Interactome: Domainome 图书馆建设、噬菌体展示和下一代测序的验证与选择协议

该方法有助于回答基于蛋白质的研究中的关键问题，如新蛋白质或蛋白质域的注释、已知蛋白质的结构和功能特性的表征、不同条件下蛋白质相互作用网络的定义或抗原抗体特征。该技术的主要优点是，它是完全不偏不倚的，高吞吐量和模块化的任何类型的研究范围从单个基因到全基因组。域库的构建对于函数研究非常有用。

它可以转移到噬菌体显示环境中，并用于针对不同的靶点（如结合蛋白或纯化抗体）进行选择。与 NGS 的耦合可实现极其敏感和强大的分析。同时，专门开发的 Web 工具对整个域和交互组进行精确描述。

要首先构建 ORF 库，请以 100% 输出的 30 秒脉冲对 DNA 进行声波化。声波化后，将梯子和声波DNA加载到1.5%的加糖凝胶上。然后以每厘米 5 伏特启动电泳单元 15 分钟。

agarose凝胶电泳显示存在DNA涂片确认声波。这与从不受声波化的DNA获得的固体带相比。然后用支离破碎的DNA涂片切割凝胶部分，并使用柱状凝胶提取试剂盒进行净化。

测量紫外分光光度计中纯化DNA的浓度。然后按照制造商的指示，用一微升的快速钝化酶混合物处理五微克的刀片。然后在70摄氏度下灭活酶混合物10分钟。

要准备过滤载体，首先用EcoRV限制酶消化纯化克隆载体的5微克。然后将消化和未消化的载体和分子标记加载到1%的阿加罗斯凝胶上。然后在80摄氏度下加热灭活限制酶20分钟。

接下来，用5个单位磷酸酶酶和1/10体积的10X磷酸酶缓冲液对消化载体进行磷酸化。然后在37摄氏度下孵育混合物15分钟。然后在65摄氏度下灭活磷酸酶5分钟。

接下来，从凝胶中提取质粒并纯化DNA。然后测量紫外分光光度计中DNA的浓度。为了执行结扎反应，将400纳米的磷酸化插入物加入1微克的消化载体，10X T4 DNA结扎酶缓冲液和T4 DNA连结酶加入100微升的最终体积。

然后在16摄氏度下孵育结扎反应过夜。第二天，热在65摄氏度下使利塞灭活10分钟。接下来，在pH5.2和2.5卷100%乙醇下加入1/10体积的三摩尔醋酸钠，沉淀结扎产品。

为了沉淀DNA，混合试剂，在零下80摄氏度下冷冻20分钟。20分钟后，以最高速度在4摄氏度下进行20分钟的离心机。离心后，排出上经剂。

在颗粒上，加入500微升的冷70%乙醇，再离心。在离心结束时丢弃上一液。一旦颗粒风干，将沉淀的DNA溶解在10微升水中。

在进行电穿孔之前，在冰上安排适当数量的微离心管和0.1厘米电穿孔块。然后将纯化结扎产品的微升添加到25微升的细胞中。然后移液DNA，细胞混合物到冷电穿孔库，并轻拂管。

然后擦拭从蛋黄酱外部的水，放在电穿孔单元中并击中脉冲。电穿孔后，快速加入一毫升液体2X YT介质，不给细胞中任何抗生素。然后将细胞混合物转移到10毫升管中。

将管子放在摇床上，在37摄氏度下每分钟220圈，一小时。将库的稀释液镀在 10 厘米 2X YT Agar 板上，并辅以氯霉素、安皮西林和仅氯霉素。这是为了获得由PCR测试的单菌落和执行滴定。

接下来，在15厘米2X YT加糖板上镀上转化的称职细胞，并辅以氯霉素和安皮西林。然后在30摄氏度下孵育板过夜。第二天，计算殖民地选择稀释的地方，他们是可计数的。

然后计算库大小。库大小计算如下，平均菌落数量倍稀释因子倍于库总容量。库大小应按 10 到 6 个克隆的功率。

如果安西林浓度是最佳的，以执行更多的过滤，克隆数量减少到1至20，在没有这种抗生素的情况下获得。要测试阳性菌落，请使用提示拿起大约15至20个单菌落。然后用100微升的2X YT介质稀释菌落，无需抗生素。

接下来，PCR 将0.5微升培养基放大为具有 Taq DNA 聚合酶的 DNA 模板。在 PCR 期间，使用 55 摄氏度的退火温度和 72 摄氏度的 40 秒的延长时间运行 25 个放大周期。检查刀片的长度是否在 150 到 750 基对的预期范围内。

不同的菌落呈现不同尺寸的刀片。这表明在可变性方面，库准备良好。接下来，在150毫米的板中加入三毫升的新鲜2X YT介质来收集细菌。

然后用无菌刮刀收获细菌。彻底混合后，加入20%甘油，在零下80摄氏度的等值中离开，供将来使用。立即使用，在添加甘油之前，执行基于柱的质粒提取试剂盒，从库的一个等分中纯化质粒DNA。

测量紫外分光光度计中DNA的浓度，然后在零下20摄氏度储存样品，直到使用。使用库的 2.5 微升作为 PCR 扩增的 DNA 模板。设置热循环器条件并开始运行。

接下来，使用索引 PCR 套件执行索引 PCR。这将对多路复用的 Illumina 运行中的双索引库进行排序。然后设置热循环器条件并开始运行。

使用 AMPure XP 珠子纯化后，验证尺寸，运行一个微升的一至 10 稀释的最终库上的生物分析器。然后通过选择最终库跟踪区域进行量化。这些原理图表示，克隆到P过滤载体后，只有与 ORF 对应的菌落在抗生素存在的情况下产生功能性β-乳酸酶。

筛选后，克隆数将减少 20 倍。随着良好的文件夹 ORF 在更高的抗生素浓度下增长。此外，ORF 片段可以轻松地从筛选的库中恢复。

构建一个噬菌体 ORF 库，以针对目标蛋白质或抗体进行噬菌体显示选择。然后，NGS 对获得的所有库和输出进行深入分析。NGS 提供有关每个选定片段的库多样性、丰度和精确映射的完整信息。

最后，开发的交互组寻求webtool生成原始测序读取，范围从基因组注释的生成域列表。观看此视频后，您应该对如何从所需的 DNA 源构建和验证域域库有一个很好的了解。并通过下一代测序对库进行高吞吐量筛选。

我们利用 Illumina 平台优化了 ORF 过滤库的排序，并开发了一种 Webtool，无需任何编程技能即可分析此类数据。