Name: 小鼠下颌骨髁突的形态学及细胞分析方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学习小鼠下颌骨髁突的形态学及细胞分析方法，通过放射影像和组织学技术评估压缩负荷对软骨结构的影响。该方案可应用于其他小型动物研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨此感谢 David Rowe 博士慷慨提供转基因小鼠，以及 Li Chen 在组织学方面的协助。
本出版物中报道的研究由美国国立卫生研究院国家牙科与颅面研究所根据资助号K08DE025914以及美国正畸基金会对Sumit Yadav的资助支持。

<ol><li>LeResche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Temporomandibular+Disorders%3A+Implications+for+the+Investigation+of+Etiologic+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+functional+loading+causes+differential+effects+in+the+subchondral+bone+and+condylar+cartilage+in+the+temporomandibular+joint+from+young+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice.</a> Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).</li>
<li>Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+decreased+loading+on+the+metabolic+activity+of+the+mandibular+condylar+cartilage+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Orthod%22%5BJournal%5D)">Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat.</a> Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).</li>
<li>Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+temporomandibular+joint+changes+in+Twin+Block+and+Bionator+appliance+therapy%3A+a+magnetic+resonance+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Orthod%22%5BJournal%5D)">Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study.</a> Prog Orthod. 15 (57), (2014).</li>
<li>Dutra, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Matrix+Response+of+the+Mandibular+Condylar+Cartilage+to+Botulinum+Toxin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin.</a> PLoS ONE. 11 (10), 0164599(2016).</li>
<li>Benjamin, M., Ralphs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+fibrocartilage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Biology of fibrocartilage cells.</a> Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).</li>
<li>Shen, G., Darendeliler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Adaptive+Remodeling+of+Condylar+Cartilage-+A+Transition+from+Chondrogenesis+to+Osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis.</a> J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Kaul, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Altered+Loading+on+Mandibular+Condylar+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage.</a> PLoS ONE. 11 (7), 0160121(2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+Multi-Image+Cryohistology+of+Mineralized+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues.</a> J Vis Exp. , e54468(2016).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
<li>Hayman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartrate-resistant+acid+phosphatase+%28TRAP%29+and+the+osteoclast%2Fimmune+cell+dichotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy.</a> Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

本文描述了小鼠下颌髁突和下颌骨的形态测量及细胞学分析方法。放射影像形态测量法也可用于分析其他小型实验动物的骨骼。此外，细胞学分析（细胞定量和软骨距离定位图）不仅限于啮齿类动物的下颌髁突，还可用于多种组织的组织学切片定量分析。
表达荧光报告基因的转基因小鼠模型是直观理解基因表达变化的优良工具。本报告中使用的双胶原荧光报告小鼠模型（Col2a1XCol10a1）特别适用于软骨内成骨中心（MCC）的研究，因为该模型的转基因在MCC的前肥大区和肥大区均有表达，从而可评估胶原的分布情况。如果研究人员无法获得表达荧光报告基因的转基因小鼠模型，也可采用其他组织学蛋白表达分析方法，例如免疫荧光染色。
进行形态测量时，在拍摄台式X光图像前的关键步骤是去除下颌骨或待分析骨骼上的所有软组织。附着在骨骼上的过多肌肉或软组织可能会掩盖结构的真实测量值。需要注意台式X光系统的局限性。与所有X射线成像一样，它是对三维结构的二维呈现，因此应仔细解读结构重叠和伪影。此外，骨骼在X光成像箱中的摆放位置应保持一致。
<p class="jove_conte...

颞下颌关节（TMJ）是位于颅面区域的一种独特的承重关节，由纤维软骨构成。TMJ的髁突软骨复合体（MCC）对关节功能至关重要，包括在说话和咀嚼时实现无阻碍的下颌运动，但它常受到退行性疾病（如骨关节炎1）的影响。TMJ具有适应外部刺激和负荷变化的能力，从而引起MCC各组分发生结构和细胞层面的改变2,3,4,5。MCC的承重特性可通过其组分之间的相互作用来解释，这些组分包括水、胶原网络以及密集排列的蛋白聚糖。MCC具有四个明显不同的细胞区域，各区域表达不同类型的胶原和非胶原蛋白：1）表层或关节面层；2）增殖层，由未分化的间充质细胞组成，可响应负荷需求；3）前肥大层，由成熟软骨细胞构成，表达II型胶原；4）肥大层，是表达X型胶原的肥大软骨细胞发生死亡并钙化的区域。非矿化区域富含蛋白聚糖，可提供对压缩力的抵抗能力6。
在下颌骨髁突软骨内，肥大区持续发生矿化，此处软骨生成向成骨生成转变，从而保证了下颌骨髁突软骨下骨的坚实矿化结构7。未矿化区与矿化区的细胞变化最终导致下颌骨髁突及下颌骨的形态和结构改变。维持软骨内各细胞区域的稳态以及软骨下骨部分的矿化，对于颞下颌关节的健康、承重能力及结构完整性至关重要。
多重胶原蛋白转基因小鼠模型（如 Utreja et al. 所述）8 是研究胶原蛋白表达变化的有力工具，因为所有转基因均在牙髓细胞团（MCC）中表达。为了进行深入的组织学评估，需使用组织学染色方法来研究细胞外基质沉积、矿化、细胞增殖和凋亡，以及MCC不同细胞层中的蛋白质表达情况。
在本研究中，采用组织学和形态计量学分析方法，评估小鼠下颌髁突软骨（MCC）及软骨下骨的细胞和结构变化。此外，本文还描述了一种细胞定量方法，用于分析荧光组织学图像以及绘制光学显微镜切片图谱。同时，为了验证本研究方法的有效性，还展示了可引起MCC和软骨下骨发生细胞及形态学改变的颞下颌关节静态加压加载方法9。
本文所述方法可用于测定啮齿类动物下颌髁突和下颌骨的形态计量学与组织学变化，或用于分析其他软骨内骨化区域以及额外矿化组织的形态。

<table><tbody><tr><td>MX20 数字X射线成像系统</td><td>Faxitron X-Ray LLC&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digimizer 图像分析软件&amp;nbsp;</td><td>MedCalc Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryomatrix 包埋树脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>手动显微镜 Axio Imager Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>208562</td><td></td></tr><tr><td>黄色荧光蛋白滤光片&amp;nbsp; - EYFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>青色荧光蛋白滤光片 - ECFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>红色荧光蛋白滤光片 - Cy5</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>无水乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>酒石酸钠二碱二水合物&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>ELF97 底物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E6600</td><td></td></tr><tr><td>ClickiT EdU Alexa Fluor 594 高内涵筛选试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>C10339&amp;nbsp;</td><td>包含 EdU (5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐)</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>甲苯胺蓝 O&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop&amp;nbsp;</td><td>Adobe Systems Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液片剂 (PBS)</td><td>Research Products International</td><td>P32080-100T</td><td></td></tr><tr><td>CNA Beta III 无镍弓丝</td><td>Ortho Organizers, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism&amp;nbsp;</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于小鼠下颌髁突的形态计量与细胞分析方法

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

颞下颌关节（TMJ）具有对外部刺激产生适应的能力，负荷变化可影响髁突的位置以及下颌髁突软骨（MCC）的结构和细胞成分。本文描述了分析这些变化的方法，以及一种在小鼠中改变TMJ负荷的方法即， 压缩性静态颞下颌关节负荷）。此处展示的结构评估是一种简单的形态计量学方法，采用Digimizer软件对小型骨骼的X线影像进行分析。此外，还描述了MCC中导致胶原表达改变、骨重塑、细胞分裂以及蛋白聚糖分布变化的细胞水平变化分析。通过图像软件计数荧光阳性像素，并结合Digimizer测量距离图谱和染色面积，对组织学切片中这些变化进行定量分析的方法也一并展示。本文所展示的方法不仅限于小鼠颞下颌关节，也可应用于其他小型实验动物的额外骨骼，以及软骨内成骨的其他区域。

采用描述性统计方法分析形态测量指标（下颌骨长度、髁突长度、髁突宽度）和组织学分析结果的分布情况。在受力组（即， 接受β-钛合金弹簧加压载荷的小鼠）和对照组（即， 未接受任何处理的匹配对照小鼠）。均值之间的统计学显著差异通过非配对 t 检验确定，p 值小于 &lt;0.05 被视为具有统计学意义。
如步骤4和图3所述，对加载组和对照组的下颌骨进行了形态测量。与对照组相比，加载组的下颌骨长度显著增加（加载组：16.62 ± 0.23 mm，对照组：16.21 ± 0.2 mm；p &lt; 0.05），髁突头长度也显著增加（加载组：4.6 mm，标准差0.08 mm，对照组：4.4 mm，标准差0.06 mm；p &lt; 0.05）。然而，两组之间的髁突宽度差异无统计学意义（加载组：3.06 ± 0.12 mm，对照组：2.9 ± 0.11 mm；p = 0....

本文介绍了分析啮齿类动物下颌髁突形态计量学和细胞变化的方法。

颞下颌关节（TMJ）具有对外部刺激产生适应的能力，加载变化可影响髁突的位置以及……

本实验的总体目标是通过放射影像中的形态测量和组织学分析，观察压缩载荷对小鼠下颌髁突软骨的影响。这些指标有助于回答有关啮齿类动物下颌骨髁突内结构和细胞变化的关键问题。本方法的主要优势在于，其可被用于分析其他小型哺乳动物或参与实验的动物。进行本方案时，需预先分离并解剖好小鼠下颌骨以备使用。将下颌骨转移至培养皿中，然后放入X射线成像系统内，以26千伏照射5秒拍摄X光片。现在，在分析软件中打开图像以进行形态测量。首先，使用单位按钮设置比例尺。然后，选择标记样式2，标定六个解剖点。首先，选择下颌髁突最靠后方的点作为点一。接着，选择喙突作为点二。然后，选择乙状切迹最深的点作为点三。接下来，选择下颌支凹面最深的点作为第四点，然后选择髁突关节面最靠前的点作为第五点。现在，选择髁突关节面最靠后的点作为第六点，然后使用长度测量工具进行长度测量。接下来，使用从第三点到第四点的垂直线工具，测量髁突头部长度，即从第一点到第三点与第四点之间连线的垂直距离。然后，测量第一点与第二点之间的下颌骨长度。最后，测量第五点与第六点之间的髁突头部宽度。为保存数据，请复制屏幕右侧的测量列表。在包埋固定但未脱钙的下颌骨之前，先将其在含30%蔗糖的PBS溶液中浸泡过夜。次日，剔除多余的软组织，并小心地切下下颌骨髁突。随后，将样本置于塑料模具中，使髁突的内侧面紧贴模具底部，且样本与模具底部保持平行。然后，将样本浸入包埋树脂中，并用一块干冰冷却树脂。接着，用更多的包埋树脂填充模具。将模具转移至冰冷的2-甲基丁烷中，该试剂可用冷冻机或干冰预冷。冷却后，将样本储存在 -20 摄氏度或 -80 摄氏度下以备切片。为定量分析髁突矢状切片中 MCC 区域的 Col10a1 表达，使用图像分析软件打开组织学图像，并利用套索工具选择感兴趣区域。此处选择的区域为 MCC 区域。注意直方图框中报告的该区域像素数量。接下来，通过调整颜色范围来选择 Col10a1 红色像素。使用吸管工具从图像中选择一个红色像素，然后点击“确定”。随后，记录直方图框中报告的该区域内红色像素的数量。该区域中红色像素所占的比例代表 Col10a1 表达量。接下来，采用相同的基本技术，对 MCC 和软骨下骨中的 TRAP 活性进行定量分析。首先，选择软骨下骨区域中的软骨作为待分析区域，并记录总像素数。然后，选择由 ELF97 底物产生的黄色像素。记录阳性像素的数量，并计算 TRAP 阳性像素所占的比例。接着，对经 DEPI 复染呈蓝色的 EDU 阳性细胞进行定量分析。再次选择目标区域，然后量化该区域内的蓝色像素。同时使用此方法确定同一区域内 EDU 阳性像素的数量。对接受压缩性颞下颌关节加载的小鼠进行形态测量学分析显示，加载显著增加了下颌骨和髁突头部的长度。然而，加载处理并未导致髁突宽度发生显著变化。胶原分布的定量分析显示，加载组动物髁突中Col10a1表达水平及MCC均显著升高，而Col2a1表达水平与对照组相比无明显差异。髁突软骨下区域和受力小鼠的TRAP活性增加，同时伴有软骨下细胞增殖增加。EDU染色表示增殖细胞的数量。通过评估甲苯胺蓝染色面积及距离图，对MCC中蛋白聚糖的分布进行了定量分析。加载组髁突的MCC区域距离映射显著增加。然而，两组之间的蛋白聚糖染色面积在统计学上无显著差异。观看本视频后，您应能够充分理解如何分析啮齿类动物下颌髁突的细胞和结构变化。

a-morphometric-cellular-analysis-method-for-murine-mandibular

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

小鼠下颌骨髁突的形态学及细胞分析方法

颅面骨细胞的组织结构长期以来一直被假设，但从未被直接观察到。多光谱细胞标记和 体内 活体...

通过Zebrafish克隆细胞分析可视化胚胎下颌软骨细胞的嵌合与定向增殖

许多生物结构缺乏易于定义的解剖标志点，使得现代形态测量学方法难以应用。本文以小鼠阴茎骨（baculum）为例，介绍其研究方法，包括解剖与显微CT扫描，随后采用计算方法定义半标志点，用于量化其大小与形状的变异。...

阴茎骨的解剖、显微CT扫描及形态测量分析

我们提出一种方法，用于评估在施加可控机械负荷或冲击后，完整小鼠关节关节面上细胞损伤/死亡的空间范围。该方法可用于研究骨关节炎、遗传因素和/或不同加载方案如何影响关节组织的易损性 原位...

实时可视化与分析机械负荷对完整小鼠软骨外植体中软骨细胞损伤的影响

本方案描述了利用激光显微切割技术从新鲜冷冻的小鼠胚胎切片中分离软骨和骨组织的方法。通过焦宁Y染色可快速可视化软骨和骨组织，并可精确采集，以获得高质量的RNA用于转录组分析。...

激光捕获显微切割小鼠胚胎软骨与骨骼用于基因表达分析

我们介绍了一种在小鼠中诱导正畸牙齿移动的实验方案，以及无需切片即可对牙周膜中的胶原纤维和血管进行三维可视化的技术方法。...

小鼠下颌正畸牙齿移动过程中牙周膜胶原纤维的三维成像

本实验方案描述了在切断小鼠内侧半月板胫骨韧带以使膝关节失稳后，对关节软骨表面进行可控的微刃划伤操作。该动物模型可诱导骨关节炎（OA）的加速发展，适用于研究骨赘形成、骨硬化以及早期疼痛等病理过程。...

内侧半月板失稳与软骨划痕小鼠加速性骨关节炎模型

本方案逐步演示了如何从小鼠中提取下颌第一磨牙，为专注于颌骨愈合与再生研究的研究人员提供了一种替代方法。...

小鼠下颌磨牙拔牙窝愈合模型的建立

本文逐步演示了一种在小鼠上颌模型上可操作的正畸牙齿移动方案。通过每一步骤的详细说明和可视化展示，研究人员可掌握该模型，并稍作修改后应用于自身的实验需求。...

小鼠上颌正畸模型的建立

本文介绍了一种研究正畸牙齿移动（OTM）的实验方案，该模型适用于探究骨组织适应机制、牙根吸收过程以及骨细胞对机械刺激的反应。本综合指南详细阐述了OTM模型的建立、微型计算机断层扫描（micro-CT）的数据采集及其后续分析方法。...

研究小鼠中的正畸牙齿移动

本文深入描述了一种基于显微计算机断层扫描技术的方法，用于对小鼠颅面骨进行三维模型的分割与测量，相较于现有方法，可更准确地评估小鼠颅面骨的发育情况。...

利用三维显微计算机断层扫描分析小鼠颅颌面畸形

本研究中，我们描述了一种逐步操作的实验方案，并重点强调了确定活细胞中线粒体形态特征的关键细节，包括样品制备、图像采集和数据分析。该方法常用于研究多种生理或病理状态下线粒体的形态变化。...

利用共聚焦显微镜测定活细胞中线粒体形态

学习小鼠下颌骨髁突的形态学及细胞分析方法，通过放射影像和组织学技术评估压缩负荷对软骨结构的影响。该方案可应用于其他小型动物研究。

一种用于小鼠下颌髁突的形态计量与细胞分析方法

探索更多视频