流动 Cytometry-based 药物筛选系统对促进细胞分化胶质母细胞瘤小分子的鉴定
2018年1月10日
提出了一种有效的筛选方案, 以识别小分子, 促进形分化的胶质母细胞瘤干细胞 (GSCs)。该检测是基于一个干细胞分化的记者, 即增强 GFP (eGFP) 的表达是由人胶质细胞促进剂驱动。
该程序的总体目标是筛选小分子文库，以查找促进胶质母细胞瘤干细胞中星形胶质细胞分化的药物。这种方法可以帮助回答癌症干细胞领域的关键问题，例如维持胶质母细胞瘤干细胞处于未分化状态所需的信号通路是什么。正确执行该技术可以直接识别促进胶质母细胞瘤干细胞分化的小分子。
该技术的含义延伸到 Ehlers-Danlos 胶质母细胞瘤的治疗，因为降低胶质母细胞瘤干细胞的百分比可能会降低复发的可能性。该方法也可用于使用其他报告基因构建体将分化设置为其他细胞谱系。我们的报告首次建立了一种高通量方法来筛选迫使神经胶质瘤干细胞分化的药物。
在来自患者的癌细胞中使用慢病毒颗粒可能非常危险。因此，应始终遵循处理血源性病原体的标准程序。首先，将 100 万个胶质母细胞瘤干细胞或 GSC 接种在 6 孔板中的 2 毫升完全神经干细胞生长培养基中。
接下来，用慢病毒报告基因以等于 5 的感染复数转导细胞。向细胞和病毒混合物中加入 2 微升聚凝胺，使最终浓度为每毫升 8 微克，并在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育细胞过夜。孵育后，更换生长培养基以去除未结合的病毒。
并以 360 倍 G 离心细胞 5 分钟。然后小心吸出培养基，并将细胞铺回 6 孔板中。并继续孵育细胞 24 小时。
收获 0.5 毫升总培养物体积。在室温下以 360 倍 G 离心 5 分钟来沉淀细胞。将细胞重悬于 0.5 mL 新鲜神经干细胞生长培养基中。
将板放回培养箱中，让其扩增至少 72 小时。加入 200 μL 解离试剂，在设定为 37 摄氏度的水浴中孵育 5 分钟。通过轻轻上下吹打来解离细胞。
向解离的细胞中加入 800 微升 HBSS，以确保最小的细胞附着或聚集。接下来，将 200 μL 的每种细胞悬液转移到 96 多孔板的孔中。通过流式细胞术确定表达绿色荧光蛋白的细胞百分比。
在每次采集中至少记录 10， 000 个活细胞。在所有流式细胞术分析中，使用亲本未转导的细胞或载体转导的非荧光细胞来建立基线荧光。为了选择和扩增单个亚克隆，将细胞以每孔 0.7 个细胞的密度接种在 96 孔板中的 100 μL 神经干细胞培养基中。
将这些克隆在培养物中维持 11 天。注意直径大于 100 微米的神经球。我们之前已经确定了这个临界大小，以回顾性地确定中脑球是否起源于自我更新的胶质母细胞瘤干细胞。
当使用不同的胶质母细胞瘤细胞模型时，可能需要优化此临界大小。在配备 FITC 滤光片的荧光显微镜下观察细胞，并标记包含单个神经球的孔，其中大约 1% 至 5% 的细胞为 GFP 阳性。标记后，扩增单个克隆，直到有足够数量的细胞可用于流式细胞术分析。
假设报告克隆含有 1% 至 5% 的 GFP 阳性细胞，则从每个克隆中收获 0.5 毫升以及等量的未转导对照细胞，以确定 GFP 阳性细胞的确切百分比。在室温下以 360 倍 G 沉淀细胞 5 分钟后，吸出上清液。向每个沉淀中加入 200 微升解离试剂，并在设置为 37 摄氏度的水浴中孵育试管。
孵育后，将细胞研磨约 20 至 30 次，以获得单细胞悬液。然后加入 800 μL HBSS 以确保最小的细胞附着或聚集。现在将 200 μL 的每种细胞悬液转移到 96 多孔板的孔中。
最后，进行流式细胞术，每次采集至少记录 10， 000 个活细胞。为了评估克隆形成能力，通过研磨细胞约 20 至 30 次来制备分化报告亚克隆的单细胞悬液。然后将这些细胞接种在 96 多孔板中，密度约为每孔 5 至 500 个细胞。
将这些细胞在培养物中保存 9 至 11 天。在光学显微镜下寻找神经球。包含至少一个大神经球的井被认为是阳性的。
以亲本未转导细胞和 GFP 阳性慢病毒转导细胞为对照，在 ELDA 在线界面上输入分析的总孔数和阳性细胞的数量。开始筛选时，将 5000 个细胞接种在 96 孔板中的 99 μL 完全神经干细胞生长培养基中。然后用 12 通道移液器用 2 微摩尔终浓度的稀释文库化合物或 DMSO 对照处理细胞。
将细胞孵育 72 小时。现在使用 12 通道移液器在每个孔中加入 150 μL 细胞解离试剂，并在 37 摄氏度下孵育 20 分钟。然后使用 12 通道移液器轻轻研磨每个孔中的细胞约 20 至 30 次，直到获得单细胞悬液。
现在进行流式细胞术并确定表达 GFAP：GFP 报告基因的细胞百分比。首先，从前向和侧向散射物中确定细胞大小和活力，并对活细胞群进行门控。然后确定活细胞群中的 GFP 阳性细胞。
与对照相比，GFP 阳性细胞的百分比增加三个标准差被认为是阳性命中，可以进行调整以适应用户对严格性的偏好。显示了表达低水平和高水平 GFAP：GFP 的 HSR-GBM1 GSC 亚克隆的代表性图像。通过流式细胞术为患者来源的神经球系选择 GFAP：GFP 表达阳性的亚克隆。
在这里，低 GFAP：GFP 表明克隆中不到 5% 的细胞是 GFP 阳性，而高 GFAP：GFP 表明克隆中超过 75% 的细胞是 GFP 阳性。这些结果表明，由 ELDA 确定的 GFAP 低亚克隆的体外自我更新能力高于其 GFAP 高亚克隆。因此，GH 亚克隆比 GL 亚克隆分化更多。
最后，筛选药物库以确定能够在 GSC 中诱导星形胶质细胞分化的药物。发现 12 种药物显着增加表达 GFAP：GFP 报告基因的细胞百分比。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在几周内完成。
遵循此程序，可以进行其他方法，如 alamarBlue 测定、半固体培养基中的克隆形成测定、侧腹或颅内异种图注射，以回答其他问题，例如选择性药物对体外细胞增殖和克隆形成性的影响以及体内致瘤性的影响。看完这个视频，你应该对如何鉴定能够在胶质母细胞瘤干细胞中诱导星形胶质细胞分化的化合物有一个很好的了解。
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概述
本文介绍了一种用于筛选能够促进胶质母细胞分化为星形胶质细胞的小分子的筛选方案（在胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）中）。该方法利用了一个干细胞分化报告系统，其中增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的表达由人类GFAP启动子驱动。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 癌症生物学
- 干细胞研究
背景
- 胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）对于理解胶质母细胞瘤的复发至关重要。
- 识别维持GSCs未分化状态的途径是至关重要的。
- 星形胶质细胞分化可能会减少GSCs的数量。
- 本研究介绍了一种用于筛选分化剂的高通量筛选方法。
研究目的
- 筛选小分子库以寻找能够促进GSCs分化为星形胶质细胞的剂子。
- 探索参与GSCs维持的信号通路。
- 提供一种适用于使用不同报告基因构建体的其他细胞系的方法。
使用的方法
- 小分子库的高通量筛选。
- 使用干细胞分化报告系统。
- 评估由人类GFAP启动子驱动的eGFP表达。
- 分析分化效果对胶质母细胞瘤干细胞的影响。
主要结果
- 识别出有效促进星形胶质细胞分化的小分子。
- 对GSCs维持所需的信号通路有了新的认识。
- 对于减少胶质母细胞瘤复发的潜在治疗意义。
- 建立了一种新的高通量筛选方法。
结论
- 开发的协议对于筛选促进分化的剂子是有效的。
- 研究结果可能为抗胶质母细胞瘤的治疗策略做出贡献。
- 这种方法可以适用于其他分化研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This flow cytometry-based screening system enables biopharma R&D to identify small molecules that promote differentiation of glioblastoma stem cells, addressing a key mechanism of tumor recurrence. By quantifying astroglial differentiation via GFAP:GFP reporter expression, the platform provides predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for oncology pipelines. The approach supports lead identification and portfolio triage through scalable, reproducible assays compatible with FDA-approved drug library screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking small molecule treatment to astroglial differentiation in patient-derived GSCs.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative flow cytometry readouts of GFP-positive cells.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying compounds that reduce stemness and self-renewal capacity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a high-throughput flow cytometry platform for screening compound libraries with Z'-factor compatible metrics.
- Quantitative Output: Measures percentage of GFP-positive cells as a direct readout of differentiation efficacy.
- Scalability: Compatible with 96-well format and 12-channel pipetting for screening thousands of compounds.
- Reporter Flexibility: GFAP:GFP construct can be substituted with other lineage-specific promoters for broad target validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human glioblastoma stem cell biology using patient-derived neurospheres.
- Translational Continuity: Differentiation phenotype aligns with astroglial maturation, a clinically relevant endpoint.
- Preclinical De-risking: Identifies compounds that reduce clonogenic potential, informing go/no-go decisions.
- Biomarker Alignment: GFAP expression serves as a translational biomarker for astroglial commitment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification and preceding lead optimization, enabling phenotypic screening of differentiation-inducing agents in a disease-relevant system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of signaling pathways governing GSC maintenance via small molecule perturbation.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducibility through flow cytometry gating and viability controls.
- Analytics: Enables quantitative comparison of compound effects using GFP-positive cell percentages and statistical hit calling (3 SD over control).
- Translational Research: Connects to preclinical validation by identifying agents that reduce tumorigenic potential in stem cell-enriched populations.
- Enterprise Reuse: Platform is adaptable to other cancer stem cell models and differentiation endpoints via reporter exchange.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into differentiation pathways and reduces ambiguity in stem cell-targeted mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized transduction, selection, and flow cytometry protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by prioritizing compounds with differentiation activity over cytotoxic effects alone.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying differentiation inducers that may synergize with standard-of-care therapies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral transduction, flow cytometry, and neural stem cell culture.
- Dependent on flow cytometer with FITC detection and 96-well plate automation compatibility.
- Necessitates standardization of reporter validation and clonogenic assays across cell lines.
- Adaptation to other models may require optimization of neurosphere size cutoffs and differentiation thresholds.
- Practical limitations include variability in primary GSC cultures and need for careful viability gating.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:17
Generation of Lentiviral Transcriptional Reporter Cell Lines
3:47
Subclone Selection, Expansion, and Validation
4:47
Determination of GFAP:GFP Expression by Flow Cytometry
5:58
ELDA Self-renewal Assay to Assess Clonogenic Capacity
7:01
Drug Screen
8:27
Results: Selection and Drug Screening of Glioblastoma Stem Cell Subclones
9:46
Conclusion
