Name: 用荧光标记示踪剂对小鼠血脑屏障通透性的体内检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学习使用荧光示踪剂检测小鼠血脑屏障通透性的体内方法，通过腹腔注射和荧光定量分析评估神经血管功能障碍。该技术为中风和阿尔茨海默病等神经系统疾病的诊断与治疗研究提供了可靠的实验手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨此感谢由Leduq基金会资助的Sphingonet联盟对本工作的支持。本工作还得到了合作研究中心&#34;血管分化与重塑&#34;（CRC/Transregio23，项目C1）以及第七框架计划COFUND项目Goethe国际博士后计划GO-IN（资助编号：291776）的资助。我们进一步感谢Kathleen Sommer在小鼠操作和基因分型方面的技术协助。

所有动物均在操作过程中得到精心照料，以最大限度减少疼痛或不适。本操作遵循本机构的动物护理指南，并已获得当地委员会批准（达姆施塔特政府委员会，批准号：FK/1044）。
工作步骤示意图 体内 小鼠通透性检测如图所示 图1各步骤的详细信息如下所述。
1. 动物操作
<ol>
	<li>示踪剂和麻醉剂的准备与给药
	<ol>
		<li>在通透性检测前至少一天准备好用于组织包埋的标记管和模具。整个实验过程中均需保持无菌条件，操作应在洁净通风橱内进行，并使用经80%乙醇清洁的工具。本实验方案使用3至6月龄的成年野生型（WT）或血管生成素-2（Ang-2）功能获得型（GOF）CD1小鼠，性别不限。小鼠基因型鉴定方法参照先前文献10。&#160; 
		注意：80%酒精不能实现器械灭菌，但可最大程度减少所制备样本的污染。</li>
		<li>将所有示踪剂用无菌PBS稀释为2 mM的储备液，并分装后避光保存于-20 °C。</li>
		<li>选择激发/发射光谱不同且可与赖氨酸交联固定的示踪剂，例如（四甲基罗丹明）TMR和（异硫氰酸荧光素）FITC，以确保在通透性检测中，无论是使用荧光显微镜（分别采用TMR或FITC滤光片）还是酶标仪进行荧光测定，两种染料之间均产生最小干扰。 
		注意：本研究中使用的TMR葡聚糖（3 kD）和FITC葡聚糖（3 kD）均可与赖氨酸交联固定，因此也可用于醛类固定后的免疫组织化学分析，以研究区域差异。</li>
		<li>所有动物操作均应严格遵循机构动物护理指南。每只小鼠腹腔注射100 µL示踪剂溶液；若联合使用两种示踪剂，则可将总体积增至200 µL，每种示踪剂各100 µL，按1:1混合10,13。至少另设一只小鼠仅注射PBS作为假手术对照，用于扣除自发荧光背景。</li>
		<li>注射示踪剂5分钟后，通过腹腔注射给予氯胺酮和赛拉嗪进行麻醉（剂量分别为每公斤体重100 mg和5–10 mg，溶于0.9%生理盐水中，每25 g小鼠注射150 µL混合液）。 
		注意：由于麻醉至灌注/处死的时间较短（约10分钟），期间未观察到眼部干燥现象，因此操作过程中未使用兽用眼膏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采血与心脏灌注
	<ol>
		<li>在给予麻醉剂10分钟后，准备进行心脏灌注。通过检查足垫无抽搐反应，确认动物已达到外科麻醉深度。</li>
		<li>将动物仰卧固定，并用80%乙醇擦拭腹部皮肤。使用小剪刀在肋弓下方做一小切口（约2 cm），切开腹壁。将肝脏与膈肌分离，然后缓慢剪开膈肌，暴露胸膜腔15。</li>
		<li>双侧剪开肋骨，固定剪开的胸骨以暴露左心室。将连接至蠕动灌注系统的21号蝶形针插入左心室后部。</li>
		<li>穿刺右心耳，并在10秒内迅速使用1 mL移液器吸头（末端切除）收集流入胸腔的200–300 µL血液至血清采集管中，立即置于冰上保存。&#160; 
		注意：该灌注操作为非存活性操作。</li>
		<li>血液采集完成后立即启动灌注系统（转速10–12 rpm，流速5 mL/min），用室温（RT）的1×PBS（不含Ca2+/Mg2+离子）灌注动物3分钟。 
		注意：含Ca2+/Mg2+离子的PBS可用于维持灌注期间更好的心脏活动。灌注所用PBS总量约为15–20 mL。</li>
		<li>通过观察肝脏和肾脏的颜色评估灌注质量，灌注充分时器官应呈白色或苍白。 
		注意：肾脏或肝脏的良好灌注并不一定代表脑组织也得到充分灌注，因为从主动脉发出通往脑部的动脉（颈动脉/椎动脉）可能在步骤3的操作过程中（尤其是穿刺心房时）发生破裂。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织处理
<ol>
	<li>器官采集与保存
	<ol>
		<li>灌流结束时，确认动物死亡&#160;通过颈椎脱位处死动物，取脑和肾脏。通过观察脑组织颜色验证脑灌注效果（脑膜血管中无可见血液），若灌注质量不佳，则排除该动物用于通透性分析。使用解剖刀将脑组织分为两个半脑图1).</li>
		<li>用手术刀分离出一个不含嗅球和小脑的半脑，并将半脑转移至一个2 mL离心管中。如需进行小脑通透性评估，可将半小脑存放在另一个离心管中。</li>
		<li>将一个肾脏转移至另一个2 mL离心管中。立即将样品置于干冰上保存。</li>
		<li>将剩余的肾脏和半侧脑组织（包含小脑和嗅球）在干冰上用组织冷冻包埋剂（O.C.T.）进行原位包埋。</li>
		<li>最后，将保存在冰上的血清采集管中的血液样品在4 °C条件下以10,000 g离心10分钟。将血清上清液转移至1.5 mL离心管中，并放入干冰容器中。</li>
		<li>将所有在干冰上收集的样品转移至 -80 °C 超低温冰箱中保存，直至后续处理。 
		注意：在进行匀浆步骤之前，必须先将样品冷冻，因为冻融后匀浆效率会提高。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>匀浆与离心
	<ol>
		<li>将保存在 -80 °C 的半脑和肾脏样本置于冰上解冻，称量含有器官的离心管重量。从该重量中减去多个空管（约 20 个）的平均重量，得到组织重量。向含有肾脏的离心管中加入 300 µL 冷的 1X PBS，向含有半脑的离心管中加入 200 µL 冷的 1X PBS。 
		注意：对于组织量较少的情况（如半个小脑，低于100 mg），建议称量各个离心管的重量。</li>
		<li>在原始的微量离心管中，使用连接电动顶置式搅拌器（1,000 rpm）的聚四氟乙烯（PTFE）研杵，对每个样品进行约15次研磨（1次研磨 = 上下各1次）以实现匀浆。在处理不同样品之间，用PBS冲洗研杵，并擦干后再进行下一个样品的处理。 
		注意：由于洗涤剂可能干扰荧光测定，因此在匀浆过程中避免使用。然而，本方案中仍可检测到细胞内示踪剂，因为组织经过充分匀浆处理，且经历一次冻融循环后匀浆效率更高。</li>
		<li>将匀浆后的样品置于冰上避光保存，最后在台式离心机中于4 °C、15,000 g离心20分钟。将上清液转移至预冷的1.5 mL离心管中，置于冰上立即进行荧光测定，或于-80 °C保存以备后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光测量与定量分析
	<ol>
		<li>若上一步骤结束后已冷冻，则将保存在 -80 ˚C 的组织上清液和血清样品置于冰上解冻，并用铝箔包裹避光。</li>
		<li>将50 µL稀释后的血清（30 µL 1x PBS + 20 µL血清）或组织上清液（直接使用）加入384孔黑色板中。血清和组织上清液均应至少包含一个假手术动物的样本，以确保正确进行背景扣除，因为组织匀浆的背景值通常高于用作稀释液的PBS。 
		注意：可使用平均3只假手术动物进行自发荧光对照，尽管假手术组的自发荧光值变异极小（数据未显示）。可通过将血清用PBS稀释来减少血清使用量，这还能提高荧光信号较低样本（如脑组织样本）的信噪比。已测试将最多10 µL血清与40 µL PBS混合稀释。确保孔板中无气泡存在。</li>
		<li>将384孔黑色板插入酶标仪，打开新脚本并选择荧光检测。</li>
		<li>将增益调至最佳，分别使用TMR或FITC染料的激发/发射波长（nm）550/580或490/520，并开始测量以获取原始荧光单位（RFUs）。</li>
		<li>使用酶标仪的原始荧光单位（RFUs）减去相应的假手术组数值后，计算通透性指数（PI）。
		<ol>
			<li>通透性指数 (mL/g) =（组织 RFUs/g 组织重量）/（血清 RFUs/mL 血清）</li>
		</ol>
		</li>
		<li>动物GOF1脑渗透指数（PI）的计算示例表1):
		<ol>
			<li>GOF1 脑组织 RFUs - 假手术组脑组织 RFUs = 154 - 22.5 = 131.5</li>
			<li>GOF1 血清 RFUs - 假手术组血清 RFUs = 38305 - 27 = 38278</li>
			<li>脑重量（g）= 0.195</li>
			<li>血清体积（ml）= 0.02</li>
			<li>脑渗透指数（10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352 
			注意：通透性指数的计算结果为绝对值，可在不同实验和组织类型之间进行比较。然而，为便于两组间的比较，这些值也可表示为比值。 12这可以通过将每组中每个动物的PI值除以对照组的平均PI值来实现，从而使对照组的平均值归一为1，同时保留对照组内个体间的变异。该转换可提供实验组（或各实验组）相对于设为1的对照组的相对值。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>示踪剂的免疫荧光可视化
	<ol>
		<li>将步骤2.1中以O.C.T.包埋剂（Tissue-Tek）原位包埋的肾脏/半脑组织块置于-20 °C的冷冻切片机中切成10 µm切片，并转移至室温放置的载玻片上。待切片干燥后（约30分钟），将载玻片转移至-80 °C超低温冰箱中保存备用。</li>
		<li>染色当天，将切片在 37 °C 下解冻 10 分钟，然后在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定 10 分钟，随后用 PBS 快速洗涤。</li>
		<li>在室温下将切片置于由含1% BSA和0.5% Triton X-100、pH 7.5的无菌PBS配制的通透/封闭缓冲液中孵育1小时。</li>
		<li>室温下用CD31一抗（0.5 mg/ml，克隆号MEC 13.3）孵育载玻片1.5小时，一抗按1:100比例稀释于含无菌PBS、0.5% BSA、0.25% Triton X-100（pH 7.2）的缓冲液中，随后用PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>在上述缓冲液中，使用种属特异性的荧光标记二抗（按1:500稀释，终浓度为2 mg/mL），室温孵育1小时。针对CD31，可使用山羊抗大鼠Alexa 568或Alexa 488抗体，稀释比例为1:500。在二抗混合液中加入DAPI（终浓度300 µM，按1:1,000从原液稀释），用于细胞核染色。</li>
		<li>使用Aqua-Poly/Mount封片剂封片，并在室温避光条件下静置过夜以完成聚合。</li>
		<li>使用光谱成像共聚焦激光扫描显微镜系统采集图像。采用 NIS elements 软件（版本 4.3）进行图像分析。可使用 Photoshop 等软件制作拼接图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16371949">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26590417">Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier.</a> Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).</li>
<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li>
<li>Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT-1+glucose+transporters+in+the+blood-brain+barrier%3A+differential+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation.</a> Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).</li>
<li>Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+blood-brain+barrier+to+blood-brain+interface%3A+new+opportunities+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+pathways+to+neurodegeneration+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).</li>
<li>Paganetti, P., Antoniello, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+efflux+of+amyloid-%CE%B2+peptides+through+the+blood-brain+barrier+by+muscarinic+acetylcholine+receptor+inhibition+reduces+pathological+phenotypes+in+mouse+models+of+brain+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).</li>
<li>Devraj, K., Poznanovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BACE-1+is+expressed+in+the+blood-brain+barrier+endothelium+and+is+upregulated+in+a+murine+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cerebral+blood+flow+and+metabolism%3A+official+journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).</li>
<li>Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease.</a> Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).</li>
<li>Gurnik, S., Devraj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2-induced+blood-brain+barrier+compromise+and+increased+stroke+size+are+rescued+by+VE-PTP-dependent+restoration+of+Tie2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling.</a> Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).</li>
<li>Scholz, A., Harter, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-derived+angiopoietin-2+is+a+therapeutic+target+in+treatment-naive+and+bevacizumab-resistant+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).</li>
<li>Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoside+diphosphate+kinase+B+regulates+angiogenic+responses+in+the+endothelium+via+caveolae+formation+and+c-Src-mediated+caveolin-1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cerebral+blood+flow+and+metabolism%3A+official+journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).</li>
<li>Ziegler, N., Awwad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Catenin+Is+Required+for+Endothelial+Cyp1b1+Regulation+Influencing+Metabolic+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).</li>
<li>Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+sphingolipid+metabolism+as+a+putative+mechanism+underlying+LPS-induced+BBB+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption.</a> Journal of Neurochemistry. , (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+Low+Molecular+Weight+Fluorescein+Isothiocyanate+%28FITC%29-Dextrans+to+Assess+Blood-Brain+Barrier+Disruption%3A+Technical+Considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+stroke+research%22%5BJournal%5D)">High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations.</a> Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).</li>
<li>Armulik, A., Genové, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li>
<li>Banks, W. A., Gray, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+blood-brain+barrier+disruption%3A+roles+of+cyclooxygenase%2C+oxidative+stress%2C+neuroinflammation%2C+and+elements+of+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 223(2015).</li>
<li>Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+claudins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Structure and function of claudins.</a> Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).</li>
<li>Johansson, B. B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-4-431-67899-1_5">Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx.</a> Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).</li>
<li>Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/22/1_Supplement/734.1.short">Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules.</a> The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).</li>
<li>Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Fc+receptor+mediates+internalization+of+Fc+in+transfected+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).</li>
<li>Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-pore+model+describes+transport+properties+of+bovine+retinal+endothelial+cells+in+normal+and+elevated+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).</li>
<li>Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+endothelial+cell+surface+marker+is+suppressed+during+differentiation+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

血脑屏障功能障碍与多种神经系统疾病相关，包括原发性和继发性脑肿瘤以及脑卒中。血脑屏障的破坏常伴随危及生命的中枢神经系统水肿。因此，阐明触发血脑屏障开放或关闭的分子机制，对于神经系统疾病的治疗具有重要意义，并被研究人员广泛探究。然而，用于研究血脑屏障通透性的方法 体内 文献中报道的方法常伴随技术难题，这些难题通常与繁琐且依赖主观判断的荧光图像定量分析有关17,18,19此外，一些方法包含全脑荧光成像，这种方法具有误导性，因为它更多反映的是表层脑血管的通透性，而这些血管并未形成紧密的屏障结构。即使基于客观脑组织吸光度进行定量分析（如伊文思蓝通透性评估），动物通常未进行灌流，导致因残留大量血液成分而产生错误解读。脑组织重量是另一个常未纳入通透性计算的变量，但必须予以考虑，因为血管通透性引发的水肿可增加脑重量，从而影响净通透性的判断。此外，性别差异以及个体间脑重量的自然变异可能掩盖真实的通透性差异。放射性示踪剂如 14C...

血脑屏障（BBB）由微血管内皮细胞（ECs）构成，这些细胞由紧密相关的周细胞（PCs）支持，并被基底膜包裹，星形胶质细胞（ACs）则以其终足包绕基底膜1,2。ECs 与多种支持和调节屏障功能的细胞相互作用，主要是 ACs 和 PCs，同时也包括神经元和小胶质细胞，这些细胞共同构成了神经血管单元（NVU）。NVU 对 BBB 的功能至关重要，它限制了血液中的毒素和病原体进入脑组织。这一功能主要依赖于 ECs 之间存在的紧密连接分子，如 claudin-5、occludin 和 zonula occludens-1，以及外排转运蛋白（如 P-糖蛋白，P-gp）的作用，后者可将进入内皮细胞的分子重新泵回血管腔1,2,3。然而，BBB 也允许葡萄糖、铁、氨基酸等必需营养物质通过 EC 质膜上表达的特异性转运体进行转运1,2,3。EC 层在腔面（朝向血液）和基底外侧膜（朝向脑组织）之间各种转运体的分布具有高度极性，从而实现特异性和定向的物质转运功能4,5。尽管 BBB 在严格调控中枢神经系统（CNS）微环境方面具有保护作用，但它也为帕金森病等疾病中具有功能完整 BBB 的 CNS 药物递送带来了重大挑战。即使在存在 BBB 功能障碍的神经系统疾病中，也不能假设脑部药物递送必然增加，因为屏障功能障碍可能涉及特定转运体靶点的损伤，例如阿尔茨海默病（AD）中的情况。在 AD 中，多个淀粉样蛋白 β 转运体（如 LRP1、RAGE、P-gp）已被证实发生功能失调，因此靶向这些转运体可能无效6,7,8。BBB 在多种神经系统疾病中受损，包括脑卒中、AD、脑膜炎、多发性硬化症以及脑肿瘤9,10,11。恢复屏障功能是治疗策略的关键组成部分，因此对其功能的评估至关重要。
在本研究中，我们描述了一种用于啮齿类动物通透性检测的客观且定量的实验方案，并已成功应用于多种转基因小鼠品系及实验性疾病模型。10,12,13,14该方法基于向小鼠腹腔内注射荧光示踪剂，随后进行灌流以清除血管腔内的示踪剂。灌流后收集脑组织及其他器官，通过酶标仪检测组织匀浆的荧光强度，并据此计算客观且绝对的通透性指数来评估通透性。所有原始荧光值均使用未注射示踪剂的假手术动物的组织匀浆或血清进行背景校正。通过多种归一化处理，包括血清体积、血清荧光强度以及组织重量的校正，从而获得可在不同实验和不同组织类型之间进行比较的绝对通透性指数。为便于组间比较，可将绝对通透性指数值直接转换为比值，如我们此前所采用的方法。12同时，可利用保存的半脑和肾脏通过荧光显微镜进行示踪剂的可视化观察10经典的荧光显微镜技术可用于获取通透性区域差异的信息，尽管其因需主观选择组织切片和图像进行半定量分析而显得繁琐。本方案中提供了详细的实验步骤，并在适当位置添加了备注，为成功实施该方法提供了必要的信息。 体内 小鼠通透性检测方法，可推广至其他小型动物。该检测可适用于多种示踪剂，通过结合具有不同荧光光谱的示踪剂，实现基于电荷和分子大小的通透性评估。

<table><tbody><tr><td>四甲基罗丹明（TMR）葡聚糖 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3308</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素（FITC）葡聚糖 3kD</td><td>Thermosfisher</td><td>D3306</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（Ketavet）</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Rompun）</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% 生理盐水</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>组织基质包埋剂（O.C.T. compound）</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛溶液</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td>配制 4% 溶液</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗 CD31 抗体，克隆株 MEC 13.3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 Alexa 568</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11077</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 Alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/Mount 封片剂</td><td>Polyscience Inc</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>21 号蝶形针</td><td>BD</td><td>387455</td><td></td></tr><tr><td>血清采集管</td><td>Sarstedt</td><td>41.1500.005</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech 精密擦拭纸</td><td>Kimberley-Clark Professional</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>384 孔黑色板</td><td>Greiner</td><td>781086</td><td></td></tr><tr><td>超粘附载玻片（Superfrost Plus）</td><td>Thermoscientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯研杵</td><td>Wheaton</td><td>358029</td><td></td></tr><tr><td>电动顶置式搅拌器</td><td>VWR</td><td>VWR VOS 14</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 550</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1 光谱成像共聚焦激光扫描显微镜系统</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕动灌注系统</td><td>BVK Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr></tbody></table>

一个 在体 内 利用荧光标记示踪剂检测小鼠血脑屏障通透性实验

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

血脑屏障（BBB）是一种特化的屏障，可保护脑微环境免受循环中毒素和病原体的侵害，并维持脑内稳态。该屏障的主要结构基础是脑毛细血管的内皮细胞，其屏障功能源于细胞间紧密连接以及细胞膜上表达的外排转运蛋白。这一功能由周细胞和星形胶质细胞共同调控，它们与内皮细胞一起构成神经血管单元（NVU）。多种神经系统疾病，如脑卒中、阿尔茨海默病（AD）和脑肿瘤，均与血脑屏障功能受损相关。因此，评估血脑屏障通透性对于判断神经系统疾病的严重程度以及所采用治疗策略的效果至关重要。
本文介绍一种简单且稳健的通透性检测方法，该方法已成功应用于多种遗传性和实验性小鼠模型。与常用的显微镜荧光示踪分析相比，本方法具有高度的定量性和客观性。具体方法为：向小鼠腹腔注射混合的水溶性惰性荧光示踪剂，随后将小鼠麻醉。在采集脑、肾或其他器官之前，对动物进行心脏灌注。采集的器官经匀浆、离心处理后，测定上清液中的荧光强度。在灌注前通过心脏穿刺采集的血液用于对血管腔室进行归一化校正。通过将组织荧光信号归一化至组织湿重，并将血清荧光信号进行相应处理，从而获得定量的示踪剂通透性指数。为进一步验证结果，可利用对侧半脑组织（保存用于免疫组织化学）进行示踪剂荧光的可视化观察。

我们最近发现，在健康状态下，血管生成素-2（Ang-2）功能获得性（GOF）小鼠的脑血管通透性高于对照组小鼠10在脑卒中诱导的小鼠模型中，研究同样显示，GOF 小鼠的梗死体积更大，血脑屏障通透性更高，相较于对照组同窝小鼠。这些结果表明，血管生成素-2（Ang-2）在血脑屏障通透性调控中具有关键作用。因此，本实验方案采用 GOF 小鼠，并与对照组同窝小鼠进行比较，以描述相关机制 体内 通透性检测。然而，该方法也可应用于任何可改变血脑屏障通透性的疾病模型、转基因小鼠模型或药物处理，正如我们此前所做的那样 10,11,12,13.
建议用于...

本文介绍了一种利用腹腔注射荧光示踪剂并结合灌注技术的小鼠脑血管通透性检测方法，适用于血脑屏障功能障碍的动物模型。一侧半脑用于通透性的定量评估，另一侧用于示踪剂的可视化或免疫染色。该实验流程可在10只小鼠中于5至6小时内完成。

血脑屏障（BBB）是一种特化的屏障，可保护脑微环境免受循环中毒素和病原体的侵害，并维持……

本实验的总体目标是利用荧光标记示踪剂评估小鼠脑血管的通透性，以检测动物模型中血脑屏障功能障碍。该方法有助于回答血脑屏障领域中的关键问题，涉及疾病状态下的神经血管通透性及其在治疗后的恢复情况。该方法的主要优势在于操作简便且可定量分析。该方法提供了通过定量荧光光度法以及用于区域屏障评估的荧光显微镜技术同步评估通透性的可能性。该技术的应用前景涵盖多种神经系统疾病的诊断与治疗，包括脑肿瘤、脑卒中和阿尔茨海默病，因为这些疾病均与危及生命的脑水肿相关，而改善血脑屏障（BBD）功能被视为关键的治疗靶点。实验操作部分将由研究所的科研技术专员Jadranka Macas女士进行演示。向小鼠腹腔注射100微升2毫摩尔的示踪剂溶液。选择可与赖氨酸结合的示踪剂，例如FITC和TMR标记的葡聚糖，其激发-发射光谱应具有明显差异，以最大程度减少染料间的相互干扰。若联合使用多种示踪剂，应向小鼠腹腔注射200微升混合示踪剂溶液。进行仅含载体的注射，以作为自发荧光背景扣除的假手术对照。每次注射后，根据批准的机构方案，在对小鼠实施深度麻醉前等待五分钟。在给予麻醉剂10分钟后，准备对动物进行心脏灌注。检查小鼠是否无足部抽动反应，以确保其已达到手术麻醉水平。将待灌注的小鼠仰卧放置，并在腹部皮肤上涂抹80%乙醇。使用小剪刀在腹壁上剪开一个两厘米的切口后，将肝脏与膈肌分离，然后缓慢剪开膈肌，暴露胸膜腔。沿两侧剪开肋骨，并固定切开的胸骨以暴露左心室。将连接至蠕动灌注系统的21号蝶形针插入左心室后部。穿刺右心房，然后使用剪去末端的1毫升移液器吸头迅速收集释放出的200至300微升血液，并转移至血清采集管中。将采集的血液置于冰上保存。血液采集后，立即开启灌注系统，用室温的无钙镁离子 PBS 对动物灌注三分钟。通过观察肝脏和肾脏的颜色来评估灌注质量，灌注后器官应呈现苍白外观。取出脑组织后，应确认脑膜血管中无可见血液。若灌注质量不佳，则应将该样本排除在通透性分析之外。使用手术刀将脑组织分离为两个半脑。然后从一侧半脑中分离出小脑和嗅叶，并将半侧大脑转移到一个2毫升的离心管中。将一个收获的肾脏放入另一个2毫升的离心管中。立即将样品置于干冰上。将剩余的肾脏和半脑（包含完整的小脑和嗅球）原位包埋于TissueTech最佳切割温度化合物中，并置于干冰上。最后，将血液样本在4摄氏度条件下以10,000 ×g离心10分钟，转移血清上清液至1.5毫升离心管中，并将其放入干冰容器内。随后将样品转移至-80摄氏度冰箱中，因为冻融后组织匀浆效率会提高。将半脑和肾脏样本置于冰上解冻，然后称量装有器官的离心管重量。从这些重量中减去约20个空管的平均重量，得到组织重量。向装有肾脏的离心管中加入300微升冷PBS，向装有半脑的离心管中加入200微升冷PBS。使用连接在电动搅拌器上的聚四氟乙烯（PTFE）研杵，对每个样品在原始微量离心管中进行匀浆，约15次。将匀浆后的样品置于冰上保存，并避光。在处理下一个样品前，用PBS冲洗研杵，并擦干。所有样品均完成匀浆后，在 15,000 G 和 4 摄氏度条件下离心 20 分钟。离心结束后立即将上清液转移至预冷的 1.5 毫升离心管中，并置于冰上，随后进行荧光检测与定量分析。将上清液转移至 384 孔板中，随后将板插入荧光检测仪。 确保包含示踪剂的正确激发和发射波长，并将增益设置为最佳状态。开始测量，并将数据导出为电子表格，按照方案中所述进行计算。染色当天，在载玻片上将10微米的冷冻切片于37摄氏度解冻10分钟。然后，在室温下用 4% 多聚甲醛固定切片 10 分钟，随后用 PBS 快速洗涤。在室温下，将切片置于含有 1% PSA 和 0.5% Triton X-100 的无菌 PBS 中孵育 1 小时，以进行通透处理并阻断非特异性结合。阻断后，将切片与 1:100 稀释的 CD31 一抗在室温下孵育 1.5 小时。用 PBS 每次五分钟，洗涤三次后，在室温下用物种特异性的荧光标记二抗孵育一小时。用 Aqua-Poly/Mount 封片剂封片，并在室温避光条件下过夜聚合。最后，使用光谱成像共聚焦激光扫描显微镜系统采集图像。为了确定通透性检测中示踪剂的循环时间，将示踪剂注射后长达两小时的长循环时间与15分钟的短循环时间进行比较。与15分钟的短循环时间相比，两小时的长循环时间导致肾脏中示踪剂的积累量较低，这可能是由于血管腔室中绿色显示的FITC葡聚糖被快速清除所致。在脑组织中，由于血脑屏障紧密，这一效应更为显著。红色通道中观察到的 CD31 染色证实了在所检测的两个时间点，肾脏和脑组织中均存在血管。一旦掌握该技术，两名科研人员协同操作，可在五到六小时内完成 10 只小鼠的实验。在尝试该技术时，重要的是要牢记选择具有合适分子量、电荷及荧光特性的示踪剂，以回答有关血脑屏障通透性的问题。完成此操作后，还可采用其他方法，如针对BBD及疾病相关因子的免疫组织化学染色，以回答更多问题，例如疾病部位的严重程度和定位。

an-vivo-blood-brain-barrier-permeability-assay-mice-using

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

用荧光标记示踪剂对小鼠血脑屏障通透性的体内检测

本视频介绍了一种利用荧光素钠分子评估体外血脑屏障通透性的通透性检测方法。...

血脑屏障模拟物通透性检测：一种用于评估示踪分子在血脑屏障模拟物中通透性的体外检测方法

本视频演示了在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中评估血脑屏障破坏的实验方法。通过眼眶后注射不同分子量的荧光染料，使其在脑部血管中循环。较小分子量的染料可渗漏进入脑组织，而较大分子量的染料仅在血脑屏障严重受损时才能进入，从而反映屏障损伤的程度。...

利用荧光染料检测实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中血脑屏障的破坏

本研究的目的是验证一种方法的可重复性 体外...

建立一个 体外 大鼠血脑屏障（BBB）模型：重点关注BBB的不可渗透性与受体介导的转运

体外荧光素异硫氰酸酯标记的载药铁蛋白穿过大鼠血脑屏障的渗透性研究：一种用于纳米制剂分子递送研究的模型

本研究中，我们介绍了一种在神经退行性条件下评估血脑屏障破坏的简便高效方法。为实现研究目标，我们将高分子量的异硫氰酸荧光素标记（FITC）-白蛋白注入小鼠颈静脉，并通过荧光显微镜观察其向脑实质的渗漏情况。...

神经退行性疾病小鼠模型中通过静脉输注FITC标记白蛋白评估血脑屏障通透性

本文介绍了在体内实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中研究神经血管单元功能障碍的实验方案。我们重点阐述了如何测定血脑屏障通透性以及与白细胞穿越胶质界膜相关的明胶酶活性。...

在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

药物靶向中枢神经系统肿瘤是一项重大挑战。本文介绍了一种利用小鼠和/或人类细胞构建体外血脑肿瘤屏障模型的实验方案，并探讨了该模型在预测体内中枢神经系统肿瘤靶向性方面的相关性。...

利用培养皿中的血-脑肿瘤屏障预测体内载荷递送效果

在本实验方案中，通过向测试动物模型的面静脉注射不同分子量的荧光示踪剂，评估下颌下腺（SMG）的内皮屏障功能。 体内...

体内 小鼠下颌下腺血管通透性检测

在本研究中，向小鼠给予荧光素异硫氰酸酯标记的（FITC）葡聚糖 通过 口服灌胃以评估肠道通透性 体内...

利用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖评估小鼠肠道屏障完整性

通过在不同时间点向小鼠注射两种荧光染料，建立了一种可视化血脑屏障（BBB）破坏所致染料外渗的方法。使用甘油作为冷冻保护剂，有助于在同一组织样本上进行免疫组织化学染色。...

轻度创伤性脑损伤小鼠模型中血脑屏障破坏的评估

本方案介绍了一种利用伊文思蓝染料评估成年斑马鱼（Danio...

可视化血脑屏障守门人：基于伊文思蓝染料的成年斑马鱼血脑屏障通透性评估

学习使用荧光示踪剂检测小鼠血脑屏障通透性的体内方法，通过腹腔注射和荧光定量分析评估神经血管功能障碍。该技术为中风和阿尔茨海默病等神经系统疾病的诊断与治疗研究提供了可靠的实验手段。

一个在体内利用荧光标记示踪剂检测小鼠血脑屏障通透性实验

探索更多视频

一个 在体 内 利用荧光标记示踪剂检测小鼠血脑屏障通透性实验

探索更多视频

一个在体内利用荧光标记示踪剂检测小鼠血脑屏障通透性实验