利用生物素衍生物评估靶表面蛋白的内化

用可裂解的生物素衍生物处理小鼠皮层星形胶质细胞。

在低温下孵育，以防止蛋白质内化并促进生物素与目标表面蛋白质的结合。

洗涤并加入预热的培养基，然后孵育以诱导生物素标记蛋白的内化。

使用膜不可渗透的还原剂清洗并处理，以裂解未内化的生物素。

加入淬灭试剂以终止反应并进行洗涤。

收集细胞并离心，弃去上清液。

加入裂解缓冲液以裂解细胞，释放非生物素化蛋白以及内吞的生物素化蛋白。

离心以沉淀细胞碎片。

收集含有蛋白质的上清液，加入链霉亲和素-琼脂糖珠，混匀以捕获生物素标记的蛋白质。

离心以沉淀磁珠，并弃去上清液。

加入上样缓冲液并加热，以使蛋白质变性并从磁珠上释放。

将蛋白质在凝胶上电泳，然后转移至印迹膜上。

使用一抗和二抗进行检测，以观察到特异性的蛋白条带，从而确认蛋白成功内化。

首先，从培养箱中取出星形胶质细胞培养物，并吸除培养基。然后，用 4 毫升预冷的 CM-PBS 洗涤细胞三次，并将培养皿置于碎冰上。吸除 CM-PBS 后，向每个培养皿中加入 3 毫升生物素缓冲液。轻轻倾斜培养皿数次，确保缓冲液均匀分布，并将培养皿置于冰上孵育 30 分钟。

然后，吸除生物素缓冲液，并加入5毫升预热的培养基。将一个培养皿在37摄氏度下孵育15分钟，另一个培养皿在相同温度下孵育30分钟。另留一个培养皿置于4摄氏度作为零分钟对照样本。

孵育结束后，弃去培养基，用 4 毫升预冷的 CM-PBS 洗涤细胞三次。随后吸除 CM-PBS，再用移液器将 6 毫升还原缓冲液加入细胞中，冰上放置 15 分钟。

然后，将培养基更换为 6 毫升新鲜还原缓冲液，并将样品置于冰上额外孵育 15 分钟。

此步骤至关重要，因为还原缓冲液中的谷胱甘肽会裂解残留在细胞表面的生物素基团。这可确保仅有内化的蛋白质被富集并标记。

随后，去除还原溶液，并加入 6 毫升淬灭缓冲液。将样品置于冰上静置 15 分钟，并重复淬灭步骤一次。然后，弃去淬灭缓冲液，用 4 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞三次。

吸去 CM-PBS，然后用细胞刮将细胞刮入 1 毫升预冷的 PBS 中，并将悬液转移至微量离心管中。在 100 g 条件下离心 3 分钟，使细胞沉淀。3 分钟后，弃去上清液，将细胞重悬于 500 微升裂解缓冲液中。

将样品置于冰上 30 分钟，每 5 分钟涡旋一次。在 4 摄氏度下以 14,000 g 离心 10 分钟，使去污剂和可溶性物质沉淀。然后，将上清液转移至新的微量离心管中。

使用剪去尖端的移液器吸头，向裂解液中加入 150 微升链霉亲和素琼脂糖悬液，在 4 摄氏度下于摇床上孵育三小时。三小时后，在 4 摄氏度下以 1,500 g 离心 30 秒，使链霉亲和素琼脂糖珠沉淀。用 1 毫升洗涤缓冲液重悬珠子，并在 4 摄氏度下轻轻摇动三分钟。再次离心沉淀珠子，弃去上清液。

重复此过程四次，以最大限度减少非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。然后，在 4 摄氏度下以 1,500 g 离心 30 秒，使磁珠沉淀。弃去上层洗涤缓冲液，加入 50 微升 1× 上样缓冲液。

在95摄氏度下进行变性，使生物素和链霉亲和素从磁珠上释放。此组分应仅包含内化的细胞表面蛋白。随后，通过SDS-PAGE分离上样量、细胞表面和未结合组分，并通过Western blotting进行分析。