小鼠下颌骨髁突的形态学及细胞分析方法
January 11th, 2018
本文介绍了分析啮齿动物下颌骨髁突内形态和细胞变化的方法。
本实验的总体目标是使用 X 光片和组织学分析中的形态测量来观察小鼠下颌髁软骨压缩负荷的影响。这些指标可以帮助回答有关啮齿动物下颌骨髁内结构和细胞变化的关键问题。此处显示的技术的主要优点是它们可用于分析其他小型出生或参与的动物。
对于此协议，已分离、解剖的小鼠下颌骨可供使用。在培养皿上，将下颌骨转移到 X 射线柜系统中。然后，以 26 KB 电压拍摄 X 光片 5 秒钟。
现在，在分析软件中打开图像以进行形态测量。首先，使用单位按钮设置比例尺。接下来，使用标记样式 2 选择六个解剖点。
首先，选择下颌骨髁的最后点作为第一点。接下来，选择第二点的切割过程。然后，选择 sigmoid 缺口处最深的点作为点 3。
接下来，选择下颌支凹陷处最深的点，点 4，然后选择髁关节面的最前点，点 5。现在，选择髁关节面的最后点作为点 6，然后使用长度工具继续进行长度测量。接下来，使用垂直线工具从第 3 点到第 4 点测量髁头长度，即从第 1 点到第 3 点和第 4 点之间的线的垂线长度。
然后，测量第 1 点和第 2 点之间的下颌长度。最后，测量髁头宽度，位于第 5 点和第 6 点之间。要保存数据，请复制屏幕右侧的测量列表。
在包埋固定但未脱钙的下颌骨之前，将它们浸泡在 PBS 中的 30% 蔗糖中过夜。第二天，解剖掉多余的软组织并小心切开下颌骨髁。现在，将样品放入塑料模具中，髁的内表面靠在模具底部，样品平行于模具底部。
然后，将它们浸入包埋树脂中，并用一块干冰冷却树脂。接下来，在模具上涂上更多的包埋树脂。将它们转移到冷的 2 甲基丁烷中，通过冰箱或干冰冷却。
冷却后，将标本储存在零下 20 摄氏度或零下 80 摄氏度进行切片。为了量化髁矢状切片 MCC 中 Col10a1 的表达，请在图像分析软件包中打开组织学图像，并使用套索工具选择感兴趣的区域。在这种情况下，将选择 MCC 区域。
记下区域中的像素数，该像素数在直方图框中报告。接下来，通过调整颜色范围选择 Col10a1 红色像素。使用吸管工具从图像中选择一个红色像素，然后单击 OK.然后，记录区域中的红色像素数，如直方图框中报告的那样。
区域中红色像素的分数表示 Col10a1 的表达量。现在，使用相同的基本技术，量化 MCC 和软骨下骨中的 TRAP 活动。首先，选择软骨下骨区域的软骨作为要分析的区域并记下总像素。
然后，选择 ELF97 基板生成的黄色像素。记下正像素的数量并计算 TRAP 正像素的分数。现在，量化通过 DEPI 以蓝色复染的 EDU 阳性细胞。
再次选择感兴趣的区域，然后量化其中的蓝色像素。还可以使用此方法确定同一区域中 EDU 正像素的数量。对小鼠进行压缩 TMJ 负荷的形态测量表明，负荷显着增加了下颌骨和髁突头的长度。
然而，负荷不会导致髁宽的显着变化。胶原蛋白分布的定量显示，上负荷动物的 Col10a1 表达和 MCC 显着增加。另一方面，Col2a1 表达与对照没有太大差异。
髁突和负载小鼠软骨下区域的 TRAP 活性增加，亚增殖也增加。EDU 染色表示增殖细胞的数量。通过评估甲苯胺蓝染色区域和距离图来量化 MCC 中的蛋白多糖分布。
加载组髁突 MCC 中的距离映射显着增加。然而，组间蛋白多糖染色面积无统计学差异。看完这个视频，你应该对如何分析啮齿动物下颌髁的细胞和结构变化有了很好的了解。
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概述
本文献介绍了分析啮齿动物下颌骨髁突的形态计量和细胞变化的方法。该研究聚焦于压力负荷对小鼠下颌骨髁突软骨的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 骨科
背景
- 了解下颌骨的结构和细胞变化对于各种生物学研究至关重要。
- 压力负荷可能影响软骨的健康和发育。
- 啮齿动物由于其与人类解剖学上的相似性，成为研究这些变化的模型。
- 放射图像和组织学分析对于评估这些变化至关重要。
研究目的
- 观察压力负荷对下颌骨髁突软骨的影响。
- 利用形态计量测量评估结构变化。
- 提供可应用于其他小型动物的协议。
使用的方法
- 小鼠下颌骨的分离和解剖。
- 下颌骨转移到X光柜系统。
- 在26千伏下进行五秒的放射图像拍摄。
- 组织学分析以评估细胞变化。
主要结果
- 识别下颌骨髁突的形态计量变化。
- 评估压力负荷引起的细胞改变。
- 展示所使用的成像技术的有效性。
- 方法在其他小型动物研究中的潜在应用。
结论
- 该研究为机械负荷对软骨的影响提供了宝贵的见解。
- 所开发的方法可以适用于生物学研究的更广泛应用。
- 需要进一步研究以探索压力负荷的长期影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of structural and cellular adaptations in the murine mandibular condyle under compressive loading, providing a preclinical model for mechanobiology studies relevant to temporomandibular joint disorders. By linking mechanical stimuli to molecular and histological endpoints such as Col10a1 expression, TRAP activity, and proteoglycan distribution, the approach supports target validation in cartilage homeostasis pathways. The morphometric and imaging workflow offers a scalable, reproducible platform for de-risking therapeutic hypotheses in jaw development and osteoarthritic conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mechanotransduction pathways in mandibular condylar cartilage through quantification of collagen expression and cellular proliferation.
- Operational Value: Provides standardized morphometric and histological readouts to validate target engagement in cartilage remodeling processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative outputs including pixel-based fluorescence intensity and distance mapping for reproducible assessment of extracellular matrix changes.
- Operational Value: Uses accessible imaging tools (Digimizer, fluorescence microscopy) to establish standardized assays for collagen and proteoglycan analysis in small bone models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling of TMJ loading conditions to evaluate cartilage degradation and repair mechanisms.
- Operational Value: Facilitates longitudinal assessment of structural adaptation and cellular response in murine models, enabling preclinical continuity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by providing early-phase structural and phenotypic data that inform target selection and mechanistic de-risking in joint tissue biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on mechanical regulation of chondrocyte differentiation and matrix production via quantifiable morphometric and molecular endpoints.
- Screening: Enables assay readiness through standardized radiographic and histological quantification of condyle dimensions and molecular markers.
- Analytics: Delivers quantitative measurements including condyle length, width, Col10a1-positive pixel fraction, TRAP activity, and EDU-positive cell counts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects mechanical loading to histological outcomes in endochondral ossification regions, supporting preclinical validity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other small animal bones and ossification sites, promoting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cartilage response to load by correlating structural changes with molecular markers of hypertrophy and remodeling.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized imaging protocols and software-based quantification across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing objective, multi-parametric data on tissue adaptation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanobiology targets based on quantitative phenotypic outcomes in validated preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent dissection, radiographic imaging, and histological sectioning.
- Dependent on access to X-ray imaging systems, fluorescence microscopy, and image analysis software (e.g., Digimizer).
- Necessitates standardization of sample preparation, embedding, and sectioning protocols for consistent morphometric and cellular quantification.
- Adaptation to other bone sites requires validation of anatomical landmarks and region-of-interest definitions.
- Practical limitations include tissue size constraints and the need for careful handling to avoid decalcification during preparation.
