使用生物素衍生物评估靶表面蛋白的内化

0 views • 5:16 min • July 8th, 2025

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用可切割的生物素衍生物处理小鼠皮质星形胶质细胞。

低温下孵育以防止蛋白质内化并促进生物素附着在目标表面蛋白质上。

洗涤并加入温热培养基,然后孵育以诱导生物素化蛋白质的内化。

膜不透水还原剂洗涤和处理以裂解未内化的生物素。

加入淬火试剂停止反应并洗涤。

收获细胞并离心。除去上清液。

加入裂解缓冲液裂解细胞,释放非生物素化和内化的生物素化蛋白质。

心以沉淀细胞碎片。

收集含有蛋白质的上清液,加入链霉亲和素-琼脂糖珠,混合以捕获生物素化蛋白质。

心以沉淀珠子并丢弃上清液。

加入上样缓冲液并加热使变性并释放珠子中的蛋白质。

蛋白质在凝胶上运行并将其转移到印迹膜上。

使用一抗和二抗进行检测,以可视化不同的蛋白质条带,确认蛋白质成功内化。

首先,从培养箱中取出星形胶质细胞培养物并吸出培养基。然后,用 4 毫升冷冻的 CM-PBS 洗涤细胞三次,并将培养皿放在碎冰上。吸出CM-PBS,然后将3毫升生物素缓冲液移入每个培养皿中。将盘子来回倾斜几次,以确保缓冲液分布均匀,然后将它们放在冰上 30 分钟。

然后,吸出生物素缓冲液并用 5 毫升温培养基代替。将一个培养皿在 37 摄氏度下孵育 15 分钟,将第二个培养皿在相同温度下孵育 30 分钟。将另一个盘子留在 4 摄氏度作为零分钟样品。

孵育期结束时,弃去培养基并用 4 毫升冷冻的 CM-PBS 洗涤细胞三次。然后,吸出 CM-PBS,然后在细胞上移液 6 毫升还原缓冲液,并将样品放在冰上 15 分钟。

然后,用 6 毫升新鲜还原缓冲液替换培养基,并将样品放在冰上再放置 15 分钟。

此步骤至关重要,因为还原缓冲液中所含的谷胱甘肽将裂解残留在细胞表面的生物素部分。这确保了只有内化的蛋白质才会被偏置和标记。

之后,取出还原液并用 6 毫升淬灭缓冲液代替。将样品在冰上再放置 15 分钟,然后再次重复淬火步骤。然后,弃去淬灭缓冲液并用 4 毫升冷冻的 PBS 洗涤细胞三次。

吸出CM-PBS,然后,使用细胞提升器将细胞刮入1毫升冷冻PBS,并将悬浮液转移到微量离心管中。通过以100g离心三分钟来沉淀细胞。三分钟后,弃去上清液并将细胞重悬于 500 微升裂解缓冲液中。

样品放在冰上 30 分钟,每五分钟涡旋一次。将裂解物以14,000g在4摄氏度下离心10分钟,以沉淀洗涤剂和可溶性材料。然后,将上清液转移到新的微量离心管中。

使用切割的移液器吸头,将 150 微升链霉亲和素琼脂糖浆液加入裂解物中,并在 4 摄氏度下在摇床上孵育三个小时。三小时后,在4摄氏度下以1,500g离心30秒,沉淀链霉亲和素琼脂糖珠。将珠子重悬于 1 毫升洗涤缓冲液中,并在 4 摄氏度下摇晃三分钟。沉淀珠子并丢弃上清液。

再重复此过程四次,以尽量减少非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。然后,在4摄氏度下以1,500g离心30秒,将珠子沉淀。丢弃覆盖的洗涤缓冲液,并加入 50 微升 1x 上样缓冲液。

通过在 95 摄氏度下变性从珠子中释放生物素和链霉亲和素。该部分应仅包含内化的细胞表面蛋白。然后,通过SDS-PAGE分离起始部分,细胞表面和未结合部分,并通过蛋白质印迹进行分析。

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Last updated: 27 June 2026