A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

这种方法的总体目标是安装斑马鱼胚胎进行实时成像，从而使身体后部区域的正常生长。这种方法可以适用于发育中的斑马鱼其他区域的成像。该技术有助于回答发育生物学中的关键问题，例如单个细胞的行为如何导致整个组织水平的形态发生。

这种技术的主要优点是它能够使后体的自由时刻保持胚胎的正确方向。首先，将终浓度为 1.5% 的低熔点琼脂糖添加到 50 毫升试管中的 E3 培养基中，并通过在微波炉中加热溶解琼脂糖。让溶液在水浴或台式培养箱中平衡至 42 至 45 摄氏度。

根据文本协议拉出玻璃针后。用一把镊子，将针头折断，刚好超过它弯曲的点，形成一个干净锋利的针头，用于定位胚胎并去除多余的琼脂糖。在 E3 培养基中将胚胎提升到适当的阶段。

然后在双目解剖显微镜下，使用一对锋利的镊子将胚胎去绒毛膜。将去绒毛膜的胚胎在三卡因工作溶液中孵育至少 5 分钟。然后使用玻璃巴斯德移液器将具有最少 E3 的去绒毛膜胚胎直接转移到 50 毫升 45 摄氏度琼脂糖管中。

取出胚胎和大约 1 毫升的封固琼脂糖，并将大约 100 微升的培养基与胚胎转移到 35 毫米玻璃底培养皿底部的 10 毫米微孔的中心。当封固剂凝固时，将胚胎移动到琼脂糖圈的边缘，尾部朝外。使用毛细管针将胚胎尽可能横向定向，以对身体后部发育进行成像。

然后用毛细管将胚胎保持在所需的横向方向，直到凝胶完全凝固。琼脂糖滴凝固后，使用三卡因工作溶液淹没培养皿。然后，在带有透射光底座的解剖显微镜下，调整镜子位置和入射光的角度，使强对比度能够清楚地看到琼脂糖中的切口。

要进行切割，请使用毛细管针或微型手术刀以上下锯切的方式切割琼脂糖，靠近蛋黄并沿着蛋黄中途，就在形成心场的后方，沿着第五前体节，并完全穿过琼脂糖到玻璃。这里至关重要，以确保在卵黄袋上切割琼脂糖时胚胎不会受损。接下来，进行第二次和第三次切割，从胚胎开始一直到玻璃，与前五个体节相切，允许后体的背侧展开。

然后，从切口 1 和 3 的交汇处开始，向切口 3 的末端缓慢对角线切割，同时缓慢向上抬起以去除围绕后体的琼脂糖方块。用一对锋利的镊子，用培养皿壁作为支撑，从胚胎培养基中去除脱落的琼脂糖块，同时提起琼脂糖块。在样品封固之前，使用 E3 中的 1% 琼脂糖将 100 mm 塑料培养皿涂覆至 5 mm 高，并使其凝固。

然后将一毫升低熔点琼脂糖滴入培养皿的中心，并使其也凝固。将胚胎包埋在低熔点琼脂糖中，如本视频前面所示。然而，这一次，用一小滴溶液从 50 毫升琼脂糖管中取出胚胎，然后将这小滴放在培养皿中央的 1 毫升滴上。

使用毛细管针将胚胎定位在小液滴的中心，并保持其正确的方向，直到凝胶凝固。最后，使用三卡因工作溶液淹没培养皿并去除多余的琼脂糖。该动画视频显示了斑马鱼胚胎注射编码光转化荧光蛋白 kikumeGR 的 mRNA，然后安装在 15 体节阶段并进行延时想象 12 小时的示例。

后体可以自由移动，并表现出与在正常培养条件下允许脱离绒毛膜发育的胚胎类似的形态变化。在本视频中，在 16 个细胞阶段向胚胎注射编码组蛋白 2BRFP 的 mRNA（标记细胞核）和 CAAXGFP（标记细胞膜）。在带有 25 倍水浸物镜的正置多光子显微镜上从 10 体节阶段拍摄图像 3 小时，以观察尾芽形成过程中的细胞行为。

当尾芽正常形成时，可以看到细胞产生主动的突起和定向运动。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在 20 分钟内完成。在执行此程序时，重要的是要确保在琼脂糖凝胶凝固时胚胎处于横向位置。

否则，在成像过程中，感兴趣区域将迅速移出视野。看完这个视频后，你应该清楚地了解如何安装斑马鱼胚胎以实时成像后体伸长。