Name: 流动 Cytometry-based 药物筛选系统对促进细胞分化胶质母细胞瘤小分子的鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 了解基于流式细胞术的高通量筛选方法，用于鉴定促进胶质母细胞瘤干细胞星形胶质细胞分化的小分子化合物。该技术利用GFAP启动子驱动的GFP报告系统，为癌症干细胞研究和胶质母细胞瘤治疗策略开发提供重要工具。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）R01CA187780 项目的支持。

注意：星形胶质细胞和神经元慢病毒报告系统购自预包装的浓缩型慢病毒制剂。操作者需具备流式细胞术的基本知识。此外，为完整实施本方案，使用者需要能够使用具有高通量检测能力的流式细胞仪（可接受96孔板作为样品来源）。
1. 慢病毒转录报告系统
注意：在所有流式细胞术分析中，应使用亲本未转导细胞或载体转导（非荧光）细胞来确定基础荧光水平。此外，在所有需要机械吹打的步骤中，请务必轻柔操作。剧烈吹打可能导致大量脆弱的胶质瘤干细胞（GSCs）死亡，从而影响流式细胞术结果。
<ol>
	<li>在6孔板中，每孔加入2 mL完全神经干细胞培养基，接种1×106个细胞。</li>
	<li>以感染复数（moi）为5的慢病毒报告载体转导细胞。</li>
	<li>加入2 µL聚凝胺，使终浓度为8 µg/mL。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。</li>
	<li>次日，更换培养基以去除未结合的病毒，并将培养板放回37 °C、5% CO2培养箱中继续培养24小时。</li>
	<li>收集总体积中的0.5 mL；将细胞在15 mL锥形管中以360 × g离心5分钟（室温），吸除上清液；向剩余细胞中加入0.5 mL新鲜神经干细胞培养基，放回培养箱继续扩增。</li>
	<li>加入200 µL消化试剂，于37 °C孵育5分钟。</li>
	<li>通过轻柔吹打使细胞解离。 
	注意：剧烈吹打可能导致胶质瘤干细胞（GSCs）大量死亡，通常吹打20–30次即可完成充分解离。</li>
	<li>为最大限度减少细胞贴壁或聚集，加入800 µL Hank's平衡盐溶液（HBSS），使终体积为1 mL。</li>
	<li>将每种细胞悬液200 µL转移至96孔板的各个孔中。</li>
	<li>本实验使用配备蓝色激光激发光源、可检测绿色荧光蛋白且具备96孔板检测功能的台式流式细胞仪。每次检测至少采集10,000个活细胞进行流式分析。</li>
	<li>通过流式细胞术确定GFP阳性细胞的百分比。</li>
</ol>
2. 亚克隆筛选、扩增与验证
<ol>
	<li>以每孔0.7个细胞的密度，将细胞接种于96孔板中，每孔加入100 µL神经干细胞培养基。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下培养克隆11天。此步骤高度依赖细胞类型，可能需要根据所用细胞系进行调整。一般而言，当神经球直径≥100 µm时，表明神经球中存在具有克隆形成能力的胶质瘤干细胞（GSCs）。</li>
	<li>使用配备FITC滤光片的荧光显微镜，标记含有单个神经球且其中约1–5%细胞为GFP阳性表达的孔。 
	注意：此时无需精确确定GFP阳性细胞的比例，每个亚克隆后续将通过流式细胞术进行评估。此步骤旨在减少需分析的克隆总数，重点保留来源于未分化、GFAP阴性GSC的神经球。</li>
	<li>扩增选定的报告基因克隆，直至获得足够数量的细胞用于流式细胞术分析。6孔板中一个亚融合状态的孔，细胞密度≤1.5×105 cells/mL，即可提供足够的细胞数量。 
	注意：有关胶质瘤干细胞（GSCs）的分离与扩增的详细操作流程可参见文献17。</li>
</ol>
3. 通过流式细胞术测定GFAP:GFP的表达
<ol>
	<li>从每个报告基因克隆及未转导的对照组中收集一份细胞等分试样（0.5 mL），以确定GFP阳性细胞的确切百分比。选择GFP阳性细胞比例约为1–5%的报告基因克隆。</li>
	<li>在室温下以360 × g离心5分钟，随后吸弃上清液。</li>
	<li>向每份细胞沉淀中加入200 µL细胞解离试剂，并将试管置于设定为37 °C的水浴中孵育。</li>
	<li>轻柔吹打细胞，以获得单细胞悬液（通常吹打20至30次）。</li>
	<li>为尽量减少细胞黏附或聚集，加入800 µL HBSS，使终体积达到1 mL。</li>
	<li>将每种细胞悬液各200 µL转移至96孔板的每个孔中。</li>
	<li>本步骤使用具备96孔板检测功能的台式流式细胞仪。每次检测至少采集10,000个活细胞进行流式细胞分析。</li>
</ol>
4. 用于评估克隆形成能力的ELDA自我更新检测
注意：作为对照，应使用亲本未转导细胞以及表达GFP的慢病毒转导细胞，以确定GSC分化报告细胞系相对于其原始GSC培养物的相对克隆形成潜能。
<ol>
	<li>按照上述方法将分化报告基因亚克隆消化为单细胞悬液。</li>
	<li>将细胞以每孔5至500个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100 µL完全神经干细胞生长培养基。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下培养9至11天。</li>
	<li>通过光学显微镜直接观察神经球，判断阳性孔。若某孔中至少含有一个大型神经球，则该孔应记为&#34;阳性&#34;。</li>
	<li>将分析的总孔数和阳性孔数输入ELDA在线分析工具，网址为&#160;http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html。</li>
</ol>
5. 药物文库稀释液的制备
<ol>
	<li>从-80 °C保存处取出文库板，用铝箔覆盖（保护光敏化合物），在室温下解冻约30分钟至1小时。</li>
	<li>使用12通道多通道移液器将文库化合物在完全神经干细胞培养基中稀释至0.2 mM。在生长培养基中将DMSO稀释至10% 
	注意：加入细胞时，DMSO的终浓度应为0.1%。培养体系中DMSO浓度过高可能导致细胞毒性。因此，建议在处理前先测试所用细胞系对DMSO的敏感性。</li>
	<li>使用DMSO作为溶剂对照，处理每块板左右两侧的细胞（第1列和第12列；A至H孔）。</li>
	<li>用铝箔覆盖已稀释的文库板，并将原始文库板放回-80 °C冰箱中长期保存。</li>
</ol>
6. 药物筛选
注意：应使用DMSO处理的细胞来设定基础荧光水平并调整门控。
<ol>
	<li>在96孔板中，每孔加入99 µL完全神经干细胞培养基，接种5×103个细胞。</li>
	<li>使用12通道多通道移液器，向各孔加入稀释后的文库化合物，终浓度为2 µM（将1 µL的0.2 mM药物加入99 µL细胞悬液中），或加入DMSO（对照组）。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育72小时。</li>
	<li>使用12通道多通道移液器，向每孔加入150 µL细胞解离试剂，于37 °C孵育20分钟。</li>
	<li>用12通道多通道移液器轻柔吹打，直至形成单细胞悬液（通常吹打20至30次）。完全解离神经球所需时间因不同GSC细胞系而异。尽管推荐使用的细胞解离试剂（见材料部分）安全性良好，且在多个测试的GSC细胞系中，孵育长达45分钟对细胞活力无影响，但仍需针对拟用于筛选的每个GSC细胞系进行验证。 
	注：每孔最终体积应约为250 µL（100 µL细胞悬液 + 150 µL细胞解离试剂）。</li>
	<li>通过流式细胞术测定表达GFAP:GFP报告基因的细胞百分比。采用标准设门策略：首先绘制前向散射光和侧向散射光图，初步评估细胞大小和活力；然后对活的单细胞群体设门，该群体用于检测绿色荧光（eGFP）信号。任何使GFP阳性细胞比例较对照组（DMSO处理组）增加超过三个标准差的化合物，均被视为阳性&#34;命中"。该阈值应根据具体应用和所需的严格程度进行调整。 
	注：进行高通量筛选时，建议使用单一GSC报告基因亚克隆。在获得“命中”结果后，应对每个“命中”化合物在来自同一GSC细胞系的其他报告基因亚克隆中进行验证。为进一步提高真实“命中”的可信度，还建议在来自不同GSC神经球细胞系的报告基因亚克隆中测试这些化合物。</li>
</ol>

<ol><li>Maher, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+glioma%3A+genetics+and+biology+of+a+grave+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter.</a> Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).</li>
<li>Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+maintenance+in+glioblastoma%3A+a+social+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network.</a> Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li>
<li>Sul, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+gliomas%3A+new+translational+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Malignant gliomas: new translational therapies.</a> Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).</li>
<li>Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+promotes+medulloblastoma+survival+via+Bc%2FII%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II.</a> Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).</li>
<li>Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+inhibition+of+glioblastoma+xenograft+initiation+and+clonogenic+growth+following+in+vivo+Notch+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade.</a> Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).</li>
<li>Schreck, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+target+Hes1+directly+modulates+Gli1+expression+and+Hedgehog+signaling%3A+a+potential+mechanism+of+therapeutic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance.</a> Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).</li>
<li>Warrell, R. P. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+therapy+of+acute+promyelocytic+leukemia+with+tretinoin+%28all-trans-retinoic+acid%29%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid).</a> N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).</li>
<li>Piccirillo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+inhibit+the+tumorigenic+potential+of+human+brain+tumour-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells.</a> Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).</li>
<li>Bar, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopamine-mediated+hedgehog+pathway+inhibition+depletes+stem-like+cancer+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma.</a> Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).</li>
<li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li>
<li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2FCD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).</li>
<li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+monocarboxylate+transporter-4+depletes+stem-like+glioblastoma+cells+and+inhibits+HIF+transcriptional+response+in+a+lactate-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner.</a> Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).</li>
<li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEB1+Promotes+Invasion+in+Human+Fetal+Neural+Stem+Cells+and+Hypoxic+Glioma+Neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres.</a> Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).</li>
<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELDA%3A+extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).</li>
<li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).</li>
<li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).</li>
<li>Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atracurium+Besylate+and+other+neuromuscular+blocking+agents+promote+astroglial+differentiation+and+deplete+glioblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells.</a> Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管以往大多数关于GSC的研究主要关注定义这些细胞的标志物，但本研究中我们采用了相反的策略。我们主要关注GSC产生的分化后代（例如表达星形胶质细胞和神经元标志物的细胞）。在此，我们展示了基于人源GFAP启动子驱动GFP表达的细胞水平高通量药物筛选系统的应用。所有实验均采用患者来源的神经球型胶质母细胞瘤细胞系进行。有关这些细胞系分离与扩增的详细实验方案见Galli et al17。
该系统不仅帮助我们鉴定了能够诱导胶质瘤干细胞（GSCs）发生细胞分化的活性小分子，还通过比较GSC频率，明确证实了星形胶质细胞分化标志物GFAP的表达决定了单个胶质母细胞瘤（GBM）细胞的克隆形成能力。ELDA检测法由Yifang Hu和Gordon K. Smyth开发。建议读者阅读相关论文，以深入理解该检测方法的优势与局限性15。集落形成评分步骤高度依赖于细胞类型，可能需要根据所使用的细胞系进行相应调整。此外，通常情况下，我们以神经球直径≥100 µm作为判断其起源于具有克隆形成能力的GS...

近期研究表明，肿瘤中含有少量细胞，称为癌症干细胞（CSCs）或肿瘤起始细胞，这些细胞负责肿瘤的进展、转移以及对化疗和放疗的耐药性1,2。肿瘤内癌症干细胞及其更分化的子代细胞的存在被认为是促进肿瘤内异质性的重要因素，因此构成了癌症治疗中的主要障碍3。由癌症干细胞理论提出的肿瘤细胞层级结构，推动了新型癌症治疗策略的发展4。靶向癌症干细胞的一种方法是识别并抑制在受累器官胚胎发育过程中必需的信号通路。事实上，我们及其他研究者此前已发表多篇论文，描述了Sonic Hedgehog和Notch等与神经干细胞相关的信号通路在胶质母细胞瘤中持续发挥作用5,6,7。这些研究为多项胶质母细胞瘤（GBM）临床试验提供了理论依据。靶向癌症干细胞的第二种方法是促进其分化。该策略因使用维甲酸（ATRA，一种维生素A类似物）治疗急性早幼粒细胞白血病的临床前和临床研究取得良好效果而获得广泛支持。在此治疗中，ATRA被发现可解除成熟阻滞，促进癌细胞分化8。最近，Piccirillo及其同事精巧地证明，BMP-4可在体外和体内促进胶质瘤干细胞（GSC）向星形胶质细胞分化，并产生显著的抗GBM效应in vitro和in vivo9。
本研究的立论依据基于以下几点 &#34;逆向工程&#34; 靶向GSCs的一种策略。鉴于胶质母细胞瘤（GBM）具有高度异质性，且分化不良是癌症的重要特征之一，我们提出是否可促进更理想的表型，即向类似星形胶质细胞的状态分化。在此过程中，我们并不预先了解维持特定肿瘤样本中GSCs状态的信号通路，而是旨在实现特定表型（例如GFAP阳性）。
本报告描述了从富集胶质瘤干细胞（GSC）的培养物转导到GSC单克隆筛选，建立GSC分化报告细胞系的实验流程。所用的胶质母细胞瘤神经球细胞系由意大利米兰圣拉法埃莱医院（Hospital San Raffaele）确诊为原发性胶质母细胞瘤患者的样本建立，该工作由Angelo Vescovi教授实验室完成。这些细胞系已在多项研究中被广泛报道。 6,10,11,12,13,14强烈建议有意在其实验室中应用这些技术的研究人员，确定该报告基因在其拟研究细胞中与肿瘤干细胞自我更新能力的相关性（此原则适用于任何报告基因）。以下是其中一项的详细方案 体外 领域内公认的克隆形成实验方法被用于完成此项工作15,16最后，本文末尾提供了一个详细的实验方案，描述了如何利用分化报告细胞系进行基于流式细胞术的药物筛选。值得注意的是，类似于本文所述的星形胶质细胞分化系统，我们已成功建立并验证了整合了 MAP2:GFP（神经元分化）报告系统的胶质瘤干细胞（GSC）报告细胞系。因此，本文所描述的方法可用于研究细胞向多种细胞谱系的分化过程。
本报告中的部分图示可在近期发表的一篇文章中找到：&#34;阿曲库铵苯磺酸盐及其他神经肌肉阻滞剂可促进星形胶质细胞分化并耗竭胶质母细胞瘤干细胞18。

<table><tbody><tr><td>ESGRO 完全型 Accutase</td><td>EMD Millipore</td><td>SF006</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（Hank's 平衡盐溶液）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>人 GFAP 分化报告基因（pGreenZeo，病毒）</td><td>SBI (System Biosciences)</td><td>SR10015VA-1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 无菌一次性试剂储液槽</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Biolite T25 cm&amp;sup2; 透气培养瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130189</td><td></td></tr><tr><td>Biolite T75 cm&amp;sup2; 透气培养瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Ovation 多通道移液器，12 通道，0.5 - 20 µL</td><td>VistaLab Technologies</td><td>1060-0020</td><td></td></tr><tr><td>Ovation 多通道移液器，12 通道，5-250 µL</td><td>VistaLab Technologies</td><td>1060-0250</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12 通道移液器吸头 25 &amp;mu;l</td><td>VistaLab Technologies</td><td>4060-1002</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12 通道移液器吸头 250 &amp;mu;l</td><td>VistaLab Technologies</td><td>4060-9025</td><td></td></tr><tr><td>Guava easyCyte 5HT 台式流式细胞仪</td><td>EMD Millipore</td><td>0500-4005</td><td></td></tr><tr><td>NIH 临床化合物库 1 和 2 小分子文库</td><td>Evotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;神经干细胞培养基的配制（500 mL）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;终浓度&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>GoldBio.com</td><td>A-421-250</td><td>0.20%</td></tr><tr><td>DMEM/F12 10X</td><td>Corning</td><td>90-091-PB</td><td>1X</td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>0.0002%</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4036</td><td>5.4 mM</td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）（100X）</td><td>Life Technologies</td><td>41400-045</td><td>1X</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td>14.5 mM</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）100X</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>1X</td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td>16 nM</td></tr><tr><td>腐胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5780</td><td>4.8 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（FGF2），人源</td><td>GoldBio</td><td>1140-02-50</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF），人源</td><td>GoldBio</td><td>1150-04-100</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>瓶顶滤器，150 ml，33 mm，0.22 µm，聚醚砜，无菌独立包装</td><td>Corning</td><td>431160</td><td>用于过滤除菌培养基</td></tr></tbody></table>

基于流式细胞术的药物筛选系统用于鉴定促进胶质母细胞瘤干细胞分化的小分子

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且致死率最高的原发性脑肿瘤，仅在美国每年就导致约14,000人死亡。即使在最大程度的手术切除、放疗和替莫唑胺化疗后，确诊后的中位生存期仍不足15个月。开发更有效GBM治疗方法所面临的挑战日益凸显，包括其顽固的侵袭性、对标准治疗的耐药性、遗传复杂性和分子可塑性，以及存在一群在表型上与正常干细胞相似的GBM细胞亚群，本文中称之为胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）。由于GSCs是肿瘤生长和进展所必需的，基于分化的疗法为这些无法治愈的肿瘤提供了一种可行的治疗策略。
以下方案描述了一套用于建立高通量筛选平台的流程，旨在鉴定能够促进胶质瘤干细胞（GSC）向星形胶质细胞分化的 小分子化合物。该系统的核心是一种胶质纤维酸性蛋白（GFAP）分化报告基因构建体。本方案包含以下主要步骤：（1）建立GSC分化报告细胞系；（2）检测并验证该报告系统与GSC自我更新能力/克隆形成能力的相关性；（3）基于高通量流式细胞术的药物筛选。
该筛选平台提供了一种简单且经济的方法，用于鉴定可促进胶质瘤干细胞（GSCs）分化的 小分子化合物。此外，利用经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物文库，有望快速发现可用于新适应症的药物。同时，促进肿瘤干细胞分化的疗法预计可与当前的“标准治疗”方案产生协同作用，后者已被证实主要靶向并清除分化程度较高的肿瘤细胞。

将三个独立的患者来源的神经球细胞系用慢病毒星形胶质细胞报告系统转导，该病毒编码与Zeocin抗性盒同框融合的绿色荧光蛋白（GFP），并由人GFAP启动子元件驱动（图1）。随后，通过在96孔板中以每孔0.7个细胞的密度接种来分离单个克隆（图2），接着通过流式细胞术测定表达GFP的细胞百分比（图3）。由单细胞衍生的神经球克隆中，GFP阳性细胞比例≤5%的被称为GL（GFAP低表达），而GFP阳性细胞比例≥75%的被称为GH（GFAP高表达），后者相较于GL亚克隆被认为具有更高的分化程度（图4）。
为了鉴定可能调控胶质瘤干细胞（GSCs）中星形胶质细胞分化的药物及信号通路，我们使用两套NIH临床化合物库进行了小分子药物筛选...

本文介绍了一种高效筛选方案，用于鉴定可促进胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）向星形胶质细胞分化的 小分子化合物。该检测方法基于一种干细胞分化报告系统，其中增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的表达由人源GFAP启动子驱动。

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且致死率最高的原发性脑肿瘤，仅在美国每年就导致约14,000人死亡。中位……

本实验的总体目标是筛选小分子文库，以寻找能够促进胶质母细胞瘤干细胞向星形胶质细胞分化的化合物。该方法有助于回答癌症干细胞领域中的关键科学问题，例如：维持胶质母细胞瘤干细胞处于未分化状态所必需的信号通路有哪些。正确实施该技术可简便地鉴定出能够促进胶质母细胞瘤干细胞分化的活性小分子。该技术的应用意义在于为埃勒斯-当洛斯胶质母细胞瘤的治疗提供新思路，因为降低胶质母细胞瘤干细胞的比例可能减少肿瘤复发的可能性。该方法还可通过使用其他报告基因构建体，应用于诱导向其他细胞谱系分化的研究。本研究首次建立了一种高通量筛选方法，用于发现能够促使胶质瘤干细胞分化的化合物。操作源自患者的癌细胞中的慢病毒颗粒可能具有极高的危险性。因此，必须始终遵循处理血液传播病原体的标准操作规程。首先，在六孔板中，将一百万个胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）接种于两毫升完全神经干细胞生长培养基中。接下来，用慢病毒报告系统以感染复数为5的条件转导细胞。向细胞与病毒的混合物中加入2微升聚凝胺，使终浓度为8微克/毫升，并将细胞在37摄氏度、5%CO2条件下孵育过夜。孵育结束后，更换培养基以去除未结合的病毒。以360 × g离心细胞5分钟。然后小心吸除培养基，将细胞重新接种至六孔板中，继续培养24小时。取总培养体积的 0.5 毫升。在室温下以 360 ×g 离心 5 分钟，沉淀细胞。将细胞重悬于 0.5 毫升新鲜神经干细胞生长培养基中。将培养板放回培养箱中，继续培养至少72小时以促进细胞扩增。加入200微升解离试剂，于37摄氏度水浴中孵育5分钟。轻轻吹打细胞，使其解离。向离散的细胞中加入 800 微升 HBSS，以确保细胞贴壁或聚集最少。接着，将每种细胞悬液各 200 微升转移至 96 孔板的孔中。通过流式细胞术测定表达绿色荧光蛋白的细胞百分比。每次检测至少记录 10,000 个活细胞。在所有流式细胞术分析中，使用亲本非转导细胞或转导空载体但无荧光的细胞来确定背景荧光水平。为筛选并扩增单个亚克隆，将细胞以每孔 0.7 个细胞的密度接种于 96 孔板中，每孔含 100 µL 神经干细胞培养基。将这些克隆在培养条件下维持 11 天。观察直径大于 100 微米的神经球。我们此前已确定该尺寸阈值，用于回溯判断神经球是否起源于具有自我更新能力的胶质母细胞瘤干细胞。在使用不同的胶质母细胞瘤细胞模型时，该截断尺寸可能需要优化。在配备FITC滤光片的荧光显微镜下观察细胞，并标记含有单个神经球的孔，其中约1%至5%的细胞呈GFP阳性。标记后，扩增单个克隆，直至获得足够数量的细胞用于流式细胞术分析。假设报告基因克隆中含有1%至5%的GFP阳性细胞，从每个克隆中收集0.5毫升细胞，并同时收集等量的未转导对照细胞，以确定GFP阳性细胞的确切百分比。在室温下以360 × g离心5分钟使细胞沉淀后，吸除上清液。向每个沉淀物中加入200 µL解离试剂，并将试管置于37 °C水浴中孵育。孵育后，将细胞吹打约20至30次，以获得单细胞悬液。然后加入800 µL的HBSS，以确保细胞粘附或聚集最少。现在将每种细胞悬液各200 µL转移至96孔板的孔中。最后，进行流式细胞术检测，每份样本至少采集10,000个活细胞。为评估克隆形成能力，通过反复吹打20至30次制备分化报告基因亚克隆的单细胞悬液。随后将这些细胞以每孔约5至500个细胞的密度，接种于96孔板中，每孔加入100 µL完全神经干细胞生长培养基。将这些细胞在培养条件下维持 9 至 11 天。在光学显微镜下观察神经球的形成。若孔中含有至少一个单独的大型神经球，则视为阳性。将亲代未转导细胞和GFP阳性慢病毒转导细胞作为对照，输入ELDA在线界面中分析的总孔数及阳性细胞数量。开始筛选时，在96孔板中每孔接种5000个细胞，加入99微升完全神经干细胞生长培养基。随后使用12通道移液器，向各孔加入稀释后的文库化合物，使终浓度为2微摩尔，或加入DMSO对照。将细胞孵育72小时。现在使用12通道移液器向每孔加入150 µL细胞解离试剂，37°C孵育20分钟。然后使用12通道移液器在每孔中轻柔吹打细胞约20至30次，直至形成单细胞悬液。现在进行流式细胞术，测定表达 GFAP:GFP 报告基因的细胞百分比。首先根据前向散射和侧向散射确定细胞大小和活性，并圈定活细胞群体。然后在活细胞群体中确定 GFP 阳性细胞的比例。GFP阳性细胞比例较对照组增加三个标准差被视为阳性结果，该阈值可根据用户对严格程度的偏好进行调整。图中显示了HSR-GBM1 GSC亚克隆中GFAP:GFP低表达和高表达的代表性图像。通过流式细胞术对患者来源的神经球细胞系筛选出GFAP:GFP表达阳性的亚克隆。此处，GFAP:GFP 低表达表示克隆中少于 5% 的细胞为 GFP 阳性，而 GFAP:GFP 高表达表示克隆中超过 75% 的细胞为 GFP 阳性。这些结果表明，通过极限稀释分析（ELDA）测定，GFAP 低表达亚克隆的体外自我更新能力高于 GFAP 高表达亚克隆。因此，GH 亚克隆比 GL 亚克隆更具分化特征。最后，通过筛选药物文库，以鉴定能够诱导GSCs发生星形胶质细胞分化的化合物。共发现12种药物可显著提高表达GFAP:GFP报告基因的细胞比例。一旦掌握该技术，若操作得当，可在数周内完成。在完成此操作步骤后，可进一步采用其他方法，如刃天青还原法（alamarBlue assay）、半固体培养基中的集落形成实验（clonogenic assay）、皮下移植或颅内异种移植接种，以回答更多科学问题，例如特异性药物对细胞增殖和体外集落形成能力的影响，以及对体内成瘤能力的作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何鉴定可诱导胶质母细胞瘤干细胞向星形胶质细胞分化的化合物。

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流动 Cytometry-based 药物筛选系统对促进细胞分化胶质母细胞瘤小分子的鉴定

本视频方案演示了如何应用荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）根据细胞分裂频率来鉴定和分离人胶质母细胞瘤中的不同细胞亚群。...

利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）鉴定和分离人胶质母细胞瘤中的慢分裂细胞

本视频展示了一种生成胶质母细胞瘤干细胞报告细胞系的技术，用于鉴定胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）向星形胶质细胞的分化。该方法概述了接种GSCs、用编码GFP的慢病毒转导GSCs，以及通过流式细胞术检测GFP报告基因表达的各个实验步骤。...

一种慢病毒转录报告系统用于建立胶质母细胞瘤干细胞分化报告细胞系

采用无血清神经球培养基对分离的高级别胶质瘤手术标本进行传代培养，以富集具有肿瘤干细胞表型的细胞。对于无法形成神经球的标本，提供了一种替代性实验方案。同时介绍了保持神经球三维结构的石蜡包埋技术，用于免疫细胞化学分析。...

优化高级别胶质瘤手术标本的细胞培养，用于临床相关动物模型及三维免疫化学分析

确定能够从临床前测试顺利过渡到人体试验的新药物靶点是当前科学研究的重点。为此，本文介绍了一种功能基因组学方法，用于研究基因耗竭对癌细胞系球状体的影响，该模型能更真实地模拟人类癌症 体内.

利用功能基因组筛选鉴定肿瘤细胞球状培养物中潜在的新型药物靶点

本研究介绍了一种基于荧光的新方法，该方法使用来自转基因小鼠的淋巴细胞。该方法适用于对具有抑制或促进淋巴细胞活化能力的小分子进行高通量筛选（HTS）。...

一种基于荧光的淋巴细胞检测方法，适用于小分子高通量筛选

本文介绍了活细胞成像技术，用于在不同处理条件下，随时间定量测量胶质母细胞瘤脑肿瘤干细胞的迁移和侵袭能力。...

活细胞成像实验用于研究胶质母细胞瘤脑肿瘤干细胞的迁移与侵袭

本方案描述了患者来源类球体的生成及后续分析，包括增殖定量、细胞毒性检测、流式细胞术、免疫荧光染色和共聚焦成像，以评估候选药物作为抗肿瘤治疗剂的潜力。该方案有助于精准医疗，可为每位患者及疾病阶段确定特定药物。...

用于靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤药物筛选的生理性患者来源三维球体

胶质瘤干细胞（GSCs）是一类在胶质母细胞瘤（GBM）中起肿瘤起始、血管生成及药物抵抗等关键作用的少量癌细胞，而GBM是最常见且最具破坏性的原发性脑肿瘤。由于GSCs的存在，GBM对大多数单一靶向治疗药物表现出高度耐药性，因此需要高通量筛选方法来鉴定潜在的有效联合治疗方案。本实验方案描述了一种简便的工作流程，可用于快速筛选具有协同作用的潜在联合疗法。该工作流程主要包括建立荧光素酶标记的GSCs、制备基质胶包被的培养板、联合药物筛选、数据分析及结果验证等步骤。...

一种利用患者来源的胶质瘤干细胞快速筛选胶质母细胞瘤潜在联合疗法的工作流程

本研究建立了一个代谢谱分析平台，该平台整合了三维（3D）胶质瘤类球体与基于细胞外通量分析的成像标准化方法。该方法可更准确地评估肿瘤对药物治疗的代谢反应，并有助于揭示潜在的耐药机制。...

三维脑肿瘤类球体药物筛选中的代谢谱分析进展

我们介绍一种利用新诊断和复发性肿瘤患者来源的磁性胶质瘤球体构建的三维胶质母细胞瘤迁移模型。该平台可实现对患者特异性迁移动态的可视化，并可用于评估治疗效果。在迁移完成后，该检测方法还可进行多重分析，以评估蛋白质的定位和表达模式。...

可重复的缺氧条件下磁性纳米颗粒介导类球体定位的三维胶质母细胞瘤迁移实验

了解基于流式细胞术的高通量筛选方法，用于鉴定促进胶质母细胞瘤干细胞星形胶质细胞分化的小分子化合物。该技术利用GFAP启动子驱动的GFP报告系统，为癌症干细胞研究和胶质母细胞瘤治疗策略开发提供重要工具。

基于流式细胞术的药物筛选系统用于鉴定促进胶质母细胞瘤干细胞分化的小分子

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