记DNA构建体和荧光标记技术，在tsA-201细胞中分析膜蛋白表达，有助于研究遗传性心律失常相关的离子通道转运缺陷。

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我们感谢 Serge Sénéchal 先生和 Jacques Thibodeau 博士分享他们的专业知识，并允许我们使用其流式细胞术和细胞分选平台。本研究工作得到了加拿大卫生研究院资助号为 130256 的运营基金、加拿大心脏与中风基金会的援助基金，以及蒙特利尔心脏病研究所基金会对 L.P. 的支持。

1. 双标记DNA构建体
<ol>
	<li>通过定点突变法将HA表位（YPYDVPDYA）插入CaVα2δ1胞外连接区D676与R677之间（图3B）20。使用正向引物gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC和反向引物acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC。</li>
	<li>将标记HA的CaVα2δ1 cDNA序列亚克隆至哺乳动物表达载体pmCherry-N1中，使蛋白在SacI和SalI位点之间与mCherry的N端融合表达（图3B）20。 
	注意：需使用对照质粒并通过标准电生理方法检测通道功能是否正常24。</li>
</ol>
2. 脂质体介导的瞬时转染（30 分钟，所有步骤均在层流罩内进行）
<ol>
	<li>第1天：在35 mm培养皿中接种50万个tsA-201细胞（或HEKT细胞），加入2 mL添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（PS）的高糖Dulbecco改良必需培养基（DMEM-HG）。使用标准血细胞计数板对细胞进行计数，并用台盼蓝染色法检测部分细胞样本的活力。接种足够数量的细胞，以确保转染时细胞融合度达到90%。</li>
	<li>第2天：更换培养基，加入2 mL新鲜预热（37 °C）的不含青霉素-链霉素的培养基。</li>
	<li>针对每个转染样本，准备两个1.5 mL离心管。在第1管中，将4 µg DNA溶于250 µl低血清培养基中；在第2管中，将10 µl脂质体介导的转染试剂与250 µl低血清培养基混合。使用前轻轻混匀转染试剂。</li>
	<li>室温孵育5分钟。</li>
	<li>将第1管和第2管的内容物混合，轻轻混匀后，于室温下孵育至少20分钟。</li>
	<li>将脂质体/DNA复合物加入培养细胞中，并轻轻摇动培养皿以混匀。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
</ol>
3. 流式细胞术细胞染色（3 小时）
<ol>
	<li>准备细胞样品
	<ol>
		<li>第3天：小心移除培养皿中的培养基，并用400 µl预热（37 °C）的0.05%胰蛋白酶-1x EDTA（乙二胺四乙酸）洗涤细胞。</li>
		<li>加入400 µl胰蛋白酶-EDTA，于37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟，使细胞从培养皿表面脱落。</li>
		<li>加入1 ml不含PS的冷培养基以终止酶消化，并轻轻吹打4–5次，将所有细胞从表面洗脱。避免过度消化和过度吹打，以减少细胞死亡。</li>
		<li>将细胞收集至1.5 ml离心管中，立即置于冰上。使用预冷溶液并将细胞保持在4 °C，以防止表面抗原内化。降低光照强度以减少荧光信号的光漂白。</li>
		<li>在4 °C下以400 × g离心5分钟。小心吸除并弃去上清液。</li>
		<li>用1 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀，制备单细胞悬液。</li>
		<li>轻轻短暂涡旋振荡管子，并重复步骤3.1.5和3.1.6，以彻底去除残留培养基。</li>
		<li>用600 µl 1× PBS重悬沉淀，并将细胞浓度调整至至少3 × 106 个细胞/ml。</li>
		<li>将细胞分装至两个新的1.5 ml离心管中，用于胞外和胞内染色。设置适当的对照，以区分特异性染色与非特异性染色。 
		注意：同型对照抗体有助于评估背景染色水平，应尽可能与每种一抗的宿主物种、同型和荧光染料相匹配。同型对照抗体和偶联抗体应使用相同的蛋白浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="细胞转染抗体染色图；HA蛋白表达分析的对照及颜色结果。" src="/files/ftp_upload/54732/54732table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 
表 1：非通透化与通透化细胞流式细胞术实验的对照样本。 每项实验需包含以下阴性对照：（1）未转染细胞（不加抗体、加同型对照抗体或加偶联抗体）；（2）转染了目的蛋白的细胞，该蛋白亚克隆于不含组成型荧光蛋白的质粒中（pCMV- CaVα2δ1-HA），或带有双标签的构建体（pmCherry-CaVα2δ1），且不加抗体、加同型对照抗体或加偶联抗体。单色对照用于校正荧光染料发射光谱的重叠。每组实验中，非通透化与通透化条件均需运行相同的对照。
<ol start="2">
	<li>完整活细胞的细胞表面染色
	<ol>
		<li>将 1 × 106 个细胞/100 µl 分装至 1.5 ml 离心管中。</li>
		<li>加入终浓度为 5 µg/ml 的 FITC 标记单克隆抗 HA 抗体，混匀后在 4 °C 避光条件下，于摇床上（200 rpm）孵育 45 分钟。 
		注：抗体的最佳浓度已在初步的滴定实验中确定（图 4）。</li>
		<li>从避光环境中取出细胞，每管加入 900 µl 1× PBS，于 4 °C 以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将沉淀重悬于 1 ml 1× PBS 中，充分涡旋混匀，于 4 °C 以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>重复洗涤步骤（步骤 3.2.4）两次，以去除未结合的抗体。若使用未标记的一抗，则需加入相应的二抗进行孵育。</li>
		<li>最后一次洗涤后，将细胞重悬于 500 µl 1× PBS 中，并将单细胞悬液转移至 5 ml 流式细胞管中。将细胞置于 4 °C 避光保存，直至上机检测。</li>
		<li>将样品上机进行流式细胞分析。为获得最佳结果，应尽快在染色后 24 小时内完成检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胞内染色：固定、通透与染色
	<ol>
		<li>将 1 × 106 个细胞/100 µl 分装至 1.5 ml 离心管中，于 4 °C 以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞直接用 100 µl 原液固定-通透溶液重悬。</li>
		<li>于 4 °C 避光孵育 20 分钟。</li>
		<li>加入 100 µl 新鲜配制的 1× 通透洗涤缓冲液（将 10× 通透洗涤缓冲液用去离子 H2O 稀释至 1×），涡旋混匀后，使用台式离心机于 4 °C 以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>吸除并弃去上清液。</li>
		<li>重复步骤 3.3.4 和 3.3.5 一次。</li>
		<li>在 100 µl 1× 通透洗涤缓冲液中加入终浓度为 5 µg/ml 的 FITC 标记单克隆抗 HA 抗体，混匀后于 4 °C 避光孵育 30 分钟。 
		注：胞内染色的操作流程与细胞表面染色基本相同。然而，皂苷介导的细胞通透过程是快速可逆的，因此在胞内染色过程中必须使用 1× Perm/Wash 缓冲液替代 1× PBS，以确保细胞始终处于含皂苷的环境中。</li>
		<li>从避光环境中取出细胞，加入 100 µl 通透洗涤缓冲液，于 4 °C 以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>小心吸除上清液，将沉淀重悬于 100 µl 通透洗涤缓冲液中，充分涡旋混匀，于 4 °C 以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>再重复洗涤一次（步骤 3.3.9），以彻底去除未结合的抗体。</li>
		<li>最后一次洗涤后，将细胞重悬于 500 µl 1× PBS 中，并将单细胞悬液转移至 5 ml 流式细胞管中。将细胞置于 4 °C 避光保存，直至上机检测。</li>
		<li>将样品上机进行流式细胞分析。固定后的样品应尽快检测，最迟不超过染色后 1 周。非通透与通透处理的细胞应在同一天内完成检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 流式细胞术
<ol>
	<li>流式细胞仪分选仪每日设置
	<ol>
		<li>打开流式细胞术软件。实验前，校准并设置流式细胞分选仪，以确保仪器性能处于最佳状态（即 使用仪器校准微球验证激光与光学元件是否达到规格要求，以及激光与流动池是否正确对齐。</li>
		<li>使用 100 µm 20 psi鞘液压力的喷嘴 
		注意：台式流式细胞仪无需更换喷嘴。</li>
		<li>根据制造商的规格设置流式细胞仪的流速。过高的流速会降低检测荧光变化的灵敏度。</li>
		<li>选择蓝色激光（488 nm，用于激发异硫氰酸荧光素或 FITC）和黄绿色激光（561 nm，用于激发 mCherry）。分别使用 530/30 nm 和 610/20 nm 带通滤光片收集 FITC 和 mCherry 的荧光信号。</li>
		<li>获取未染色细胞的前向散射（FCS）与侧向散射（SSC）点图，使用线性刻度。调节每个检测器的放大倍数，使细胞显示在点图的左下象限。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完整未透化的细胞样本读取
	<ol>
		<li>通过在待分析细胞周围绘制自由形状区域，排除细胞碎片和细胞聚集体，从而将荧光信号限定于完整细胞，为活的非通透处理细胞设定P1门。 
		注意：可使用活/死细胞排除性染料以辅助在活细胞门控P1中设置圈门。设定记录事件数为10,000个，必要时可增加事件数量。</li>
		<li>获取 mCherry 与 FITC 双参数等高线图，以检测未染色细胞的基线自发荧光。采用双对数坐标以显示负值，并提高细胞群体间的分辨能力25调节每个检测器的电压，使未染色的阴性细胞位于对数荧光强度图前十个单位的较低区域。</li>
		<li>使用在4.1.5和4.1.6中设定的参数，采集所有完整未破膜样本的FSC、SSC及荧光检测器中的信号。</li>
		<li>导出并保存 *.fcs 文件，用于流式细胞术分析软件进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透化细胞的样本读取
	<ol>
		<li>将P1门移动至破膜样本中以选择活细胞，并根据4.1.5和4.1.6所示调整FSC和SSC电压。</li>
		<li>获取所有透化处理的样本，收集前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）以及荧光检测器中的信号。</li>
		<li>导出并保存用于流式细胞术分析软件进行分析的 *.fcs 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>启动流式细胞术分析软件，并导入 4.2.4 和 4.3.3 步骤中保存的 *.fcs 文件。</li>
		<li>单击工作区窗口中列出的第一个样本。一个以管编号（tube I.D.）命名的新窗口将自动打开。在SSC对FSC的散点图中开始设门过程。使用椭圆图标围绕活细胞绘制门（P1），排除那些与活细胞在前向散射和侧向散射特性上不同的碎片、死细胞或聚集体</li>
		<li>绘制活细胞的 mCherry（y 轴）与 FITC（x 轴）荧光强度双参数等高线图时，首先点击 x 轴并选择 FITC-A 通道，然后点击 y 轴并选择 PE-mCherry-A 通道。点击“Quad”图标，将象限标记置于各荧光通道中自发荧光细胞边缘处。 
		注意：围绕 FITC 和 mCherry 阳性细胞的设门为 P2 门。荧光阴性细胞群体称为 P3 门。参见 图5 本文所采用的代表性设门方法。</li>
		<li>选择 P2 和 P3 门，然后在原始工作区窗口中点击“Add Statistics”图标。从选项列表中点击“Count”（阳性细胞数量），以及“Mean”（每种荧光染料的平均荧光强度）或“Median”（每种荧光染料的中位荧光强度）统计项。再次点击“Add Statistics”图标。所有这些数值将自动传输至原始工作区窗口。 
		注意：仅当荧光强度符合正态分布时，才使用“均值”（Mean）。在所有其他情况下，点击“中位数”（Median）选项卡。因此，MFI 可指平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity）或中位荧光强度（Median Fluorescence Intensity）。 
		注意：下一步是将门控参数和统计结果应用于流式细胞仪检测的所有样本。</li>
		<li>在工作区窗口中，使用鼠标将门控和统计参数拖放到标记为 ALL SAMPLES 的行上。</li>
		<li>生成非透化和透化细胞的二维轮廓图（mCherry 对 FITC）及直方图（细胞数 对 荧光强度）的批次报告图6A-B).</li>
		<li>根据步骤 4.4.4 生成的统计数据，计算各荧光染料在染色细胞中的平均荧光强度（MFI）。从该数值中减去未染色细胞测得的 MFI 值，以定量目标蛋白的表面表达与总表达水平。</li>
		<li>报告每种荧光染料（mCherry 和 FITC）的 ΔMFI 值（图6C-D）。对测得的 Ca ΔMFI 进行归一化处理V将α2δ1构建体突变体的ΔMFI值与野生型（WT）构建体的FITC和mCherry ΔMFI值进行比较。 
		注意：荧光强度的绝对值可能因抗体批次以及各实验室操作人员的技术水平不同而出现显著差异，因此需要使用野生型（WT）构建体对突变体构建体的荧光强度进行归一化处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

该基于流式细胞术的检测方法已成功应用于测量荧光标记的电压门控钙通道孔形成亚基及其相关亚基的相对总量和细胞表面水平14,22,26。该方法最适合用于研究基因突变的影响，因此要求荧光标记的野生型带标签构建体的本征荧光强度至少比荧光标记的无标签构建体的荧光强度高10至100倍。在本实例中，本文所述的mCherry-CaVα2δ1-HA构建体所产生的信噪比和动态范围均大于先前发表的CaV1.2-HA和CaV2.3-HA构建体所测得的结果。造成这一现象的原因可能有多种。可以推测，CaVα2δ1蛋白胞外域中HA表位的局部环境优化了FITC偶联抗HA抗体的信噪比。
此外，需要注意的是，该方法无法提供细胞表面蛋白质数量的绝对值。然而，通过在相同条件下平行进行膜片钳和流式细胞术实验（如参考文献22的图7所示），仍可获得为实现功能性通道表达所需的标记构建体的相对表达水平。根据这些数据可以估计，峰值电流密度（离子通道活性的整体性指标）通常随...

本文提供了一种可靠的检测方法，利用现有的流式细胞术技术，报告在重组细胞中表达的膜蛋白（如离子通道）的相对细胞表面表达水平。离子通道是一类形成孔道的膜蛋白，通过调控离子跨细胞膜的流动来控制电信号。根据其激活机制、通过孔道的离子种类的性质及选择性，可对离子通道进行分类。在细胞和组织水平上，离子通道介导的宏观离子流是其生物物理特性（门控与通透）、生化特性（磷酸化）以及生物合成特性（合成、糖基化、转运和降解）共同作用的结果1。这些过程对每种离子通道具有特异性，并经过优化以实现其特定的生理功能。因此，任何这些精细调控过程因遗传或基因突变而发生改变——通常称为“通道病”——都可能破坏细胞稳态。需要特别强调的是，将适量的离子通道递送至细胞表面对于维持细胞稳态至关重要。离子通道功能的轻微增强（功能获得）或轻微减弱（功能丧失）均有可能在一生中引发严重的病理后果。成熟离子通道向细胞表面递送的缺陷是多种通道病的重要决定因素，例如囊性纤维化（CFTR离子通道）2 和长QT综合征型心律失常（心脏钾离子通道）3。
通道病与心脏性猝死相关4目前全球范围内所有心脏离子通道病的患病率估计至少为1:2,000至1:3,000。5 并导致约一半的突发性心律失常性心脏死亡病例6心脏电压门控钠离子、钾离子和钙离子选择性离子通道的功能障碍已知在此过程中起关键作用。L型CaV1.2 电压门控钙通道是启动心肌同步收缩所必需的。心脏L型CaV1.2 钙通道是由主要成孔亚基 CaVα1 亚基和 CaVß 和 CaVα2δ1 辅助亚基7-12请注意，需要全套的辅助亚基才能形成功能性的CaV1.2 钾通道在细胞膜上的定位以及这些亚基之间的动态相互作用对于维持心脏正常的电生理功能至关重要13. 钙Vß 促进 Ca 的细胞表面表达V1.2 通道通过非共价纳摩尔级疏水相互作用14共表达CaVα2δ1 亚基与 CaVß-结合的 CaVα1 增强峰值电流表达（5 至 10 倍），并促进通道在更负的电压下激活。孔道形成亚基 CaV1.2 已被证实与一种称为长QT综合征的心室性心律失常相关15 而构成L型Ca通道的三个主要亚基上存在大量点突变V已在患有短QT综合征型心律失常的患者中鉴定出1.2型通道16,17离子通道是膜蛋白，可从生物化学角度（蛋白质化学）或利用电生理学工具（电流检测装置）进行研究，通常需结合这两种互补的方法。电生理学，特别是全细胞膜片钳技术，是阐明离子通道功能的适宜方法。15 但无法区分蛋白质运输的改变与其生物物理特性变化之间的差异。然而，由于大型膜蛋白的表达量相对于较小的可溶性蛋白通常较低，蛋白质化学方法的应用往往受到限制。为了特异性地研究导致离子通道细胞表面表达改变的蛋白质生物合成缺陷，亟需开发基于荧光检测的稳健高通量方法。
流式细胞术是一种用于细胞计数、分选、生物标志物检测和蛋白质工程的生物物理技术18当含有活细胞或颗粒的样本溶液被注入流式细胞仪时，细胞会被排列成单一的液流，从而可被仪器的检测系统进行检测图1）。首台流式细胞仪于1956年问世19 仅能检测一个参数，但现代流式细胞仪配备多个激光器和荧光检测器，可同时检测超过30种荧光参数20,21滤光片和反射镜（发射光学元件）将细胞的散射光或荧光引导至电子网络（光电二极管和检测器），后者将光信号按其强度比例转换为电信号。数字数据通过专用软件进行分析，主要输出结果以散点图形式显示。21.
<img alt="配备蓝光/红光激光器、光束整形装置及用于荧光检测的光电倍增管的流式细胞仪设置示意图" src="/files/ftp_upload/54732/54732fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：流式细胞分选的生物物理原理。 单个细胞在高压作用下通过鞘液流经喷嘴，使其依次穿过一个或多个激光检测点。当细胞通过时会偏转激光束，前向散射的光信号（前向散射光，FSC）被收集并导向光电二极管，该信号强度与细胞大小成正比。同时，在与激光路径呈90°方向收集的光信号被送至检测器（也称为光电倍增管，PMT）。这些光信号通过二向色镜分光，用于检测侧向散射光（SSC），该信号反映细胞内部的颗粒度，以及在细胞内存在被激发荧光染料时产生的荧光发射信号。图中以绿色、黄色和红色三个检测通道表示，各通道配备不同波长的带通滤光片，从而实现多种荧光染料的同时检测。不同信号由外部计算机进行数字化处理，并转换为可用于定量分析细胞特征的数据。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54732/54732fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
利用流式细胞仪的高通量能力，定量分析在活细胞中表达的重组野生型及膜转运缺陷型电压门控L型CaV1.2通道及其相关亚基的相对膜表达水平。编码目标蛋白的cDNA构建体采用双重标记策略，使其同时携带一个可被不可渗透性荧光标记抗体识别的胞外非荧光表位，以及一个组成型荧光的胞内荧光蛋白。该胞外表位插入蛋白的胞外环区域，而胞内荧光蛋白则插入蛋白C末端之后，两者均随目标蛋白一同翻译表达。在本系列实验中，CaVα2δ1蛋白经基因工程改造，表达一个位于胞外的血凝素（HA）表位（YPYDVPDYA），该表位可由不可渗透性的FITC（异硫氰酸荧光素）标记抗HA抗体识别，同时以mCherry作为内源性胞内荧光蛋白。为测定mCherry-CaVα2δ1-HA标记蛋白的相对细胞表面表达水平，转染后收集表达融合蛋白的重组细胞，并用FITC标记的小鼠单克隆抗HA表位抗体进行染色（图2）。FITC是一种有机荧光化合物，其分子尺寸显著小于酶类报告分子，因此对生物功能的干扰可能性较小。在tsA-201细胞中过表达的mCherry-CaVα2δ1-HA蛋白，在二维荧光图谱中可产生明显的3个数量级的FITC荧光与mCherry荧光增强22。由于HA表位位于蛋白的胞外区域，因此在完整细胞条件下测得的FITC荧光强度反映了HA标记蛋白在细胞表面的相对表达水平。通过在细胞透化后检测FITC信号，系统验证了构建体中HA表位的可及性。该检测还可用于验证归一化的总蛋白表达水平，因为在透化细胞中估算的FITC相对荧光强度，与在透化和非透化条件下测得的mCherry相对荧光值在定性上具有可比性22,23。需特别注意的是，透化后内源荧光光谱会向更高值偏移，但报告的唯一数值是相对于对照构建体的荧光强度变化。测试构建体的荧光强度相对变化通过各荧光染料（mCherry或FITC）的Δ平均荧光强度（ΔMFI）值进行估算。实验设计旨在测量测试构建体相对于在相同条件下表达的对照构建体的荧光强度，以减少荧光标记抗体自身荧光在实验中的变异。本方法已成功用于研究两种膜蛋白：L型电压门控钙通道的成孔亚基CaV1.214,22，以及另一系列实验中的胞外辅助亚基CaVα2δ122,23。以下实验方案用于测定心脏L型CaV1.2通道CaVα2δ1亚基在对照条件及影响离子通道翻译后修饰的突变条件下的细胞表面表达水平。在标准化实验条件下，FITC的细胞表面荧光强度随编码mCherry-CaVα2δ1-HA蛋白的cDNA表达量呈准线性增加（参考文献22中的图5）。
<img alt="细胞转染过程示意图；通透化、染色、流式细胞仪、数据分析。" src="/files/ftp_upload/54732/54732fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2：流式细胞术实验方案中总表达与膜表面标记的示意图。该示意图概述了通过流式细胞术定量分析重组离子通道的总表达量及细胞表面表达量所需的一些关键步骤。将双标签构建体 mCherry-CaVα2δ1-HA 转染至 tsA-201 细胞中（1），随后在通透化处理前或后进行染色（2）。在流式细胞仪中获取多参数数据（3），用于多变量分析（4）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54732/54732fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>Q5 定点突变试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E0554S</td><td>可用 QuickChange 定点突变试剂盒（Agilent，#200523）替代。</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72-690-001</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>&amp;nbsp;62-554-002</td><td></td></tr><tr><td>一次性刻度移液管&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>160001-192&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>用于 HEKT 细胞的常规培养。</td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>用于 HEKT 细胞的常规培养。</td></tr><tr><td>1 ml 血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1251.001</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1285.001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Life Technologies</td><td>12100-046</td><td>使用前于 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，热灭活，美国来源</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/ml）</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td>用于脂质体转染。可用磷酸钙转染法替代。</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>使用前于 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（1×）0.05%，含酚红</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;磷酸盐缓冲液（1×）</td><td>Fisher</td><td>BP661-10</td><td>可自行配制&quot;&quot;。</td></tr><tr><td>抗 HA-FITC 标记抗体</td><td>Sigma</td><td>H7411</td><td></td></tr><tr><td>IgG1&amp;minus;FITC 同型对照抗体</td><td>Sigma</td><td>F6397</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm 固定/通透试剂盒</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>用于固定/通透处理。通透/洗涤液需在 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher</td><td>49105161</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Fisher</td><td>15250061</td><td>用于检测细胞活力。</td></tr><tr><td>制冷型微量离心机，5430R</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>A14H172200</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Fisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>实验室平台摇床</td><td>Fisher</td><td>545034</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>VWR</td><td>89032-216</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSARIA III&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>648282</td><td>流式细胞仪。</td></tr><tr><td>FlowJo 软件 v10</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo v10 Dongle</td><td>用于数据分析。</td></tr></tbody></table>

利用流式细胞术测定重组离子通道的细胞表面相对表达量与总表达量

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

遗传性或 从头合成 阳离子选择性通道的突变可能导致心源性猝死。这些多跨膜蛋白在细胞质膜上的转运异常，无论是否伴随通道门控行为的改变，通常被认为在此过程中起着重要作用。因此，建立一种能够大规模定量分析心脏离子通道相对细胞表面表达水平变化的方法变得至关重要。本文提供了一种详细方案，用于测定心脏L型钙通道CaV1.2 及膜相关亚基在 tsA-201 细胞中的表达，采用双色荧光流式细胞术检测。与基于显微镜或免疫印迹的定性方法相比，流式细胞术实验具有快速、可重复和高通量的特点，可对大量活细胞样本（数量范围从 104 至 106 具有相似细胞特性的细胞）在单次流式检测中进行分析。构建的质粒设计为在细胞内C末端组成型表达mCherry（从而可快速评估总蛋白表达水平），同时在胞外区域表达血凝素（hemagglutinin, HA）表位，以便利用抗HA荧光标记抗体评估膜蛋白的细胞表面表达。为避免假阴性结果，还对透化处理的细胞进行实验，以确认HA表位的可及性及正确表达。本方法详细介绍了以下步骤：（1）带标签DNA（脱氧核糖核酸）质粒的构建设计，（2）通过脂质体介导将质粒转染至tsA-201细胞，（3）非透化与透化细胞的培养、收集及染色，（4）荧光信号的采集与分析。此外，文中还解释了流式细胞术的基本原理，并深入讨论了实验设计，包括荧光染料的选择、HA抗体的滴定以及对照实验的设置。该方法可对离子通道的总表达量及细胞表面表达量进行客观的相对定量，且可拓展应用于离子泵和质膜转运蛋白的研究。

本文介绍了一种可靠的双色流式细胞术检测方法，用于定量表达于tsA-201细胞中的重组离子通道的总蛋白及细胞表面蛋白含量。以CaVα2δ1亚基为例，对其细胞表面与总蛋白的相对表达水平进行了定量分析。为实现双色流式细胞术检测，CaVα2δ1被双重标记：其一为可被抗HA-FITC偶联抗体识别的细胞外非荧光表位HA；其二为组成性表达的细胞内荧光蛋白mCherry。FITC与mCherry的激发和发射光谱显示，FITC在488 nm激光激发下效率达88%，而在561 nm激光激发下效率降至0%；mCherry在561 nm激光激发下可达到其最大荧光强度的63.9%，而在488 nm激光激发下仅为7.6%（图3）。两种荧光染料的激发与发射光谱均表现出对所选激光器和滤光片组合的最优光信号收集效果及最小光谱重叠。只要特定荧光染料的平均荧光强度（MFI）与单个细胞中CaVα2δ1蛋白的表达量呈直接正比关系而非仅反映荧光阳性细胞数量，流式细胞术即可提供大量细胞群体中膜蛋白相对表达的定量信息。这...

遗传性心律失常通常由突变引起，这些突变会改变一种或多种离子通道在细胞表面的递送。本文中，我们改进了流式细胞术检测方法，用于定量分析在tsA-201细胞中表达的重组离子通道的总蛋白和细胞表面蛋白的相对表达水平。

阳离子选择性通道的遗传性或新生突变可能导致心源性猝死。这些通道在细胞膜转运过程中的异常...

本方法的总体目标是利用荧光间隔检测法对膜蛋白的细胞表面表达进行定量分析。该技术的主要优势在于，流式细胞术可在单次实验中对大量活细胞提供可量化的检测终点。该技术的应用意义延伸至心脏室性心律失常的诊断与治疗，因为这些疾病通常与导致心脏离子通道转运缺陷的遗传突变相关。通常，初次接触该方法的研究人员在寻找合适的表位外侧插入位点时会遇到困难，因为需要确保该位点不影响蛋白质功能，同时在结合偶联抗体后能产生强烈的荧光信号。本实验操作将由我实验室的研究助理 Benoite Bourdin 进行演示。首先，在目标蛋白的胞内C末端通过双标记DNA构建体连接mCherry。此外，表达一种细胞外侧的血凝素表位，可通过荧光抗体检测来估算膜蛋白在细胞表面的表达水平。接下来，采用标准技术培养一板TSA201细胞，直至细胞融合度达到90%。每个样本分别在两个试管中准备转染试剂。取一个1.5毫升离心管，加入4微克DNA和250微升低血清培养基；另取一个离心管，加入10微升脂质体转染试剂和250微升低血清培养基。轻轻混匀两管内容物，并于室温孵育5分钟。随后，将第一管和第二管的内容物轻柔混合，室温孵育20分钟，形成脂质体-DNA复合物。将复合物加入培养的细胞中，轻轻摇动培养皿。将培养皿放回37摄氏度、5%二氧化碳气氛环境中培养24小时。转染试剂加入24小时后，从培养皿中移除培养基，并用400微升预温的胰蛋白酶-EDTA小心洗涤细胞。然后，加入 400 µL 胰蛋白酶-EDTA，将培养皿孵育 5 分钟，使细胞从培养皿表面脱落。细胞脱落后，加入 1 mL 不含青霉素和链霉素的冷培养基以终止酶消化反应。轻柔吹打培养基，反复过液 4 至 5 次，以充分洗涤并收集所有贴壁细胞。然后，将细胞收集到无菌的 1.5 毫升离心管中，并立即置于冰上。后续步骤中使用预冷的溶液，并将细胞保持在 4 摄氏度，以防止表面表位的内化。同时，减少细胞暴露于光线下的时间，以尽量减少荧光信号的光漂白。接下来，离心试管以沉淀细胞。然后，小心吸除并弃去上清液。用一毫升 PBS 重悬沉淀，制备单细胞悬液。然后，短暂离心试管。再次沉淀并重悬细胞，以彻底去除培养基。接着，将细胞沉淀重悬于 600 微升 PBS 中。测定细胞浓度，并将其调整至每毫升至少三百万个细胞。然后，将细胞分装到新的1.5毫升离心管中。务必设置适当的对照，以区分特异性染色与非特异性染色，以及用于细胞外染色和细胞内染色的对照。同型对照抗体将用于评估背景染色水平，应与一抗的同位素类型及荧光素相匹配。必须使用与荧光抗体相同浓度的同型对照抗体。为评估膜蛋白的细胞表面表达水平，首先使用荧光标记抗体对细胞外侧的HA表位进行标记。然后，向试管中加入终浓度为每毫升5微克的FITC标记单克隆抗HA抗体。短暂涡旋混匀细胞，随后在避光条件下于摇床上孵育。将细胞从避光环境中取出，加入900微升PBS。然后离心试管以沉淀细胞，并吸除上清液。接着，用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀，并短暂涡旋混匀。随后，再次进行离心步骤，使细胞重新沉淀。重复此洗涤步骤共三次，以去除任何未结合的抗体。最后一次洗涤后，将细胞重悬于500 µL PBS中，并将单细胞悬液转移至一支5 mL流式细胞术检测管中。将细胞置于4°C避光保存，直至上机检测。为了检测细胞内总蛋白的表达水平，接下来对已透化的细胞进行标记。该步骤采用与细胞表面标记类似的方案，但需加入基于皂苷的细胞透化缓冲液。将细胞离心沉淀后弃去上清液，然后直接从已配制好的储备液中取100 µL固定-透化溶液重悬细胞。将细胞置于四摄氏度避光孵育 20 分钟。随后，加入 100 µL 新鲜配制的通透洗涤缓冲液，短暂涡旋混匀细胞。接着，离心收集细胞，并用通透洗涤缓冲液再洗涤两次。然后，加入终浓度为每毫升5微克的FITC标记单克隆抗HA抗体以及100微升通透洗涤缓冲液。轻轻涡旋混匀细胞，并在4摄氏度避光孵育30分钟。接着，加入100微升通透洗涤缓冲液。将细胞离心成团，并用与之前相同的缓冲液各 100 微升洗涤三次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于 500 微升 PBS 中，并将单细胞悬液转移至一支 5 毫升流式细胞术管中。于同一天内分别检测非通透化和通透化细胞的流式细胞术结果。首先，启动流式细胞术分析软件，并导入流式细胞术实验过程中生成的 fcs 文件。点击第一个样本，开始在侧向散射光对前向散射光的图谱中进行设门。接下来，使用椭圆工具在活细胞周围绘制 P1 门，以去除碎片、死细胞或聚集体。然后，绘制 mCherry 相对于 FITC 荧光强度的管参数轮廓图。在 FITC 和 mCherry 阳性细胞周围设置 P2 门，在荧光阴性细胞群体周围设置 P3 门。接着，选择 P2 和 P3 门，点击原始工作区窗口中的“添加统计”图标。点击“计数”，然后点击“均值”。最后，将门控参数和统计结果应用于流式细胞仪检测的所有样本。本方案用于表征N-糖基化对TSA201细胞中CaV Alpha 2 Delta 1的总表达及细胞表面表达的作用。为了检测细胞表面蛋白表达，对未破膜细胞中N-糖基化位点在四个位点、十六个位点或无位点处被破坏的细胞进行了HA标记检测。在野生型细胞以及N-糖基化位点在四个位点被破坏的细胞中，FITC信号较强；而在十六个位点被破坏的细胞中仅检测到背景水平的信号。对于破膜处理的细胞，所有条件下的FITC荧光均增强，表明所有转染的、带有HA标签的CaV Alpha 2 Delta 1蛋白均被抗HA-FITC抗体染色并检测到。此外，透化与非透化细胞的mCherry荧光水平相似，表明透化处理并未改变相对的mCherry信号。细胞透化后的检测结果显示，16个定位位点被破坏的细胞总蛋白表达量也显著降低，这一结论无论基于透化细胞中FITC荧光的检测，还是基于非透化及透化细胞中组成型mCherry荧光的测量均成立。除该实验流程外，还可进行额外的生理记录，以关联离子通道的表达与功能。该技术还为医学领域的研究人员提供了研究遗传突变、翻译后修饰、微小RNA、小GTP酶以及分子伴侣在重组或天然细胞中表达的膜蛋白运输过程中的作用的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何在重组细胞中进行DNA转染、对NTAC以及透化细胞进行染色，以及如何对样品进行数据分析。请务必注意，操作活细胞时需要采取预防措施，例如在转染过程中于层流式工作台中操作，并在接触化学试剂时佩戴手套。

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生物学

重组离子通道的相对细胞表面表达的总用流式细胞仪测定

在本视频中，我们利用定量流式细胞术演示蛋白质与人工磷脂囊泡之间的相互作用。荧光标记的蛋白质与荧光标记的磷脂囊泡结合后，会使平均荧光强度增加，该变化可通过流式细胞仪检测。...

定量流式细胞术研究标记蛋白与磷脂囊泡相互作用

双分子荧光互补的流式细胞术分析为研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了一种高通量的定量方法。该方法可用于绘制蛋白质结合位点图谱，以及筛选调控蛋白质-蛋白质相互作用的因素。...

双分子荧光互补的流式细胞术分析：一种高通量定量研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法

我们提供了一种用于神经细胞类型表面抗原和/或细胞内抗原流式细胞术分析的实验方案的详细描述。文中阐述了实验设计的关键要点、逐步的操作方法以及流式细胞术的基本原理，旨在帮助神经生物学家充分利用这一强大技术。...

神经细胞类型表面与细胞内抗原分析的流式细胞术方案

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使用成像流式细胞术测量T细胞同种异体反应性

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一种基于流式细胞术的检测方法，用于鉴定可破坏荧光标记的CXC趋化因子配体12与CXC趋化因子受体4结合的化合物

本文介绍了一种基于FRET的流式细胞术方案，用于定量分析酿酒酵母（S.

通过流式细胞术在体内检测和表征蛋白质自组装

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小鼠B细胞发育的流式细胞术表征

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使用定量流式细胞术分析荧光标记蛋白与人工磷脂微囊泡的相互作用

本方案描述了一种通过测量膜电位变化来研究生电性膜蛋白的方法。该检测方法为功能性读取上皮细胞系中内源性表达的多种离子通道提供了平台。...

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通过全光谱流式细胞术分析原代小鼠T细胞中T细胞受体诱导的钙离子内流

学习使用流式细胞术定量测定重组离子通道的相对细胞表面表达，该方法采用双标记DNA构建体和荧光标记技术，在tsA-201细胞中分析膜蛋白表达，有助于研究遗传性心律失常相关的离子通道转运缺陷。

利用流式细胞术测定重组离子通道的细胞表面相对表达量与总表达量

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