全贴装荧光原位杂交和免疫荧光法在斑马鱼中 Multiciliated 细胞的可视化

该协议的总体目标是原位标记和可视化斑马鱼的多纤毛细胞。这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，例如哪些因素调节胚胎斑马鱼肾脏中的多纤毛硫酸盐？该技术的主要优点是蛋白质和 RNA 转录本可以同时标记，这在缺乏斑马鱼特异性抗体的情况下很有用。

当我们在对胚胎进行更改后分析纤毛的存在时，在原肾中标记多纤毛细胞时，我们第一次想到了这种方法。首先在受精后 24 小时将斑马鱼胚胎固定在 5 毫升 4% 多聚甲醛中，在室温下放置 2 到 4 小时，不要搅拌。接下来，在含有 0.1% Tween 20 或 PBST 的 PBS 中洗涤胚胎两次，然后用 5 毫升 100% 甲醇洗涤一次。

然后，将胚胎在 5 毫升新鲜的 100% 乙醇中在零下 20 摄氏度下孵育至少 20 分钟。为了准备胚胎进行杂交，将新生儿在 5 毫升 50% 甲醇和 PBST 中再水化 5 分钟，然后在 5 毫升 30% 甲醇和 PBST 中再水化 5 分钟。在 5 毫升 PBST 中洗涤胚胎 2 次，每次 5 分钟，然后将胚胎在 5 毫升 1 比 1、000 蛋白酶 K 和 PBST 溶液中孵育 2 分钟，然后立即在 5 毫升 PBST 中再洗涤两次。

在室温下将胚胎在 5 毫升 4% 多聚甲醛中固定至少 20 分钟，然后在 5 毫升 PBST 20 中洗涤两次。为了促进胚胎和杂交溶液之间的相互作用，将胚胎转移到微量离心架中的直立式平底微量离心管中的 5 毫升 PBST 中，并在 1.5 毫升杂交溶液中洗涤胚胎两次，每次 5 分钟。第二次洗涤后，将胚胎在 70 摄氏度的 1.5 毫升新鲜杂交溶液中在杂交炉中孵育 4 到 6 小时。

然后，用 10 微升目标 RNA 探针和 500 微升杂交溶液替换杂交溶液，以便在 70 摄氏度下进行过夜探针杂交。第二天早上，在 70 摄氏度下，用 1.5 毫升 50% 甲酰胺和 2X 盐水-柠檬酸钠缓冲液或 SSC 洗涤胚胎两次，每次洗涤 20 至 30 分钟。然后，在 70 摄氏度下单独用 1.5 毫升 2X SSC 洗涤胚胎一次，持续 15 分钟，然后在 70 摄氏度下用 1.5 毫升 0.2X SSC 洗涤两次，每次洗涤 20 至 30 分钟。

第二次洗涤后，用 1.5 mL 封闭试剂替换 0.2X SSC，在 4 °C 下孵育过夜。第二天早上，用 0.2 毫升辣根过氧化物酶中的抗地高辛和封闭试剂以 1：1， 000 的比例替换封闭试剂，在室温避光孵育 3 小时。然后，在 1.5 毫升苹果酸缓冲液中洗涤胚胎 2 至 4 次，每次洗涤 10 至 15 分钟，然后在 4 摄氏度下在 1.5 毫升新鲜苹果酸缓冲液中孵育过夜。

第二天早上，用 1.5 mL PBS 替换苹果酸缓冲液，并在 1.5 mL PBS 中洗涤胚胎两次，每次洗涤 5 分钟。将胚胎在 0.2 mL Si3 荧光静置液中孵育 60 分钟，然后在 1.5 mL 递增的甲醇浓度中连续洗涤四次，每次 10 分钟。最后一次孵育后，将胚胎在室温下在 1.5 毫升 1% 过氧化氢和甲醇中孵育 30 分钟。

然后，在 1.5 mL 降序甲醇溶液中洗涤胚胎 10 分钟，然后在 1.5 mL PBS 中洗涤两次，每次 5 分钟。接下来，在 1.5 毫升双蒸水中洗涤胚胎 5 分钟，然后在 1.5 毫升零下 20 摄氏度的丙酮中洗涤 7 分钟。在另外 1.5 毫升双蒸水中洗涤胚胎 5 分钟，然后在 1.5 毫升含 1% DMSO 或 PBDT 的 PBST 中洗涤 5 分钟。

将胚胎在室温下放入 1.5 毫升 PBDT 和 10% FBS 的摇杆上孵育 2 小时。然后，用 1.5 毫升一抗替换 PBDT 和 FBS，在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天早上，在 1.5 毫升 PBDT、FBS 和 0.1 摩尔氯化钠中摇动洗涤胚胎 1 分钟，然后在 1.5 毫升 PBDT、FBS 和氯化钠中摇动洗涤 5 次，每次 30 分钟。

最后一次洗涤后，在 1.5 毫升 PBDT 和 FBS 中洗涤胚胎一次，仅摇动 30 分钟，然后在 4 摄氏度下在 200 微升适当的二抗中避光孵育过夜。第二天早上，在 1.5 mL PBDT 中快速洗涤胚胎两次，然后在摇床上用 1.5 mL DAPI 孵育 15 分钟。然后，在 1.5 毫升含 FBS 和氯化钠的 PBDT 中洗涤胚胎 3 次，每次洗涤 15 至 20 分钟，并将胚胎储存在 4 摄氏度的 1.5 毫升 PBDT 中，避免环境光照射。

为了对斑马鱼肾脏进行成像，将胚胎侧放在载玻片上，放入大约 10 微升的 PBDT 中。使用一把细镊子和解剖显微镜，将第一个胚胎挤压到眼睛后面，以去除头部和一些蛋黄球。然后，轻轻地从胚胎体上刮掉剩余的蛋黄球。

取出卵黄球时，注意不要触摸卵黄囊延伸部分，因为感兴趣的组织很容易撕裂，并且位于延伸部分的正上方。使用薄纸巾去除载玻片上解离的蛋黄和多余的液体。然后，在剩余的尾部加入一滴封固剂，并将尾部横向定位。

用盖玻片压平尾部，然后将载玻片放入有盖的载玻片盒中。然后，使用共聚焦显微镜上的 60X 物镜在适当的荧光通道上对肾脏纤毛进行成像。在以下斑马鱼胚胎的代表性图像中，如刚才所示，基于用于识别 ODF3B 转录物表达的反义核糖探针、配子微管蛋白标记的基体和乙酰化 α 微管蛋白标记的纤毛，可以识别多纤毛细胞。

事实上，在胚胎原肾的这种放大倍率下，可以观察到具有 ODF3B 转录本的多纤毛细胞、多个基体和纤毛。相邻的单纤毛细胞可以通过其单基体和单纤毛表型来区分。在尝试此程序时，请务必记住使用新鲜固定的胚胎，并在添加第一抗体后保护样本免受环境光的影响。