全贴装荧光原位杂交和免疫荧光法在斑马鱼中 Multiciliated 细胞的可视化
November 18th, 2017
纤毛发育对正常器官的形成至关重要。该协议描述了一种优化的方法来标记和可视化纤毛细胞的斑马鱼。
该协议的总体目标是原位标记和可视化斑马鱼的多纤毛细胞。这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，例如哪些因素调节胚胎斑马鱼肾脏中的多纤毛硫酸盐？该技术的主要优点是蛋白质和 RNA 转录本可以同时标记，这在缺乏斑马鱼特异性抗体的情况下很有用。
当我们在对胚胎进行更改后分析纤毛的存在时，在原肾中标记多纤毛细胞时，我们第一次想到了这种方法。首先在受精后 24 小时将斑马鱼胚胎固定在 5 毫升 4% 多聚甲醛中，在室温下放置 2 到 4 小时，不要搅拌。接下来，在含有 0.1% Tween 20 或 PBST 的 PBS 中洗涤胚胎两次，然后用 5 毫升 100% 甲醇洗涤一次。
然后，将胚胎在 5 毫升新鲜的 100% 乙醇中在零下 20 摄氏度下孵育至少 20 分钟。为了准备胚胎进行杂交，将新生儿在 5 毫升 50% 甲醇和 PBST 中再水化 5 分钟，然后在 5 毫升 30% 甲醇和 PBST 中再水化 5 分钟。在 5 毫升 PBST 中洗涤胚胎 2 次，每次 5 分钟，然后将胚胎在 5 毫升 1 比 1、000 蛋白酶 K 和 PBST 溶液中孵育 2 分钟，然后立即在 5 毫升 PBST 中再洗涤两次。
在室温下将胚胎在 5 毫升 4% 多聚甲醛中固定至少 20 分钟，然后在 5 毫升 PBST 20 中洗涤两次。为了促进胚胎和杂交溶液之间的相互作用，将胚胎转移到微量离心架中的直立式平底微量离心管中的 5 毫升 PBST 中，并在 1.5 毫升杂交溶液中洗涤胚胎两次，每次 5 分钟。第二次洗涤后，将胚胎在 70 摄氏度的 1.5 毫升新鲜杂交溶液中在杂交炉中孵育 4 到 6 小时。
然后，用 10 微升目标 RNA 探针和 500 微升杂交溶液替换杂交溶液，以便在 70 摄氏度下进行过夜探针杂交。第二天早上，在 70 摄氏度下，用 1.5 毫升 50% 甲酰胺和 2X 盐水-柠檬酸钠缓冲液或 SSC 洗涤胚胎两次，每次洗涤 20 至 30 分钟。然后，在 70 摄氏度下单独用 1.5 毫升 2X SSC 洗涤胚胎一次，持续 15 分钟，然后在 70 摄氏度下用 1.5 毫升 0.2X SSC 洗涤两次，每次洗涤 20 至 30 分钟。
第二次洗涤后，用 1.5 mL 封闭试剂替换 0.2X SSC，在 4 °C 下孵育过夜。第二天早上，用 0.2 毫升辣根过氧化物酶中的抗地高辛和封闭试剂以 1：1， 000 的比例替换封闭试剂，在室温避光孵育 3 小时。然后，在 1.5 毫升苹果酸缓冲液中洗涤胚胎 2 至 4 次，每次洗涤 10 至 15 分钟，然后在 4 摄氏度下在 1.5 毫升新鲜苹果酸缓冲液中孵育过夜。
第二天早上，用 1.5 mL PBS 替换苹果酸缓冲液，并在 1.5 mL PBS 中洗涤胚胎两次，每次洗涤 5 分钟。将胚胎在 0.2 mL Si3 荧光静置液中孵育 60 分钟，然后在 1.5 mL 递增的甲醇浓度中连续洗涤四次，每次 10 分钟。最后一次孵育后，将胚胎在室温下在 1.5 毫升 1% 过氧化氢和甲醇中孵育 30 分钟。
然后，在 1.5 mL 降序甲醇溶液中洗涤胚胎 10 分钟，然后在 1.5 mL PBS 中洗涤两次，每次 5 分钟。接下来，在 1.5 毫升双蒸水中洗涤胚胎 5 分钟，然后在 1.5 毫升零下 20 摄氏度的丙酮中洗涤 7 分钟。在另外 1.5 毫升双蒸水中洗涤胚胎 5 分钟，然后在 1.5 毫升含 1% DMSO 或 PBDT 的 PBST 中洗涤 5 分钟。
将胚胎在室温下放入 1.5 毫升 PBDT 和 10% FBS 的摇杆上孵育 2 小时。然后，用 1.5 毫升一抗替换 PBDT 和 FBS，在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天早上，在 1.5 毫升 PBDT、FBS 和 0.1 摩尔氯化钠中摇动洗涤胚胎 1 分钟，然后在 1.5 毫升 PBDT、FBS 和氯化钠中摇动洗涤 5 次，每次 30 分钟。
最后一次洗涤后，在 1.5 毫升 PBDT 和 FBS 中洗涤胚胎一次，仅摇动 30 分钟，然后在 4 摄氏度下在 200 微升适当的二抗中避光孵育过夜。第二天早上，在 1.5 mL PBDT 中快速洗涤胚胎两次，然后在摇床上用 1.5 mL DAPI 孵育 15 分钟。然后，在 1.5 毫升含 FBS 和氯化钠的 PBDT 中洗涤胚胎 3 次，每次洗涤 15 至 20 分钟，并将胚胎储存在 4 摄氏度的 1.5 毫升 PBDT 中，避免环境光照射。
为了对斑马鱼肾脏进行成像，将胚胎侧放在载玻片上，放入大约 10 微升的 PBDT 中。使用一把细镊子和解剖显微镜，将第一个胚胎挤压到眼睛后面，以去除头部和一些蛋黄球。然后，轻轻地从胚胎体上刮掉剩余的蛋黄球。
取出卵黄球时，注意不要触摸卵黄囊延伸部分，因为感兴趣的组织很容易撕裂，并且位于延伸部分的正上方。使用薄纸巾去除载玻片上解离的蛋黄和多余的液体。然后，在剩余的尾部加入一滴封固剂，并将尾部横向定位。
用盖玻片压平尾部，然后将载玻片放入有盖的载玻片盒中。然后，使用共聚焦显微镜上的 60X 物镜在适当的荧光通道上对肾脏纤毛进行成像。在以下斑马鱼胚胎的代表性图像中，如刚才所示，基于用于识别 ODF3B 转录物表达的反义核糖探针、配子微管蛋白标记的基体和乙酰化 α 微管蛋白标记的纤毛，可以识别多纤毛细胞。
事实上，在胚胎原肾的这种放大倍率下，可以观察到具有 ODF3B 转录本的多纤毛细胞、多个基体和纤毛。相邻的单纤毛细胞可以通过其单基体和单纤毛表型来区分。在尝试此程序时，请务必记住使用新鲜固定的胚胎，并在添加第一抗体后保护样本免受环境光的影响。
概述
本协议概述了一种在斑马鱼中标记和可视化多纤毛细胞的方法，这对于理解纤毛发育和器官发生至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 细胞生物学
- 神经科学
背景
- 纤毛在器官发育中起着至关重要的作用。
- 理解多纤毛细胞可以为斑马鱼肾脏发育提供见解。
- 该方法允许同时标记蛋白质和RNA转录本。
- 它解决了缺乏斑马鱼特异性抗体的挑战。
研究目的
- 在胚胎斑马鱼肾脏中可视化多纤毛细胞。
- 研究调节多纤毛硫酸盐的因素。
- 增强对纤毛在器官发生中作用的理解。
使用的方法
- 用甲醛固定斑马鱼胚胎。
- 在高温下与RNA探针杂交。
- 同时标记蛋白质和RNA转录本。
- 对胚胎进行成像以评估纤毛的存在和发育。
主要结果
- 成功在体内标记多纤毛细胞。
- 证明了可同时可视化RNA和蛋白质的能力。
- 提供了对斑马鱼肾脏发育生物学的见解。
- 建立了一种可靠的方法用于未来的纤毛研究。
结论
- 该协议对于研究斑马鱼的纤毛有效。
- 它为发育生物学和器官发生的研究开辟了途径。
- 同时标记增强了对细胞机制的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in zebrafish embryos, addressing a key challenge in target validation where antibody availability is limited. By providing a method to co-localize gene expression and protein localization, it supports mechanistic de-risking in early discovery programs focused on cilia-related pathways and renal development. The approach enhances predictive confidence in phenotypic screening assays by allowing direct correlation of transcriptional regulation with functional ciliogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulators of multiciliated cell development through direct RNA-protein co-localization.
- Operational Value: Provides a workaround for target validation in models lacking species-specific antibodies, expanding usable model systems.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of lineage factors in ciliopathies by linking gene expression to cellular phenotype.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible whole-mount preparations suitable for high-resolution imaging-based screening.
- Quantitative Output: Enables measurement of transcript and protein co-expression patterns as a functional readout for compound effects on ciliogenesis.
- Scalability: Protocol uses common laboratory reagents and equipment, facilitating adaptation across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models vertebrate kidney organogenesis and ciliopathy mechanisms relevant to human renal disease.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase gene regulation findings with preclinical validation of cilia-dependent phenotypes.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target mechanism by confirming both transcriptional activation and protein localization in multiciliated cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target hypothesis validation prior to lead identification in cilia-focused programs. It enables mechanistic follow-up after phenotypic hits are identified in screening assays targeting ciliogenesis or kidney development pathways.
- Discovery Biology: Tests transcriptional regulation of ciliogenic programs by visualizing RNA transcripts alongside structural proteins like acetylated alpha-tubulin.
- Screening: Produces imaging-ready samples for automated or manual analysis of cilia number, length, and localization as phenotypic endpoints.
- Analytics: Generates co-localization data that can be quantified to assess concordance between gene expression and protein accumulation.
- Translational Research: Connects zebrafish pronephros findings to mammalian kidney ciliopathy models through conserved transcriptional regulators.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any RNA-protein co-localization event in embryonic zebrafish tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by validating both transcriptional and translational levels of gene expression in native tissue context.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized fixation, hybridization, and immunofluorescence steps compatible with multi-user core facilities.
- Strategic Value: Reduces reliance on antibody generation, lowering cost and timelines for target validation in non-traditional models.
- Portfolio Impact: Improves go/no-go decision quality by providing mechanistic evidence on target engagement in disease-relevant cell types.
Implementation Considerations
- Requires expertise in whole-mount in situ hybridization and immunofluorescence techniques.
- Dependent on access to hybridization ovens, confocal microscopes, and standard molecular biology reagents.
- Necessitates consistent embryo staging and fixation timing to ensure reproducible results across experiments.
- Requires optimization of blocking and wash conditions when adapting to different RNA probes or antibody pairs.
- Limited by tissue permeability in later developmental stages, restricting optimal use to embryonic stages up to 48 hpf.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Embryo Fixation and Hybridization
3:05
Hot Washes, Blocking, Antibody Incubation, and Maleic Acid Buffer Washes
4:27
Probe Detection, Peroxidase Removal, and Immunofluorescence
7:19
Zebrafish Pronephros Mounting and Imaging
8:23
Results: Representative Zebrafish Pronephros and Multiciliated Cell (MCC) Imaging
9:09
Conclusion
