一种用于小鼠下颌髁突的形态计量与细胞分析方法

本实验的总体目标是通过放射影像中的形态测量和组织学分析，观察压缩载荷对小鼠下颌髁突软骨的影响。这些指标有助于回答有关啮齿类动物下颌骨髁突内结构和细胞变化的关键问题。本方法的主要优势在于，其可被用于分析其他小型哺乳动物或参与实验的动物。

进行本方案时，需预先分离并解剖好小鼠下颌骨以备使用。将下颌骨转移至培养皿中，然后放入X射线成像系统内，以26千伏照射5秒拍摄X光片。

现在，在分析软件中打开图像以进行形态测量。首先，使用单位按钮设置比例尺。然后，选择标记样式2，标定六个解剖点。

首先，选择下颌髁突最靠后方的点作为点一。接着，选择喙突作为点二。然后，选择乙状切迹最深的点作为点三。

接下来，选择下颌支凹面最深的点作为第四点，然后选择髁突关节面最靠前的点作为第五点。现在，选择髁突关节面最靠后的点作为第六点，然后使用长度测量工具进行长度测量。接下来，使用从第三点到第四点的垂直线工具，测量髁突头部长度，即从第一点到第三点与第四点之间连线的垂直距离。

然后，测量第一点与第二点之间的下颌骨长度。最后，测量第五点与第六点之间的髁突头部宽度。为保存数据，请复制屏幕右侧的测量列表。

在包埋固定但未脱钙的下颌骨之前，先将其在含30%蔗糖的PBS溶液中浸泡过夜。次日，剔除多余的软组织，并小心地切下下颌骨髁突。随后，将样本置于塑料模具中，使髁突的内侧面紧贴模具底部，且样本与模具底部保持平行。

然后，将样本浸入包埋树脂中，并用一块干冰冷却树脂。接着，用更多的包埋树脂填充模具。将模具转移至冰冷的2-甲基丁烷中，该试剂可用冷冻机或干冰预冷。

冷却后，将样本储存在 -20 摄氏度或 -80 摄氏度下以备切片。为定量分析髁突矢状切片中 MCC 区域的 Col10a1 表达，使用图像分析软件打开组织学图像，并利用套索工具选择感兴趣区域。此处选择的区域为 MCC 区域。

注意直方图框中报告的该区域像素数量。接下来，通过调整颜色范围来选择 Col10a1 红色像素。使用吸管工具从图像中选择一个红色像素，然后点击“确定”。随后，记录直方图框中报告的该区域内红色像素的数量。

该区域中红色像素所占的比例代表 Col10a1 表达量。接下来，采用相同的基本技术，对 MCC 和软骨下骨中的 TRAP 活性进行定量分析。首先，选择软骨下骨区域中的软骨作为待分析区域，并记录总像素数。

然后，选择由 ELF97 底物产生的黄色像素。记录阳性像素的数量，并计算 TRAP 阳性像素所占的比例。接着，对经 DEPI 复染呈蓝色的 EDU 阳性细胞进行定量分析。

再次选择目标区域，然后量化该区域内的蓝色像素。同时使用此方法确定同一区域内 EDU 阳性像素的数量。对接受压缩性颞下颌关节加载的小鼠进行形态测量学分析显示，加载显著增加了下颌骨和髁突头部的长度。

然而，加载处理并未导致髁突宽度发生显著变化。胶原分布的定量分析显示，加载组动物髁突中Col10a1表达水平及MCC均显著升高，而Col2a1表达水平与对照组相比无明显差异。

髁突软骨下区域和受力小鼠的TRAP活性增加，同时伴有软骨下细胞增殖增加。EDU染色表示增殖细胞的数量。通过评估甲苯胺蓝染色面积及距离图，对MCC中蛋白聚糖的分布进行了定量分析。

加载组髁突的MCC区域距离映射显著增加。然而，两组之间的蛋白聚糖染色面积在统计学上无显著差异。观看本视频后，您应能够充分理解如何分析啮齿类动物下颌髁突的细胞和结构变化。