冷冻斑马鱼胚胎的连续免疫荧光与免疫组化学

该协议演示了一种针对早期斑马鱼围塞的连续免疫荧光和免疫组织化学的新程序，从而在特定细胞群中实现了精确的共定位分析。该协议的主要优点是它的灵活性。它结合了免疫荧光和免疫组织化学技术，使用单一冷冻，以最大限度地提高组织形态，共同定位的表达和抗体的相容性。

该协议可以应用于其他鱼类或两栖模型，因为这些研究人员经常面临类似的并发症与抗体可用性，并经常执行类似的类型的实验。处理早期胚胎冷冻切除可能比较棘手，因为它们很小，冷冻切除可能具有挑战性，但先进的准备和练习将有助于缓解这种方法中的任何困难。我们的协议中有多个步骤需要特定的处理和小心，如果不看到有人演示这些技术，就很难掌握这些步骤。

首先，将先前固定的并准备的48小时后受精的嵌合斑马鱼胚胎从15 25 OCT混合物的管子转移到塑料模具，使用钳子尽量减少混合物的任何转移。用 OCT 介质填充模具大约一半，轻轻混合其中胚胎。准备带标签的塑料模具，将所需的胚胎移植到空标签塑料模具中，最大限度地减少 OCT 介质的结转。

然后用 OCT 介质轻轻填充模具顶部的胚胎。在光学立体显微镜下进行可视化，使用针头将胚胎按所需方向排列。然后将准备好的模具放在带金属平台的绝缘容器中，并冷冻在干冰上。

将冰桶轻轻放在金属平台上，形成冷室并冷冻约 30 分钟。使用零下20摄氏度的低温恒温，将嵌入的胚胎切成10至12微米厚的冷冻体，同时定期在显微镜上检查部分的深度，以监测位置和组织。将部分放在带电的玻璃滑轨上，并在室温下通宵晾干。

在适当的容器中用 1X PBS 清洗幻灯片三次，5 分钟。将幻灯片放在潮湿室内的平面上。使用阻隔笔勾勒出节廓，以保持幻灯片上的液体。

每节移液 200 微升块缓冲液，并在室温下在块缓冲液中孵育两小时。准备原抗体稀释和块缓冲液，通过移液混合良好。轻轻倾斜滑梯以排出块缓冲液，然后返回潮湿的腔室。

将每节的初级抗体溶液移液200微升到幻灯片上，将200微升块缓冲液放到适当的截面上作为控制。在充满去压水的潮湿室内孵育四摄氏度的滑梯，确保密封室的边缘，以帮助保持水分。在 1X PBS 中和适当的容器中清洗幻灯片三次，5 分钟。

在洗涤过程中准备二次抗体稀释和块缓冲液，通过移液混合良好。将幻灯片放在潮湿室的平面上后，每节添加 200 微升的二次抗体溶液。在黑暗中室温下在二次抗体溶液中孵育幻灯片30分钟。

在适当的容器中用 1X PBS 清洗幻灯片三次，5 分钟。将幻灯片放在平坦表面上后，将核染色溶液添加到每个部分，并孵育10分钟。排出核染色溶液后，使用非硬化荧光安装介质和玻璃盖滑来安装幻灯片。

确保它们保持在黑暗中四摄氏度，直到成像。将滑梯放在带 1X PBS 的单个容器中，并在夜间存放在 4 摄氏度的平面上，同时轻轻鼓动松开盖滑，这样它们就会在搅拌时脱落。确保不要按下盖滑，或尝试手动拆下盖滑，但请等待，直到它们以最小的强制移动脱落。

拆下盖滑后，轻轻将滑轨转移到具有新鲜 1X PBS 的容器中。取出 1X PBS，在室温下用 0.1% 的非离子表面活性剂孵育 1X 三速缓冲盐水中的幻灯片，5 分钟。在室温下将滑梯孵育为3%过氧化氢溶液15分钟。

然后将幻灯片平放，并将块缓冲区放置添加到曲面中明智。轻轻倾斜幻灯片以排出块缓冲区。干燥部分周围的区域，将滑梯平放在潮湿的室内。

将每节200微升原抗体溶液加入幻灯片，并在4摄氏度的湿润室中孵育。轻轻倾斜幻灯片以排出原抗体溶液，并在 1X TBST 中洗涤两次，5 分钟。然后应用准备使用背景减少阻断试剂下降明智的每个部分，并在室温下在湿润室孵育20分钟。

轻轻倾斜幻灯片以排出块缓冲区。小心干燥部分周围的区域，将滑梯平放在潮湿的室内。将准备使用二次抗体溶液应用于每个节滴明智和在室温下在湿润室孵育30分钟。

轻轻倾斜幻灯片以排出二次抗体溶液，并在 1X TBST 中洗涤两次，5 分钟。干燥部分周围的区域后，将幻灯片放在平坦的表面上，并在每个截面中加入 200 微升 HRP 色度基板。当基板已应用于第一个幻灯片并在室温下孵育三分钟时启动计时器。

排出基板溶液。用 1X PBS 在适当的容器中短暂冲洗幻灯片，然后用去压水两次，轻轻搅拌五分钟。将幻灯片放入赤氧林染色溶液中长达 30 秒，并在去压水中清洗三次，每次洗涤 5 分钟，以对抗幻灯片。

在装有斯科特的水龙头水的容器中孵育一分钟，然后在去水中再次洗涤三次，五分钟。通过一系列在去压水和二甲苯在化学罩中稀释的乙醇等级来脱水。从二甲苯上取下幻灯片后，立即添加甲苯基安装介质并放置盖滑。

为了确保盖滑时的成功，重要的是从幻灯片的一侧工作到另一侧，同时缓慢降低盖滑，以防止气泡会遮盖组织。最后，使用复合光显微镜和数码相机以 100 倍的放大倍率对幻灯片进行可视化和成像。这里用于同时检测增殖细胞和供体细胞的特异性抗体，这些细胞被识别和量化，而供体细胞正在积极增殖。

在免疫荧光和免疫组织化学之后，必须生成高质量的图像，以便准确识别单个细胞。图像分析程序用于执行图像叠加。在尝试此程序时，最重要的是在免疫histo化学过程中充分染色和对抗污渍滑动。

此过程后，还可以对原始协议进行其他修改，例如使用不同的抗体组合、组织类型或物种。图像也可以以多种方式进行分析，以获得相关数据。这项技术使我们能够将联合定位和多种遗传背景视为研究细胞与细胞相互作用的一种方式，并可以与其他需要详细共定位分析的技术类似地应用。

免疫基础化学中的许多试剂是危险的，应进行相应的处理。使用乙醇、二甲苯和安装刚性时，应在发动机罩中执行。民建联废物应作为危险废物处置，而民建联洗涤后应漂白。