FITC 标记白蛋白静脉滴注对神经退行性疾病模型血脑屏障通透性的评价

该程序的总体目标是通过颈内注射 FITC 标记的白蛋白来评估退行性疾病小鼠模型中的脑血屏障通透性。这种方法可以帮助回答大脑稳态研究中的关键问题。研究血脑屏障损伤与神经退行性变之间的任何可能联系可能特别有用。

该技术的主要优点是作快速简便，也可以应用于大型动物模型和其他神经病理学环境。演示颈静脉内注射 FITC-蛋白的外科手术将是 Luca Capocci。Salvatore Castaldo 将演示大脑的组织学切片。

Enrico Amico 将演示显微照片采集程序。首先制备 FITC-蛋白溶液，将 FITC-蛋白粉末以 10 毫克/毫升的磷酸盐缓冲盐水溶解。布置高压灭菌的手术器械。

用 70% 乙醇清洁手术台，并放置手术无菌一次性窗帘。然后设置作中的体视显微镜。在用适当的氯胺酮甲苯噻嗪溶液腹膜内注射麻醉小鼠后，通过轻轻捏住脚趾并确保没有撤退反射来监测动物镇静。

将麻醉的小鼠面朝上仰卧位，并用胶带将四条腿和尾巴固定在手术工作台上。固定小鼠后，小心地刮掉颈部适当的手术边缘，并用 70% 乙醇中的聚维酮碘溶液消毒。用棉签擦干裸露的刨光表面。

接下来，在锁骨中线做一个 1.5 厘米长的纵向切口后，从胸部中部开始，一直延伸到颈部下方，在显微镜观察下用镊子小心地将结缔组织分开，露出颈外静脉。确保颈静脉右侧和左侧有足够的空间，以方便插入 30 号半规格的针头以输注 FITC-蛋白溶液。在三分钟内将 100 微升每毫升 10 毫克的 FITC 蛋白注射到右颈静脉中。

这是手术过程中最关键的一步。针头插入不正确会导致静脉壁不可逆的损伤并影响整个实验。注射后 15 分钟，通过斩首对小鼠实施安乐死后，迅速从颅骨中取出大脑，并将其浸入一定体积的预冷异戊烷中，这是大脑的十倍，持续 15 分钟。

将异戊烷冷冻的脑移入预冷的试管中，并将其储存在 80 摄氏度的冰箱中，直至组织学切片。在低温恒温器切片之前，将冷冻的大脑包埋在最佳切割温度化合物中。用低温恒温器将大脑切成 20 微米厚的切片，然后将它们安装在显微镜载玻片上。

如前所述，使用特异性抗层粘连蛋白抗体进行 FITC-白蛋白层粘连蛋白共染色。用含有 DAPI 的封固剂盖住载玻片，并将载玻片在 4 摄氏度下在黑暗中干燥过夜。第二天，在配备 FITC 和 Cy3 滤光片的荧光显微镜下以 20 倍放大倍数观察荧光染色。

使用前约 10 分钟打开荧光灯。打开显微镜、连接的计算机和数码相机。运行图像分析软件。

使用适当的物镜实现最佳信号采集和空间分辨率，并选择合适的滤波器。每个脑切片至少获取四次 24 位颜色曝光。使用免费提供的 ImageJ 软件分析每个单个通道的荧光强度。

以下脑冷冻切片的代表性荧光显微照片显示了绿色荧光白蛋白在生理和病理条件下的差异分布。此处显示的红色染色代表在生理条件和血脑屏障受损条件下的血管标志物层粘连蛋白。这些合并图像显示了绿色荧光白蛋白和层粘连蛋白的共定位，以及完整和受损血脑屏障中细胞核的 DAPI 染色。

该图显示了 FITC 白蛋白发出的绿色荧光的定量结果，在健康和受损条件下均报告为绿色荧光强度。在尝试此程序时，重要的是要记住新鲜制备每种试剂并放置手术台。看完这个视频后，你可能对如何通过测量绿色荧光白蛋白对脑实质的附着来评估神经退行性疾病动物模型中血脑屏障的通透性有了很好的了解。